外源6-BA調(diào)控孕穗期低溫后小麥幼穗發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析

李凌雨 周琦銳 李 洋 張安民 王貝貝 馬尚宇 樊永惠 黃正來(lái)張文靜

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 安徽合肥 230036

由于極端天氣的頻繁發(fā)生, 低溫脅迫已成為制約小麥(Triticum aestivumL.)生產(chǎn)的主要災(zāi)害之一。低溫會(huì)造成小麥的產(chǎn)量下降, 其中以孕穗期低溫對(duì)小麥產(chǎn)量的影響最為直接, 此時(shí)小麥正處于關(guān)鍵生育時(shí)期, 對(duì)低溫非常敏感[1], 幼穗是否能夠發(fā)育良好直接決定了小麥最終產(chǎn)量的高低[2]。目前已有研究表明, 孕穗期低溫脅迫后外源噴施6-BA能有效緩解低溫對(duì)小麥的傷害[3], 但其相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制仍不明確。因此探究6-BA調(diào)控孕穗期低溫后小麥幼穗發(fā)育的分子機(jī)制, 可為探索減輕春季低溫對(duì)小麥傷害的栽培措施提供理論基礎(chǔ)。

低溫脅迫下, 植物內(nèi)部會(huì)發(fā)生多種響應(yīng)途徑以適應(yīng)環(huán)境和自我保護(hù), 如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、內(nèi)源激素水平的調(diào)節(jié)等[4]。低溫脅迫會(huì)影響小麥正常生長(zhǎng)發(fā)育, 施用外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能在一定程度上提高植物抗寒性, 而6-BA作為一種在植物生理反應(yīng)中具有多種功能的細(xì)胞分裂素,在調(diào)控小麥等多種植物的抗逆性方面都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5-7]。目前有研究表明, 6-BA能顯著改善低溫引起的植株生長(zhǎng)不良和葉綠素含量的下降, 調(diào)節(jié)小麥內(nèi)源激素水平變化, 提高抗氧化酶活性, 促進(jìn)籽粒灌漿, 提高小麥產(chǎn)量[8-10]。另有研究表明, 使用6-BA還可顯著提高碳水化合物含量(蔗糖、己糖和淀粉)[11-12]。Wang等[13]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 使用6-BA后白菜葉片中有大量差異基因富集于抗氧化物質(zhì)合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和呼吸代謝等過(guò)程。干旱脅迫下外源硫化氫(H2S)能夠提高小麥抗旱性, Li等[14]研究發(fā)現(xiàn),H2S減輕干旱傷害可能與運(yùn)輸系統(tǒng)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)加工、脂肪酸和氨基酸代謝等途徑有關(guān)。

目前針對(duì)6-BA影響小麥抗寒性的研究主要集中于葉片生理活性和產(chǎn)量的變化, 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探究其分子調(diào)控機(jī)制的研究仍比較匱乏。本研究選用低溫敏感性不同的小麥品種, 于孕穗期低溫處理后噴施6-BA, 通過(guò)對(duì)小麥幼穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 明確外源6-BA緩解低溫對(duì)小麥幼穗傷害的調(diào)控途徑及重要調(diào)控基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用的小麥品種為對(duì)低溫敏感型小麥品種皖麥52 (安徽省宿州市種子公司選育)和遲鈍型小麥品種煙農(nóng)19 (山東省煙臺(tái)市)農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所選育)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2020年11月至2021年6月于安徽省合肥市安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地農(nóng)萃園進(jìn)行(31.52°N、117.17°E)。試驗(yàn)點(diǎn)屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū), 年平均降水量約900～1000 mm, 年平均氣溫約15～16℃。試驗(yàn)地土壤有機(jī)質(zhì)含量為15.16 g kg-1, 全氮含量為0.86 g kg-1, 速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為149.61、22.31和101.67 mg kg-1。采用盆栽的栽培方式, 每個(gè)盆高30 cm, 直徑30 cm, 盆底開(kāi)6個(gè)排水孔。每盆裝9 kg篩過(guò)的土壤(取自田間0～20 cm的耕作層), 將盆埋入試驗(yàn)田, 盆內(nèi)土壤與地面齊平,每盆添加有機(jī)肥(微生物菌劑, 有機(jī)質(zhì)含量≥80%)45 g, 復(fù)合肥7 g (N∶P∶K=15∶15∶15), 尿素4.57 g(含氮量46%), 拔節(jié)期追施尿素2.28 g。于2020年11月5日進(jìn)行播種, 先覆沙土0.6 kg, 播種后再覆沙土0.9 kg, 齊苗后, 間苗至每盆10株。其他田間管理措施均按高產(chǎn)栽培要求進(jìn)行。

