冠心病病人血清miR-34a、miR-145表達(dá)與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制研究

齊貴彬,高建步,張明磊,張永杰,王 星,彭小荷,董曉雙,李京倡,劉 琳

我國(guó)冠心病的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢(shì),嚴(yán)重威脅居民的生命安全[1]。近年來,雖然冠心病診療技術(shù)得到了快速發(fā)展,但病人預(yù)后并未得到明顯改善,主要與心血管不良事件發(fā)生率未有效降低有關(guān)[2]。目前,臨床仍缺少評(píng)估冠心病病人預(yù)后的指標(biāo),給治療方案的制定帶來困擾。隨著對(duì)微小RNA(miRNAs)在多種疾病中發(fā)生、發(fā)展作用的深入研究,逐漸發(fā)現(xiàn)miRNAs可作為心血管疾病預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]。相關(guān)研究顯示,miR-34a在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá),并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4-5];miR-145低表達(dá)參與胃癌、膀胱癌、宮頸癌、肝癌的發(fā)生與進(jìn)展[6]。研究顯示,miR-34a、miR-145在冠心病病人循環(huán)中存在異常表達(dá),但與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系和相關(guān)機(jī)制仍缺少深入研究[7-8]。因此,本研究探討冠心病病人血清miR-34a、miR-145表達(dá)與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年3月—2019年5月本院收治的冠心病病人60例作為冠心病組,其中,男32例,女28例;年齡47～65(56.79±5.41)歲。另選取健康志愿者60名作為對(duì)照組,其中,男34例,女26例;年齡45～65(56.28±4.95)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,病人及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查,存在1支及以上的主要冠狀動(dòng)脈血管狹窄程度>50%;②能夠正常溝通交流,自愿參與本研究者。排除標(biāo)準(zhǔn):合并惡性腫瘤、感染性疾病、免疫系統(tǒng)功能異常者。

1.3 主要材料與試劑 人血管內(nèi)皮細(xì)胞株購(gòu)于上海研謹(jǐn)生物有限公司;液體樣本總RNA提取試劑盒購(gòu)于上海西寶生物科技有限公司;胎牛血清、無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI)-1640購(gòu)于上海源培生物科技股份公司;miR-34a minics質(zhì)粒、miR-34a inhibitor質(zhì)粒、miR-145 minics質(zhì)粒、miR-145 inhibitor質(zhì)粒均由上海吉瑪公司構(gòu)建;脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;鼠抗人沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)單克隆抗體、鼠抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)單克隆抗體購(gòu)于上海博湖生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 冠狀動(dòng)脈造影檢查和隨訪研究 采用數(shù)字減影血管造影圖像處理系統(tǒng)定量分析冠心病病人的冠狀動(dòng)脈狹窄程度,對(duì)冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果進(jìn)行Gensini評(píng)分,根據(jù)分值差異將冠狀動(dòng)脈狹窄程度分為輕度組(<50分,29例)、中度組(50～90分,19例)、重度組(>90分,12例)。病人出院后采取門診復(fù)查、電話隨訪的方式,記錄1年內(nèi)心血管不良事件發(fā)生情況并分為心血管不良事件組(13例)和非心血管不良事件組(47例)。

1.4.2 標(biāo)本采集與處理 冠心病組病人和對(duì)照組志愿者禁食12 h后,采集次日清晨外周靜脈血4 mL,抗凝處理后,以3 000 r/min離心分離血清,使用總RNA提取試劑盒提取血清總RNA,-80 ℃保存待測(cè)。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞株。

1.4.3.1 miR-34a表達(dá)對(duì)冠狀動(dòng)脈病變程度影響機(jī)制的研究 取其中一部分人血管內(nèi)皮細(xì)胞株用于miR-34a表達(dá)對(duì)冠狀動(dòng)脈病變程度影響機(jī)制的研究,分組如下:①正常對(duì)照組,采用常規(guī)培養(yǎng);②白細(xì)胞介素-6(IL-6)組,使用10 mg/mL的IL-6刺激培養(yǎng)24 h之后常規(guī)培養(yǎng);③空載體轉(zhuǎn)染組、miR-34a低表達(dá)組、miR-34a高表達(dá)組,于實(shí)驗(yàn)前均使用10 mg/mL的IL-6刺激培養(yǎng)24 h后,空載體轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒,miR-34a低表達(dá)組轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor質(zhì)粒,miR-34a高表達(dá)組轉(zhuǎn)染miR-34a minics質(zhì)粒。

