苦參堿通過(guò)調(diào)控miR-122對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制

藍(lán)水清,黃桂柳,黃贊松,管愛(ài)星

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西 百色 533000;3. 廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)素有“癌中之王”的稱號(hào),病程短、治療困難、手術(shù)率低[1],是我國(guó)主要的常見(jiàn)惡性腫瘤。由于疾病早期缺乏特定癥狀,大多數(shù)HCC患者直到晚期才被診斷[2-3]。盡管手術(shù)是肝癌治療的最佳選擇之一,但晚期肝癌患者通常不適合手術(shù),全身治療仍然是姑息治療的唯一選擇[4],因此,尋找有效的治療藥物和方法對(duì)降低病死率及延長(zhǎng)壽命至關(guān)重要?？鄥A(苦參堿C15H24N2O)是從苦參根中分離得到的重要四環(huán)喹啉類生物堿之一[5]。研究顯示苦參堿有抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡、抑制肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和惡性細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的作用[6]。有研究證實(shí)HCC的增殖、遷移和侵襲與miRA-122的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[7],而苦參堿可上調(diào)肝癌 HepG2細(xì)胞的MicroRNA-122表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8],因此推測(cè)苦參堿是通過(guò)上調(diào)miR-122調(diào)控肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。但miR-122在HCC中的生物學(xué)作用及靶基因仍未完全明確。本研究選用人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象,以期探討苦參堿通過(guò)作用于miR-122調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及分子機(jī)制,為苦參堿用于HCC的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌HepG2細(xì)胞由右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院鄧益斌博士惠贈(zèng),苦參堿購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(規(guī)格:M109803-1g),胎牛血清(批號(hào):FBSST-01033-500),DMEN高糖培養(yǎng)基(批號(hào):D6429-500ML)、CCK-8(批號(hào):CK04-500T)、TRIzOL(批號(hào):15596-026)、生工miRNA第一鏈 cDNA合成(莖環(huán)法)均購(gòu)自廣西卓一生物技術(shù)有限公司;PTG GAPDH Rabbit Polyclonal Antibody(批號(hào):10494-1-AP)、E-cadherin Rabbit Polyclonal Antibody(批號(hào):20874-1-AP) 、N-Cadherin Rabbit Polyclonal Antibody(批號(hào):22018-1-AP) 、Vimentin Rabbit Polyclonal Antibody(批號(hào):10366-1-AP)均購(gòu)自廣西卓一生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行傳代培養(yǎng),每2～3 d傳代1次,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)不同濃度苦參堿對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,胰酶消化后重懸成細(xì)胞懸液,以細(xì)胞密度為5×104個(gè)/毫升,接種于96孔板中,每孔100 μL細(xì)胞懸液。分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組含不同濃度的苦參堿,陰性對(duì)照組含完培的細(xì)胞懸液,空白組只含完全培養(yǎng)基,不含細(xì)胞及藥物,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄舊培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的苦參堿100 mL,濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL;向陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔分別加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)孵育3 h,在全自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定(OD)值,計(jì)算苦參堿對(duì)HepG2細(xì)胞作用48 h后的抑制率(IR)。選擇半數(shù)抑制率(IC50)的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR(real-time qRT-PCR)檢測(cè)miR-122的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸后以細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔,接種于24孔板中,培養(yǎng)24 h后,棄舊培養(yǎng)基,用PBS清洗兩遍,每孔加入0.5 mL懸浮稀釋的慢病毒(hsa-miR122-5P),同時(shí)以對(duì)照陰性慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞建立對(duì)照組細(xì)胞株(LV3-NC),細(xì)胞常規(guī)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后12 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),如無(wú)明顯毒性作用,約48 h后更換成完全培養(yǎng)基。72 h后可用胰酶消化重懸加入嘌呤霉素(1 mg/L)篩選去除轉(zhuǎn)染差的細(xì)胞,qPCR檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-122表達(dá)變化情況,細(xì)胞熒光高表達(dá)及生長(zhǎng)穩(wěn)定后可繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為4組,miR-122 mimic+苦參組、苦參組、miR-122 mimic組、陰性對(duì)照組,苦參組加入含IC50濃度(經(jīng)計(jì)算為1.0 mg/mL)為苦參堿的完全培養(yǎng)基,其余兩組加入完全培養(yǎng)基,孵育箱培養(yǎng)48 h后,加入Trizol,提取各組細(xì)胞總RNA,待RNA濃度和純度測(cè)定后,反轉(zhuǎn)成cDNA。以cDNA為模板,U6為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。Hsa-minR-122-5P引物序列:上游引物5′-GCGTGGAGTGTGACAATGG-3′,下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,按照預(yù)變性95 ℃,5 min,變性95 ℃,10 s,退火 60 ℃,30 s,40個(gè)循引環(huán)的程序進(jìn)行,使用2-△△Ct法分析結(jié)果。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行消化,并制成單細(xì)胞懸液,每孔取5×105個(gè)/孔細(xì)胞置于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),用200 μL無(wú)菌槍頭垂直于孔板在細(xì)胞表面劃痕,用PBS清洗兩遍,實(shí)驗(yàn)分為4組,miR-122 mimic+苦參組、苦參組、miR-122 mimic組、陰性對(duì)照組,有苦參的組加入含IC50濃度(經(jīng)計(jì)算為1.0 mg/mL)苦參堿的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,其余兩組加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,分別于0 h、48 h在劃痕的同一位置進(jìn)行觀察和拍照,最后用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。計(jì)算公式:劃痕愈合率(%)=(0 h的劃痕面積-48 h的劃痕面積)/0 h的劃痕面積×100%。