于小麥孕穗期(2021年3月18日)將盆栽移入人工氣候室進(jìn)行低溫處理。人工氣候室18:00—06:00溫度設(shè)定為-2℃, 06:00—18:00溫度設(shè)置為5℃, 氣候室相對(duì)濕度設(shè)置為70%, 連續(xù)處理24 h。處理結(jié)束后將盆栽移回大田, 于次日上午10:00, 根據(jù)前期試驗(yàn)選擇噴施濃度為20 mg L-1的6-BA溶液至葉片正反兩面均有一層小水珠欲滴落為止, 以噴施等量蒸餾水的同品種小麥作為對(duì)照, 24 h后取樣。樣品經(jīng)液氮速凍后, 用于總RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 可溶性糖及淀粉含量測(cè)定

外源6-BA處理10 d后取小麥幼穗, 105℃殺青0.5 h, 80℃烘干至恒重后粉碎并過(guò)100目篩, 稱取0.1 g樣品至10 mL離心管, 加入8 mL配制的80%乙醇溶液80℃水浴30 min, 冷卻后離心, 重復(fù)3次,合并上清液用于測(cè)定可溶性糖, 殘?jiān)糜跍y(cè)定淀粉,采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖和淀粉含量[15]。

1.4 RNA-seq測(cè)序及差異表達(dá)基因篩選

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成, 構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后, 使用Illumina HiSeq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic[16]軟件進(jìn)行質(zhì)控并去除接頭, 得到高質(zhì)量的clean reads。利用HISAT2[17]將clean reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。使用Cufflinks軟件計(jì)算每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的fragments (FPKM值), 以對(duì)轉(zhuǎn)錄本或基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量[18-19]。使用DESeq (2012) R軟件檢測(cè)差異表達(dá)基因, 將P-value ＜ 0.05且差異倍數(shù)Fold Change ＞ 2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 差異基因注釋和功能富集分析

對(duì)樣品間篩選出的差異基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)合GO注釋結(jié)果對(duì)差異基因功能進(jìn)行描述, 并用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算每個(gè)GO條目中差異基因富集的顯著性。利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析, 并用超幾何分布檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)Pathway條目中差異基因富集的顯著性, 以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。

1.6 差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證

以小麥GAPDH基因作為內(nèi)參基因, 選擇差異基因ARF5、AGPL1、SWEET15為待驗(yàn)證基因, 主要功能涉及生長(zhǎng)素、淀粉合成和糖轉(zhuǎn)運(yùn)。特異性引物序列見(jiàn)表1。用SYBR Green染料進(jìn)行qRT-PCR, 重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算, 得出樣本間表達(dá)量差異倍數(shù)關(guān)系。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物Table 1 Primers for qRT-PCR used in this study

1.7 數(shù)據(jù)處理

幼穗生理數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析, 用Origin 2017進(jìn)行作圖。韋恩圖、聚類熱圖由在線軟件制作(https://cloud.oebiotech.com/task/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼穗形態(tài)

如圖1所示, 外源噴施6-BA溶液10 d后, 煙農(nóng)19和皖麥52幼穗形態(tài)都出現(xiàn)了明顯的變化。與對(duì)照相比, 6-BA處理后的小麥幼穗生長(zhǎng)狀態(tài)更好, 穗形更加飽滿, 穗長(zhǎng)也優(yōu)于對(duì)照。