1.4.3.2 miR-145表達(dá)對(duì)冠狀動(dòng)脈病變程度影響機(jī)制的研究 取另一部分人血管內(nèi)皮細(xì)胞株用于miR-145表達(dá)對(duì)冠狀動(dòng)脈病變程度影響機(jī)制的研究,分組如下:①正常對(duì)照組,常規(guī)培養(yǎng);②氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)組,使用40 mg/mL的ox-LDL刺激培養(yǎng)24 h后常規(guī)培養(yǎng);③空載體轉(zhuǎn)染組、miR-145低表達(dá)組、miR-145高表達(dá)組于實(shí)驗(yàn)前均使用40 mg/mL的ox-LDL刺激培養(yǎng)24 h后,空載體轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒,miR-145低表達(dá)組轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor質(zhì)粒,miR-145高表達(dá)組轉(zhuǎn)染miR-34a minics質(zhì)粒。

1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè) 使用總TRI試劑盒提取各組血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA,同時(shí)將血漿總RNA取出。采用互補(bǔ)DNA(cDNA)第一鏈合成試劑盒將血漿RNA和各組血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-34a正向引物:5′-CACGAAAGATGAAATACGCGCGC -3′;反向引物:5′-ATGGAGCCTGGGACGTGACCAT -3′;miR-145正向引物:5′-TAAA CGCACAGTAGGAACGATCCAG-3′;反向引物:5′-TAAGCACTTCGCAAGGA TTCGTTCGA -3′;SIRT1正向引物:5′-GGACGATAGGACCTAGTTTTCGG-3′,反向引物:5′-CGGAAGCACTGGTATTCCGGACA-3′;IGF-1R正向引物:5′-GAT TCTGTGACGGTCCCGAGTAG-3′,反向引物:5′-TGAGGTGCTGTGCGTGATGA CGC -3′;β-actin正向引物:5′-AGGGCCCATGAAATTCCGGGC-3′,反向引物:5′-ACATGCATGAAATTCCGGGCG-3′。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系20 μL,包括Premix Ex TaqⅡ 10 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,模板DNA 4 μL,雙蒸餾水4 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性15 s,95 ℃變性10 s,60 ℃復(fù)性30 s,共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)蛋白水平 收集各組血管內(nèi)皮細(xì)胞,使用高效組織細(xì)胞快速裂解液提取總蛋白,蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,取其中5 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,將分離得到的蛋白濕法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,加入封閉用脫脂奶粉,室溫下靜置2 h。洗膜后向正常對(duì)照組、IL-6組、空載體轉(zhuǎn)染組、miR-34a低表達(dá)組、miR-34a高表達(dá)組中加入鼠抗人SIRT1單克隆抗體,1∶500稀釋;鼠抗人β-actin單克隆抗體,1∶1 000稀釋,4 ℃過夜,洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,1∶2 000稀釋。向正常對(duì)照組、ox-LDL組、空載體轉(zhuǎn)染組、miR-145低表達(dá)組、miR-145高表達(dá)組中加入鼠抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)單克隆抗體,1∶1 000稀釋;鼠抗人β-actin單克隆抗體,1∶1 000稀釋,4 ℃過夜,洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,1∶2 000稀釋。上述各組均室溫?fù)u床孵育2 h,化學(xué)發(fā)光法成像,使用Image進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組miR-34a、miR-145水平比較 冠心病組miR-34a表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,miR-145表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組miR-34a、miR-145相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.2 不同冠狀動(dòng)脈病變程度冠心病病人miR-34a、miR-145水平比較 重度組miR-34a水平明顯高于中度組、輕度組,miR-145水平明顯低于中度組、輕度組;中度組miR-34a水平明顯高于輕度組,miR-145水平明顯低于輕度組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 不同冠狀動(dòng)脈病變程度冠心病病人miR-34a、miR-145相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.3 冠心病病人miR-34a、miR-145水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析顯示,miR-34a水平與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.7529,P<0.001);miR-145水平與Gensini評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.750 1,P<0.001)。詳見圖1、圖2。

圖1 冠心病病人miR-34a水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)性

圖2 冠心病病人miR-145水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)性

表3 冠心病病人心血管不良事件發(fā)生情況與miR-34a、miR-145相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系(±s)