1.2.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 從-20 ℃的冰箱中取出matrigel在冰上溶解,用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋(質(zhì)量濃度為1 mg/mL) ,于每孔100 μL matrigel添加到上室中凝成膠狀。實(shí)驗(yàn)分為4組,miR-122 mimic+苦參組、苦參組、miR-122 mimic組、陰性對(duì)照組,調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL的細(xì)胞懸液200 μL加到Transwell小室,下室分別加入含苦參堿及不含苦參堿的完全培養(yǎng)基,48 h后用PBS洗滌小室2次,用多聚甲醛固定15 min,再用結(jié)晶紫染色15 min。在顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照,最后使用ImageJ對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6Western Blot 提取干預(yù)后各組細(xì)胞中總蛋白,用BCA試劑盒對(duì)蛋白裂解產(chǎn)物進(jìn)行定量,SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白裂解物,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,快速封閉液封閉30 min。TBST洗滌3次,每次10 min,PVDF 膜與一抗在4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次,每次10 min,用二抗在室溫下孵育1 h,然后再洗滌3次,每次10 min,最后蛋白顯影及對(duì)蛋白條帶灰度值定量分析。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用單因素分差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1苦參堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 不同濃度苦參堿作用于HepG2細(xì)胞48 h后,苦參堿各濃度組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均有不同程度抑制作用,各濃度組細(xì)胞活力與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)表1。GraphPad Prims 9.0軟件計(jì)算IC50,IC50值為(1.026± 0.138) mg/mL,故選擇苦參堿濃度為1.0 mg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)條件。

表1 不同濃度苦參堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.2miR-122的表達(dá)水平及苦參堿對(duì)miR-122表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,miR-122 mimic+苦參組、苦參組、miR-122 mimic組的相對(duì)表達(dá)量增高,與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖1、表2。

2.3苦參堿對(duì)HepG2遷移和侵襲的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)反應(yīng)細(xì)胞的水平遷移能力,miR-122 mimic+苦參組、苦參組、miR-122 mimic組的劃痕愈合率均小于陰性對(duì)照組(P均<0.001)。Transwell實(shí)驗(yàn)反映細(xì)胞的垂直侵襲能力,miR-122 mimic+苦參組、苦參組、miR-122 mimic組的穿膜細(xì)胞數(shù)均少于陰性對(duì)照組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖2、表3。

圖1 苦參堿對(duì)miR-122表達(dá)的影響

表2 各組miR-122相對(duì)表達(dá)量

注:A.miR-122 mimic+苦參組,B.苦參組,C.miR-122 mimic組,D.陰性對(duì)照組。

表3 各組劃痕愈合率及Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)

2.4Western Blot法 檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)情況,經(jīng)苦參堿過(guò)表達(dá)miR-122干預(yù)后上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)高于陰性對(duì)照組(P<0.001),而N-cadherin表達(dá)低于陰性對(duì)照組(P<0.001),Vimentin表達(dá)低于陰性對(duì)照組(P<0.001),見(jiàn)表4。

表4 苦參堿作用HepG2細(xì)胞后E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白水平變化

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),分別將濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL的苦參堿作用于HepG2細(xì)胞48 h后,各濃度組對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖均有不同程度抑制作用,根據(jù)計(jì)算出的IC50,選擇1 mg/mL濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究條件。劃痕試驗(yàn)及侵襲試驗(yàn)提示苦參堿能抑制肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可以上調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞中的miR-122表達(dá),提高E-cadherin蛋白表達(dá)水平、下調(diào)N-cadherin、 Vimentin蛋白表達(dá)水平。