圖1 外源6-BA處理后幼穗表型變化Fig. 1 Phenotypic changes of young spike after exogenous 6-BA treatmentWanmai 52 CK為皖麥52低溫處理后噴施清水; Wanmai 526-BA為皖麥52低溫處理后噴施6-BA溶液; Yannong 19 CK為煙農(nóng)19低溫處理后噴施清水; Yannong 196-BA為煙農(nóng)19低溫處理后噴施6-BA溶液。Wanmai 52 CK is Wanmai 52 sprayed with water after low temperature treatment; Wanmai 526-BA is Wanmai 52 sprayed with 6-BA solution after low temperature treatment; Yannong 19 CK is Yannong 19 sprayed with water after low temperature treatment;Yannong 19 CK is Yannong 19 sprayed with 6-BA solution after low temperature treatment.

2.2 幼穗可溶性糖含量和淀粉含量

與對(duì)照相比, 外源6-BA處理10 d后小麥幼穗中可溶性糖含量顯著上升, 皖麥52與對(duì)照相比上升5.34%, 煙農(nóng)19與對(duì)照相比上升9.55% (圖2)。與對(duì)照相比, 低溫脅迫后噴施6-BA小麥的淀粉含量也隨之上升, 皖麥52與對(duì)照相比上升7.17%, 煙農(nóng)19與對(duì)照相比上升10.50%。低溫脅迫下植株為了增強(qiáng)對(duì)脅迫的適應(yīng)性保護(hù)自身, 需要消耗更多的糖及其他能量載體, 噴施6-BA后糖及淀粉含量增加有利于增強(qiáng)植株對(duì)低溫脅迫的抵抗能力。

圖2 幼穗可溶性糖含量及淀粉含量Fig. 2 Soluble sugar and starch content in young spikes

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

測(cè)序共獲得79.75G的Clean Data。Q30的堿基分布均超過(guò)94.90%。每個(gè)樣本中reads與小麥參考基因組的比對(duì)率為94.52%～97.10%。樣品間相關(guān)性檢驗(yàn)表明, 重復(fù)樣品間的相關(guān)系數(shù)均超過(guò)0.99, 生物重復(fù)一致性極高。

皖麥52共檢測(cè)出差異基因22,770個(gè), 其中有8080個(gè)基因表達(dá)上調(diào), 14,690個(gè)基因表達(dá)下調(diào); 煙農(nóng)19檢測(cè)出差異基因9866個(gè), 其中有4991個(gè)基因表達(dá)上調(diào), 4875個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。根據(jù)韋恩分析可知, 有661個(gè)差異基因在兩小麥品種中均上調(diào), 1220個(gè)差異基因均下調(diào)。

2.4 差異表達(dá)基因的GO注釋與富集

圖3 差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig. 3 Venn plots of differently expressed genes (DEGs)

對(duì)識(shí)別出的差異基因進(jìn)行GO功能注釋, 將其分為3個(gè)主要功能類別:分子功能、細(xì)胞組分和生物過(guò)程。在兩類基因型小麥品種中, GO富集在生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能中的項(xiàng)數(shù)均為23、20和21。將兩個(gè)品種差異基因富集最多的20個(gè)GO條目進(jìn)行整合, 發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種表現(xiàn)出了相似的富集趨勢(shì),差異基因富集最多的20個(gè)GO條目中有17條都相同(表2), 除了對(duì)刺激和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性的反應(yīng),其他過(guò)程可能在小麥響應(yīng)外源6-BA緩解低溫脅迫傷害的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中大量差異基因被富集于細(xì)胞組分分類, 包括膜的有機(jī)成分(GO:0016021)、細(xì)胞膜(GO:0016020)和細(xì)胞核(GO:0005634), 另有大量基因參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(GO:0055085), 說(shuō)明低溫處理后噴施6-BA小麥內(nèi)部細(xì)胞膜透性可能發(fā)生變化。

表2 低溫脅迫后噴施外源6-BA差異表達(dá)基因的GO注釋Table 2 GO annotation of DEGs after spraying 6-BA under low temperature stress

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集

根據(jù)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)展通路富集分析。結(jié)果表明, 皖麥52的差異基因被成功富集到199條KEGG通路上,其中有80個(gè)通路顯著富集。煙農(nóng)19的差異基因被成功共富集187條KEGG通路上, 其中有56個(gè)通路顯著富集。