2.5 miR-34a對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 IL-6組、空載體轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-34a低表達(dá)組SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于IL-6組、空載體轉(zhuǎn)染組;miR-34a高表達(dá)組SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于IL-6組、空載體轉(zhuǎn)染組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的Western Blot電泳圖

表4 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.6 miR-145對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 ox-LDL組、空載體轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-145低表達(dá)組IGF-1R mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于ox-LDL組、空載體轉(zhuǎn)染組;miR-145高表達(dá)組IGF-1R mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于ox-LDL組、空載體轉(zhuǎn)染組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4、表5。

圖4 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R蛋白表達(dá)的Western Blot電泳圖

表5 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R mRNA及蛋白表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

miRNAs是廣泛存在于自然界中的內(nèi)源性高保守非編碼單鏈RNA,能夠與信使RNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)后介導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄過程,進(jìn)而發(fā)揮靶蛋白調(diào)控作用[9]。心血管疾病中miRNAs表達(dá)異常參與了內(nèi)皮功能及巨噬細(xì)胞功能變化、血管平滑肌細(xì)胞過度增殖等病理過程[10]。miRNAs性質(zhì)穩(wěn)定,在人體內(nèi)、外環(huán)境中均可穩(wěn)定存在,能夠作為冠心病、缺血性腦卒中等心腦血管疾病的標(biāo)志物[11]。本研究結(jié)果顯示,冠心病組miR-34a表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,miR-145表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05),提示miR-145、miR-34a可能參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展,且隨著冠心病病人冠狀動(dòng)脈病變程度的增加,miR-145表達(dá)水平逐漸下降,miR-34a表達(dá)水平逐漸升高,且miR-145表達(dá)水平與Gensini評(píng)分呈負(fù)相關(guān),miR-34a表達(dá)與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)。基礎(chǔ)研究報(bào)道亦顯示,miR-145在小鼠冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊中的表達(dá)水平明顯降低,推測(cè)miR-145表達(dá)水平可能與硬化斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[12]。高脂飼料喂養(yǎng)的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠大動(dòng)脈miR-34a表達(dá)水平明顯升高。提示血漿miR-34a、miR-145水平變化可用于冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的評(píng)估[13]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管平滑肌與外周血液循環(huán)之間的屏障,同時(shí)也具有一定的分泌功能[14];血管內(nèi)皮功能異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的主要因素,其中炎癥反應(yīng)異常是主要機(jī)制[15]。SIRT1分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞核,在成熟組織中廣泛表達(dá),SIRT1作為炎癥反應(yīng)的抑制因子,當(dāng)表達(dá)降低時(shí)會(huì)促進(jìn)促炎因子IL-6、細(xì)胞間黏附分子1、血管細(xì)胞黏附分子1的生成,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示,使用IL-6處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后,細(xì)胞中SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低,下調(diào)miR-34a表達(dá)能夠有效逆轉(zhuǎn)該過程,使得SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高,miR-34a高表達(dá)可能通過降低SIRT1表達(dá)水平,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),加重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度。

IGF-1是一種多肽類激素,參與調(diào)控人體細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程[17]。肝臟是IGF-1的主要合成器官,能夠通過與細(xì)胞表面的IGF-1R特異性結(jié)合后發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用[18]。相關(guān)研究顯示,IGF-1能夠與內(nèi)皮細(xì)胞表面的IGF-1R結(jié)合,提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活性,促進(jìn)一氧化氮的釋放[19]。一氧化氮通過清除氧自由基、擴(kuò)張血管、促進(jìn)鉀離子通道開放等作用,促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù),抑制冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[20]。本研究使用ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞,細(xì)胞中IGF-1R mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高,可能與內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)高脂性損傷的自我保護(hù)機(jī)制有關(guān),高脂損傷的內(nèi)皮細(xì)胞通過提升IGF-1表達(dá),分泌并釋放更多的一氧化氮,抑制冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。miR-145低表達(dá)能夠明顯抑制IGF-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平,阻礙了受損的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù),進(jìn)而促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[21]。

綜上所述,冠心病病人血漿miR-34a表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈病變程度呈正相關(guān),miR-145表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈病變程度呈負(fù)相關(guān)。miR-34a高表達(dá)可能通過降低內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1表達(dá)水平,減弱了SIRT1炎癥抑制作用,進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),加重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度;miR-145低表達(dá)可能通過降低內(nèi)皮細(xì)胞中IGF-1表達(dá)水平,減弱了IGF-1促進(jìn)一氧化氮分泌的作用,加劇高脂性損傷對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響。