小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白g10613的基因克隆與生物信息學(xué)分析

郭志浩，高利，劉琦

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點實驗室）

小麥矮 腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）所引發(fā)的小麥矮腥黑穗病是一個主要的國際檢疫性病害，其對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。這種真菌可以通過種子、土壤及空氣等傳播并且可以在土壤中生活很多年，一旦被引入就很難被根除[2]。

本研究利用小麥矮腥黑粉菌基因組數(shù)據(jù)克隆出小麥矮腥黑粉菌的一個效應(yīng)蛋白基因g10613，對該蛋白基因進(jìn)行克隆以及生物信息學(xué)進(jìn)行分析，為小麥矮腥黑粉菌的后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：小麥矮腥黑粉菌菌株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥類真菌病害研究組儲藏供應(yīng)。

供試試劑：2×Taq 酶、2×Phanta酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。卡那霉素、Kanamycin sulfate（Biosharp）、質(zhì)粒提取檢測試劑盒買于北京天根生物技術(shù)有限公司，凝膠材料純化回收檢測試劑盒買于北京天根生物技術(shù)有限公司。其他試劑盒為實驗室常用試劑盒。試驗于2021年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥類真菌病害研究組實驗室進(jìn)行。

主要儀器設(shè)備：FastPrep -96高通量快速樣品制備儀（美國MP Biomedicals公司）、PCR儀（美國賽默飛世爾技術(shù)有限公司（Thermo Fisher Scientific））、離心機(jī)（德國eppendrof生命科學(xué)公司）、高壓滅菌鍋（美國zealway公司）、GHB-202恒溫金屬浴（浙江博日技術(shù)公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白基因的克隆

取培養(yǎng)基中的各階段TCK，按試劑盒說明書方法提取RNA。再利用試劑盒將RNA合成cDNA。根據(jù)TCK基因組設(shè)計的引物數(shù)據(jù)設(shè)計全長序列引物g10613-F，g10613-R；以TCK的cDNA為模板進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括：cDNA模板1 μL，2 × 酶12.5 μL，引物g10613-F 1 μL，引物g10613-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL等，共25 μL。

擴(kuò)增程序為：98 ℃30 s，（98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃10 s）×35個循環(huán)，72 ℃1 min。采用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，跑出符合預(yù)計長度的目的片段。將目的片段用切膠處理，送到北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測。

1.2.2 生物信息學(xué)分析軟件

運(yùn)用ProtParam軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，TMHMMServerv.2.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測其跨膜區(qū)，運(yùn)用NCBI 中的Conserved Domains 軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析其結(jié)構(gòu)域，使用SOPMA軟件（https：//npsaprabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl? page=%20npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析，用Swiss-Model軟 件（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)建模[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥矮腥黑粉菌基因g10613的克隆

用引物g10613-F和g10613-R（表1）擴(kuò)增出約330 kb的目的基因片段。將PCR 凝膠產(chǎn)物回收，測序后獲得330 bp長度的序列，如圖1所示。

圖1 基因g10613的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 效應(yīng)蛋白g10613的保守結(jié)構(gòu)域分析

對g10613基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，g10613基因長度為330 bp，共編碼了109個氨基酸，它沒有明顯的家族結(jié)構(gòu)特征。

2.2.2 效應(yīng)蛋白g10613理化性質(zhì)分析

效應(yīng)蛋白g10613的相對分子質(zhì)量為11 723.80，相對理論等電點PI為9.06，說明了蛋白質(zhì)的偏堿。蛋白質(zhì)的總分子式是C504H826N142O150S14，分子數(shù)量是1 636。而氨基酸總數(shù)則是109個，其中其中Ala（A）8 個（7.3%）、Arg（R）3 個（2.8%）、Asn（N）6 個（5.5%）、Asp（D）6個（5.5%）、Cys（C）10個（9.2%）、Gln（Q）2個（1.8%）、Glu（E）3個（2.8%）、Gly（G）11個（10.1%）、His（H）0個（0%）、Ile（I）5個（4.6%）、Leu（L）6個（5.5%）、Lys（K）14個（12.8%）、Met（M）4個（3.7%）、Phe（F）2個（1.8%）、Pro（P）6個（5.5%）、Ser（S）4 個（3.7%）、Thr（T）8 個（7.3%）、Trp（W）2 個（1.8%）、Tyr（Y）2個（1.8%）、Val（V）7個（6.4%）。Asp和Glu的總數(shù)即負(fù)電性殘體總數(shù)為9個，而Arg和Lys的總量即正電荷殘體總數(shù)為17個。g10613蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)是29.78，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為65.32，而總平均親水性則為-0.252。預(yù)測該蛋白質(zhì)的半衰期將是：在哺乳動物的網(wǎng)織紅血球中超過30 h，在酵母中超過20 h，以及在大腸桿菌感染中超過10 h。