通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn), 兩個(gè)品種在差異基因富集前20的通路中有10條相同的生理代謝途徑(圖4)。值的注意的是, 低溫脅迫下噴施6-BA后, 低溫敏感型和遲鈍型品種中都顯著富集了谷胱甘肽代謝、細(xì)胞色素P450、苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝等有關(guān)抗氧化的代謝途徑。另外還在淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝途徑顯著富集。表明低溫脅迫后噴施外源6-BA, 抗氧化代謝、糖代謝、植物激素調(diào)節(jié)及滲透調(diào)節(jié)等可能增加植物抗寒性、緩解低溫造成的傷害。

圖4 KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig. 4 Scatter diagram of KEGG pathway enrichment

淀粉和蔗糖代謝途徑(ko00500)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(ko04075)在兩基因型小麥品種中都排在差異基因富集前20的通路中。皖麥52中激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑含有87條相關(guān)上調(diào)基因, 煙農(nóng)19中含有96條相關(guān)上調(diào)基因。其中相同的差異基因有兩條TraesCS4A02G207600、TraesCS4D02G014900, 都與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān), 間接影響細(xì)胞增大和植物生長(zhǎng)(圖5)。淀粉和蔗糖代謝途徑在皖麥52中含有89條相關(guān)上調(diào)基因, 煙農(nóng)19中含有77條相關(guān)上調(diào)基因。其中兩個(gè)品種的共有差異基因有 4條,TraesCS5D02G484500、TraesCS7D02G451800、TraesCS2D02G381000、TraesCS6B02G031300, 主要涉及淀粉、果糖和葡萄糖的合成(圖6)。

圖5 IAA信號(hào)通路基因表達(dá)模式分析Fig. 5 Analysis of gene expression pattern in IAA signaling pathway紅藍(lán)色塊代表相應(yīng)的FPKM數(shù)值, 數(shù)值越大, 顏色越紅; 從左到右樣本依次為皖麥52 CK、皖麥526-BA、煙農(nóng)19 CK、煙農(nóng)196-BA。The color lump represents the corresponding FPKM value, and the higher the value, the redder the color. The samples from left to right are Wanmai 52 CK, Wanmai 526-BA, Yannong 19 CK, and Yannong 196-BA.

圖6 糖類物質(zhì)積累相關(guān)基因表達(dá)模式分析Fig. 6 Analysis of the expression pattern of carbohydrate accumulation related genes色塊所知內(nèi)容同圖5。The contents of the colors are the same as those given in Fig. 5.

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的可靠性, 選擇3個(gè)在低溫處理后噴施6-BA差異表達(dá)的基因, 用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證(圖7)。結(jié)果表明選取的目的基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致, 均表現(xiàn)為上調(diào)。證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是真實(shí)可靠的。

圖7 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 7 Verification of the differentially expressed genes by qRT-PCR

