不同濃度龍血竭總黃酮對(duì)大鼠MIRI心肌細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響

周尚,劉燕,羅文琳,黃蘭松,黃照河

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平、科技的發(fā)展,人們飲食習(xí)慣的改變,心血管疾病的發(fā)病率不斷上升,心血管病死亡占我國(guó)居民總死亡原因的首位[1]。急性心肌梗死(AMI)是一種嚴(yán)重威脅生命的心血管疾病,由冠狀動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致的長(zhǎng)期缺血和缺氧損害心臟功能。急性心肌梗死的早期治療可恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)并降低死亡風(fēng)險(xiǎn),但當(dāng)中斷的心肌供血在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)時(shí),對(duì)原有缺血心肌造成更嚴(yán)重的損傷,這被稱(chēng)為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[2-3]。盡管對(duì)MIRI的研究已經(jīng)很久,但是MIRI作為一個(gè)重要的臨床問(wèn)題至今沒(méi)有有效的治療手段。對(duì)MIRI損傷的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的詳細(xì)分子機(jī)制仍未完全闡明。因此,了解MIRI的潛在分子機(jī)制并為其預(yù)防和治療制定新的治療策略至關(guān)重要。

龍血竭做為我國(guó)傳統(tǒng)中藥,是龍舌蘭科植物劍葉龍血樹(shù)的乙醇提取物。龍血竭總黃酮(sanguis draconis flavones,SDF)是從龍血竭中提取得到的主要成分,包括黃酮、二氫黃酮、黃烷、查耳酮、二氫查耳酮等多種化合物。研究顯示它具有抑制血小板活性和血栓形成,對(duì)心肌缺血有改善等作用[4]。大量研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)SDF對(duì)MIRI具有保護(hù)作用[5-6]。PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能的重要通路之一,在許多生理過(guò)程和病理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)組織炎癥等[7-9]。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號(hào)通路與MIRI密切相關(guān),激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以減少心臟MIRI[10]。細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物調(diào)節(jié)的程序性細(xì)胞死亡的一種方式,其中線(xiàn)粒體凋亡通路是細(xì)胞凋亡的主要通路。線(xiàn)粒體通路涉及Bcl-2家族的促凋亡成員與線(xiàn)粒體的聯(lián)合,誘導(dǎo)細(xì)胞色素C及其其他細(xì)胞凋亡因子釋放入細(xì)胞質(zhì),繼而激活Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11],Caspase-3是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵的調(diào)控因子[12]。PI3K/AKT通路的活性對(duì)MIRI有多種影響,特別是,它對(duì)與線(xiàn)粒體相關(guān)的I/R損傷具有抗凋亡作用[8],因此,激活PI3K/AKT信號(hào)通路已成為減少M(fèi)IRI的有效策略[13-14]。課題組前期研究表明龍血竭總黃酮可以保護(hù)MIRI[15],但其保護(hù)作用是否通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路以減少細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究通過(guò)建立大鼠MIRI模型,探討龍血竭總黃酮對(duì)大鼠MIRI心肌細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響,為SDF治療MIRI提供新的見(jiàn)解,并可能為MIRI治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料

1.1藥材及試劑 SDF由廣西中醫(yī)藥研究院提供。用紫外分光光度法測(cè)定其中總黃酮含量在70%以上,使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成濃度分別為9 mg/mL、18 mg/mL、27 mg/mL、36 mg/mL的SDF混懸液備用。56只SD雄性大鼠(6～8周齡,250～350 g)由北京維通利爾動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供[證書(shū)編號(hào):SCXK(粵)2022-0063,廣東,中國(guó)],可自由獲得食物和水,室溫保持在20～25℃。本次研究得到了右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。蘇木素染色液及伊紅染色液(長(zhǎng)春賽默瑞特科技有限公司);2%TTC染色液(北京雷根生物有限公司);PI3K抗體、AKT抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、羊抗兔IgG-HRP(四川正能生物公司);Caspase-3抗體(英國(guó)Abcam公司);RIPA裂解液、蛋白酶抑制混合物、抗體稀釋液、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、TBST洗膜液、BCA(bicinchoninicacid)蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)公司);硝酸纖維素膜(PVDF)(美國(guó)Millpore公司)。

1.2儀器 DW3000型小動(dòng)物人工呼吸機(jī)(上海玉研儀器設(shè)備有限公司);小動(dòng)物心電圖機(jī)(廣州三銳電子科技有限公司);冷凍離心機(jī)(上海中康儀器有限公司);顯微鏡(上海儀圓光學(xué)器有限公司);恒溫烘箱(日本松下公司);石蠟切片機(jī)(美國(guó)賽默飛公司);攤片機(jī)(美國(guó)賽默飛公司);冰凍切片機(jī)(美國(guó)賽默飛公司);脫水機(jī)(美國(guó)賽默飛公司);Western blot系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);通用凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)通用公司);高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技公司);酶標(biāo)儀(德國(guó)珀金埃爾默公司)等。