苦參堿是從經(jīng)典中藥苦參根中分離得到的一種主要生物堿成分[9-10],長(zhǎng)期以來(lái)一直用于抗炎、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面的治療[11]。其中抗腫瘤作用具有良好的前景,目前研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用與抑制細(xì)胞侵襲及遷移等相關(guān)。楊靜波等[12]發(fā)現(xiàn)苦參堿及氧化苦參堿均可抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖及遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。張貝貝等[13]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,其作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin 通路激活、逆轉(zhuǎn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)機(jī)制有關(guān)。張彩靈等[14]發(fā)現(xiàn),苦參素能抑制肝癌的增殖及遷移,其機(jī)制是通過(guò)上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-204的表達(dá)來(lái)抑制TGF-β1進(jìn)而抑制EMT的發(fā)生。黎梨[15]研究發(fā)現(xiàn)苦參素通過(guò)影響ZEB1及EC表達(dá)來(lái)削弱EMT作用,進(jìn)而抑制 P-gp的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)HCC中化療耐藥性。戴美琴[16]發(fā)現(xiàn)苦參堿能抑制肝癌Bel-7402和SMMC-7721細(xì)胞遷移、侵襲,其機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)miR-199a-5p表達(dá),抑制HIF-1α的功能,進(jìn)而產(chǎn)生抗EMT的作用。EMT與腫瘤起始、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性有關(guān)[17],它有助于腫瘤進(jìn)展,并被認(rèn)為是多種類型腫瘤擴(kuò)散的驅(qū)動(dòng)因素[18]。EMT的特點(diǎn)是上皮指標(biāo)N-cadherin、Vimentin的水平升高和E-cadherin 的水平降低[19],故檢測(cè)N-cadherin、Vimentin及E-cadherin表達(dá)程度可反映EMT水平。本實(shí)驗(yàn)研究顯示,苦參堿作用后,肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力減弱,E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào),N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào),提示苦參堿可能通過(guò)抑制EMT而抑制肝癌侵襲及遷移水平。

為進(jìn)一步研究苦參堿抑制肝癌侵襲遷移的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-122上調(diào)其表達(dá)后檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力及相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果顯示苦參堿能上調(diào)miR-122的表達(dá),苦參堿組、miR-122 mimic組和miR-122 mimic+苦參組均能抑制肝癌HepG2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,且miR-122 mimic+苦參組抑制作用最明顯。張軒等[20]發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿能提高肝細(xì)胞中miR-122 表達(dá),對(duì)乙型肝炎病毒的復(fù)制有明顯的抑制作用。向發(fā)良[21]發(fā)現(xiàn)苦參素能上調(diào)MicroRNA-122表達(dá)和下調(diào)MicroRNA-21,進(jìn)而抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。孫秀光等[22]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞miR-122的表達(dá)后能下調(diào)N-myc下游調(diào)節(jié)基因3(NDRG3)的表達(dá)進(jìn)而抑制肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。王靜等[23]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-122 mimic上調(diào)miR-122后,肝癌MHCC-97H細(xì)胞遷移能力受到抑制,而轉(zhuǎn)染miR-122 inhibitor抑制miR-122表達(dá)后,細(xì)胞遷移能力則增強(qiáng),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-122可調(diào)控EMT,表明miR-122可通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞EMT抑制肝癌的侵襲與遷移。以上研究提示苦參堿可能作用于miR-122,而miR-122表達(dá)增加后可抑制侵襲轉(zhuǎn)移,本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿作用后miR-122表達(dá)增加,提示苦參堿能上調(diào)miR-122的表達(dá),通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-122使其過(guò)表達(dá)后,苦參堿對(duì)肝癌侵襲及遷移的抑制作用更加顯著,提示苦參堿可上調(diào)mi-122的表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌侵襲遷移。而苦參堿組、miR-122 mimic組及聯(lián)合組均能上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)、下調(diào)N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá),且聯(lián)合組作用最明顯,提示苦參堿抑制肝癌細(xì)胞侵襲及遷移能力可能是通過(guò)上調(diào)miR-122表達(dá)進(jìn)而影響EMT水平實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,苦參堿能抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,其機(jī)制可能與上調(diào)miR-122表達(dá),從而抑制EMT發(fā)生有關(guān)。