3 討論

3.1 差異表達(dá)基因分析

孕穗期低溫會(huì)嚴(yán)重影響植株正常生長(zhǎng)發(fā)育并降低小麥產(chǎn)量, 前人研究表明, 低溫脅迫后噴施6-BA能緩解低溫對(duì)小麥產(chǎn)量造成的不利影響[3]。低溫脅迫下小麥對(duì)6-BA的響應(yīng)是通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的, 而轉(zhuǎn)錄組分析則能夠明晰這些調(diào)控機(jī)制。本研究對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果表明兩基因型小麥品種的處理與對(duì)照之間均存在大量的差異基因, 正是這些上調(diào)或下調(diào)基因?qū)е绿幚砼c對(duì)照之間的差異表現(xiàn)。對(duì)兩組RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的韋恩分析, 確定了相關(guān)的候選基因, 外源6-BA處理后這些基因在低溫敏感性不同的兩種小麥中均顯著上調(diào)。PMEI8和CCR1在上調(diào)基因中反復(fù)出現(xiàn)且高度顯著, 這兩個(gè)基因在維持細(xì)胞壁完整和對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中均起著重要作用[20-23]。ARF5的表達(dá)在本試驗(yàn)中差異性顯著, 生長(zhǎng)素反應(yīng)因子(ARF)是一類轉(zhuǎn)錄因子, 可作為介導(dǎo)生長(zhǎng)素基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[24]。因此外源6-BA可能通過(guò)激活A(yù)RF5轉(zhuǎn)錄, 啟動(dòng)了生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 從而促進(jìn)低溫脅迫后小麥的生長(zhǎng)發(fā)育, 這可能是外源6-BA處理后小麥幼穗的穗形穗長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照的原因之一。同時(shí)韋恩分析顯示, 兩類小麥中與碳水化合物代謝相關(guān)的基因AGPL1、1-SST、SWEET15等也在上調(diào)基因當(dāng)中。AGPL1在小麥籽粒淀粉合成中扮演重要角色, 其表達(dá)量與腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的活性呈顯著正相關(guān), 而AGPase的活性又與籽粒內(nèi)淀粉積累速率呈顯著正相關(guān)[25-26], 有研究表明, 禾本科作物的AGPL1基因過(guò)表達(dá)可顯著提高植株的AGPase活性與淀粉含量, 從而增加粒重與產(chǎn)量[27-28]。通過(guò)測(cè)定小麥幼穗的淀粉含量可知,噴施6-BA后兩基因型小麥品種的淀粉含量均顯著上升, 而AGPL1的顯著上調(diào)很有可能就是引起幼穗中淀粉含量上升的原因。1-SST基因可誘導(dǎo)果聚糖合成, 果聚糖的積累可提高植物的抗寒性, 并且通過(guò)穩(wěn)定植物膜系統(tǒng)使其免受低溫脅迫的傷害[29-30]。已有研究證明SWEET15在低溫脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá), 起到滲透調(diào)節(jié)的作用[31]。同時(shí), Chen等[32]證明SWEET15和SWEET12、SWEET11的三重突變體種子表現(xiàn)為嚴(yán)重的缺陷, 包括粒重降低、淀粉和脂質(zhì)含量下降以及種皮褶皺。

通過(guò)GO富集可知兩類基因型小麥品種差異基因的功能都主要富集于細(xì)胞膜透性、結(jié)合作用、氧化還原過(guò)程、碳水化合物代謝、催化活性, 這些可能是小麥響應(yīng)外源6-BA調(diào)控植株抗寒性、緩解低溫傷害的關(guān)鍵功能基因。KEGG分析表明, 兩個(gè)品種的差異表達(dá)基因均主要參與抗氧化代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、滲透調(diào)節(jié)等途徑。Zhao等[33]對(duì)低溫脅迫后的小麥植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析, 明確了滲透調(diào)節(jié)、碳水化合物代謝和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑對(duì)低溫脅迫的響應(yīng), 結(jié)合本試驗(yàn)說(shuō)明6-BA在低溫脅迫下可能會(huì)通過(guò)加強(qiáng)小麥體內(nèi)的生理生化反應(yīng)來(lái)提高小麥的抗寒性。兩小麥品種在6-BA的作用下基本采用相似的響應(yīng)途徑來(lái)緩解低溫脅迫造成的損傷, 這些途徑主要與抗氧化、滲透調(diào)節(jié)、植物激素調(diào)節(jié)和碳水化合物代謝有關(guān)。