分析該蛋白的親疏水性，最疏水性數(shù)值是3.433，而最親水?dāng)?shù)值則為-2.844。如圖2所顯示，在g10613效應(yīng)蛋白中親水的氨基酸數(shù)量更多，是偏親水蛋白質(zhì)。

圖2 效應(yīng)蛋白g10613的親疏水性圖

2.2.3 效應(yīng)蛋白g10613信號肽分析

效應(yīng)蛋白g10613信號肽分析，切割位點C的最高值為0.851，位于第22位氨基酸；信號肽分?jǐn)?shù)S的最高值為0.939，位于第2位氨基酸；合并后切割位點的Y最高值約為0.867，位于22位氨基酸。S平均值為0.811，所預(yù)測的切割位點約在1～21位氨基酸之間。如圖3所示。

圖3 效應(yīng)蛋白g10613信號肽預(yù)測

2.2.4 效應(yīng)蛋白g10613跨膜區(qū)分析

效應(yīng)蛋白g10613跨膜區(qū)分析，通過對跨膜區(qū)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在效應(yīng)蛋白g10613的全部109個氨基酸中，存在一個跨膜區(qū)，處于0～23氨基酸的位置，如圖4所顯示。

圖4 效應(yīng)蛋白g10613的跨膜區(qū)預(yù)測

2.2.5 效應(yīng)蛋白g10613二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

效應(yīng)蛋白g10613二次結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，二次結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該氨基酸具有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲。其中，有44個氨基酸形成α-螺旋占40.37%，7個氨基酸形成延伸鏈，占6.42%；5個氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角，占4.59%；53個氨基酸形成不規(guī)則卷曲，占百分之46.82%，如圖5所顯示。

圖5 效應(yīng)蛋白g10613的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.6 效應(yīng)蛋白g10613三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SwissModel 軟件，對效應(yīng)蛋白g10613三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，如圖6。

圖6 效應(yīng)蛋白g10613的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

小麥矮腥黑粉菌所導(dǎo)致的小麥矮腥黑穗病，在其通常流行的年份的發(fā)病率與發(fā)病率下降的速度大致相同。這種真菌所引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要小麥類病害，在國際上這種真菌病害也具有相當(dāng)?shù)挠绊懥?。?dāng)環(huán)境條件適宜，有大量的感病植株時，可造成50%的產(chǎn)量損失，有的嚴(yán)重病害地塊產(chǎn)量損失高達(dá)80%[5]，甚至滅絕。但即便如此，我們對小麥矮腥黑粉菌的發(fā)病機(jī)制仍然缺乏系統(tǒng)深入地了解。

病原菌在侵染植物時，在與寄主細(xì)胞的相互作用的同時，會分泌許多蛋白，這些分泌蛋白被稱為“效應(yīng)蛋白”。研究表明，許多已經(jīng)被確認(rèn)的病原菌分泌蛋白質(zhì)所存在的典型特點是：具有遠(yuǎn)端信號肽序列，該序列可以引導(dǎo)蛋白質(zhì)完成跨膜運(yùn)動，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外。

由于效應(yīng)蛋白是病原菌侵染植物時的重要武器，在病原菌感染植物的整個過程中起著重要的作用，因此對小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白的研究有助于闡明小麥矮腥黑穗病與小麥矮腥黑粉菌之間的互作機(jī)理。

本文成功克隆出小麥矮腥黑粉菌編碼效應(yīng)蛋白的g10613基因，并對該效應(yīng)蛋白基因進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析，但該效應(yīng)蛋白的作用機(jī)制尚未清楚。本研究為下一步研究小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白的功能，深入分析基因g10613及編碼的效應(yīng)蛋白在小麥矮腥黑粉菌中的具體功能，以及其影響小麥植物體的方式的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。