3.2 外源6-BA對(duì)幼穗形態(tài)、可溶性糖和淀粉含量及相關(guān)途徑的影響

研究發(fā)現(xiàn)噴施6-BA后小麥幼穗的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)更好, 穗形飽滿, 穗長(zhǎng)增加(圖1), 幼穗可溶性糖含量和淀粉含量均有提高。幼穗和小花的發(fā)育與植株內(nèi)部能否提供充足的碳水化合物直接相關(guān), 幼穗中可溶性糖能為小花的發(fā)育提供能量, 在小花分化發(fā)育期增加穗可溶性糖含量, 有利于促進(jìn)小花發(fā)育為籽粒[34]。同時(shí), 有研究表明。淀粉總是向生長(zhǎng)發(fā)育迅速的器官積累, 而淀粉含量低的小穗在逆境中易停止發(fā)育轉(zhuǎn)向退化[35]。因此, 幼穗中可溶性糖和淀粉含量的增加能促進(jìn)小花發(fā)育和籽粒形成, 而外源6-BA處理后幼穗中可溶性糖和淀粉含量的增加可能是6-BA能緩解低溫對(duì)小麥產(chǎn)量影響的原因。通過(guò)KEGG富集可知, 低溫敏感性不同的兩類小麥的差異基因均顯著富集于IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和淀粉和蔗糖代謝途徑。生長(zhǎng)素作為一類內(nèi)源激素在植物的整個(gè)生命周期中都起重要作用, 植物能夠快速感知和響應(yīng)生長(zhǎng)素水平的變化。AUX1屬于AUX1/LAX家族, 主要負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素向細(xì)胞內(nèi)的輸入[36]。生長(zhǎng)素上調(diào)小RNA (SAUR)家族是對(duì)生長(zhǎng)素反應(yīng)最迅速和最強(qiáng)烈的一類基因, 在植物體內(nèi)起著較為關(guān)鍵的作用[37]。KEGG富集結(jié)果表明兩類小麥的上調(diào)差異基因都富集于IAA信號(hào)通路的AUX1和SAUR。說(shuō)明6-BA可能通過(guò)加強(qiáng)小麥內(nèi)部的IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)小麥遭遇低溫后的生長(zhǎng)發(fā)育, 這也可能是噴施6-BA后小麥幼穗穗形更飽滿, 穗長(zhǎng)更長(zhǎng)的原因。淀粉和蔗糖代謝途徑(ko00500)涉及許多復(fù)雜的通路,本研究中, 兩類小麥有四個(gè)相同的上調(diào)差異基因富集到淀粉和蔗糖代謝途徑, TraesCS5D02G484500、TraesCS7D02G451800、TraesCS2D02G381000、TraesCS6B02G031300, 分別涉及果糖、葡萄糖和淀粉的合成。這些基因表達(dá)上調(diào), 促進(jìn)糖類物質(zhì)的合成, 而植物在低溫脅迫下為了增強(qiáng)對(duì)低溫的適應(yīng)性,需要消耗更多的糖和其他能量載體來(lái)產(chǎn)生脂質(zhì)、氨基酸等, 進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞膜流動(dòng)性和結(jié)構(gòu)重排[38-39],因此糖類物質(zhì)的增加有利于增強(qiáng)植物對(duì)低溫的適應(yīng)性。外源6-BA可能通過(guò)調(diào)控淀粉和蔗糖代謝途徑來(lái)促進(jìn)小麥內(nèi)部糖類物質(zhì)的合成以提高小麥抗寒性、促進(jìn)小花發(fā)育和籽粒形成。

本研究發(fā)現(xiàn)孕穗期低溫脅迫后噴施6-BA溶液,低溫敏感型和遲鈍型小麥幼穗的穗形都更飽滿、穗長(zhǎng)更長(zhǎng), 且幼穗可溶性糖含量和淀粉含量均有所增加。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 外源6-BA處理后, 兩類小麥的上調(diào)差異基因均顯著富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和淀粉和蔗糖代謝途徑, 具體涉及IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和果糖、葡萄糖及淀粉的合成。表明低溫脅迫后6-BA通過(guò)調(diào)控與IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和糖類物質(zhì)合成相關(guān)的基因的表達(dá), 來(lái)調(diào)節(jié)低溫后小麥的生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)可溶性糖和淀粉的合成。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)低溫脅迫下外源6-BA處理后小麥的幼穗表型分析表明, 6-BA可以緩解低溫脅迫造成的負(fù)面效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 6-BA處理可誘導(dǎo)細(xì)胞膜透性、氧化還原及碳水化合物代謝等相關(guān)基因的表達(dá), 通過(guò)調(diào)節(jié)小麥抗氧化物質(zhì)代謝、滲透調(diào)節(jié)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和碳水化合物代謝等途徑來(lái)緩解低溫?fù)p傷、增強(qiáng)小麥抗寒性, qRT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可信。