1.3MIRI大鼠建立模型、分組和處理 大鼠被隨機(jī)分為7組(每組8只):①Control組;②Sham組;③缺血/再灌注組(I/R組);④龍血竭總黃酮低劑量+缺血再灌注組(SDF-L組);⑤龍血竭總黃酮中劑量+缺血再灌注組(SDF-M組);⑥龍血竭總黃酮高劑量+缺血再灌注組(SDF-H組);⑦龍血竭總黃酮大劑量+缺血再灌注組(SDF-B組)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,龍血竭總黃酮混懸液按低劑量用藥組(90 mg/kg)、中劑量用藥組(180 mg/kg)、高劑量用藥組(270 mg/kg)、大劑量用藥組(360 mg/kg)灌胃預(yù)處理14 d,Sham組和I/R組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃14 d,Control組正常喂食。灌滿(mǎn)14 d后I/R組及不同劑量龍血竭用藥組大鼠開(kāi)始建立MIRI模型,MIRI模型是根據(jù)梁麗梅等[16-17]的研究建立的。簡(jiǎn)而言之,腹腔注射10%烏拉坦(0.5 mL/100 mg)麻醉大鼠。麻醉后,予氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣后,切開(kāi)大鼠胸壁,用6-0絲線(xiàn),結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,缺血30 min后,松開(kāi)繩結(jié)進(jìn)行再灌注2 h。Sham組的小鼠穿針但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,用藥組的大鼠與I/R組的操作相同。心肌缺血再灌注造模成功標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎后,心尖組織發(fā)白或呈暗灰色,心電圖ST段明顯抬高,T波高聳為缺血成功;松開(kāi)繩結(jié)后,心尖缺血區(qū)顏色變紅,ST回落1/2為再灌注成功。大鼠相關(guān)組織取材后立即予放置-80℃冰箱存放。共有56只大鼠進(jìn)行造模取材,在造模取材過(guò)程中,Sham組、SDF-L組大鼠因室顫和其他原因?qū)е滤劳?只,剩余52只大鼠。

1.4心電圖監(jiān)測(cè) 使用小動(dòng)物心電圖機(jī)的電極插入大鼠右上、下肢及左下肢皮下,觀察心電圖Ⅱ?qū)?lián)。觀察并記錄大鼠心電圖ST段變化。

1.5血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的測(cè)定 將血清于-80 ℃冰箱取出后,4 ℃溶解后適當(dāng)稀釋,按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作,根據(jù)ELISA制造商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清LDH和CK-MB含量。

1.6心肌梗死面積大小測(cè)量 三苯基氯化四氮唑(TTC)染色被用來(lái)確定大鼠MIRI損傷后的梗塞大小。在MIRI后,大鼠心臟被切除,并切成2 mm的片狀。用2%TTC對(duì)組織切片進(jìn)行染色,在37 ℃下避光孵育30 min,期間予多次翻面,達(dá)到充分浸潤(rùn),后用4%多聚甲醛固定,然后檢測(cè)心肌梗死面積。白色區(qū)域表示心肌梗死的大小;紅色區(qū)域表示非缺血區(qū)域。最后,用ImageJ軟件計(jì)算梗死的大小。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)心肌組織形態(tài)學(xué)變化 取血后,迅速分離大鼠心臟1/3到2/3的尖部進(jìn)行石蠟切片。切片經(jīng)脫水處理后, 用蘇木素和伊紅進(jìn)行染色之后,對(duì)切片進(jìn)行脫水、清理、密封。在顯微鏡下觀察心臟病理學(xué)改變。

1.8Western Blot檢測(cè)PI3K、AKT的蛋白含量 大鼠腹主動(dòng)脈取血后,分離心臟,提取左心室心肌組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,調(diào)整各組蛋白濃度。等量蛋白(30 μg)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%BSA室溫封閉2 h,接著加入相應(yīng)的一抗抗體(稀釋比例1∶1000),4 ℃孵育過(guò)夜,1×TBST洗膜3次,每次10 min,加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶5000)室溫孵育2 h。洗膜3次,每次10 min后,在GE凝膠成像系統(tǒng)中采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)蛋白條帶,以GAPDH為內(nèi)參,使用ImageJ軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析,以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1大鼠心電圖變化情況 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前開(kāi)始連續(xù)監(jiān)測(cè)并記錄大鼠心電圖至再灌注2 h后,觀察Ⅱ?qū)?lián)T波和ST段的變化。比較冠脈結(jié)扎前后的心電圖,結(jié)扎后ST段可見(jiàn)弓背向上抬高,再灌注時(shí)的ST段逐漸向下回落,最終接近基線(xiàn)水平,說(shuō)明大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立成功。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心電圖

2.2龍血竭總黃酮對(duì)MIRI大鼠血清LDH和CK-MB含量的影響 與Sham組相比,I/R組、SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組大鼠血清LDH和CK-MB含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與I/R組相比,SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組大鼠血清LDH和CK-MB含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清LDH和CK-MB水平的比較 單位:U/L

2.3龍血竭總黃酮對(duì)MIRI大鼠心肌梗死面積的影響 Control組與Sham組相比,大鼠心肌梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Sham組相比,I/R組、SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組、SDF-B組大鼠心肌梗死面積顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與I/R組相比,SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組、SDF-B組大鼠心肌梗死面積顯著減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各用藥劑量組之間相比,大鼠心肌梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 TTC染色法測(cè)定各組大鼠心肌梗死范圍圖

注:與Sham組比較,*P<0.05,與I/R組比較,**P<0.01。

2.4龍血竭總黃酮對(duì)MIRI大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下觀察Control組和Sham組大鼠心臟切片,心肌細(xì)胞排列整齊致密,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,邊界清晰,心肌纖維排列整齊,未見(jiàn)變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),心肌細(xì)胞分布有序。相反,I/R組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,心肌細(xì)胞紊亂,細(xì)胞變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯。SDF-L組心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞水腫,可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SDF-M組心肌細(xì)胞腫脹,無(wú)空泡樣變性,細(xì)胞核完整,心肌細(xì)胞排列輕度紊亂,間質(zhì)輕度水腫。SDF-H組心肌纖維排列規(guī)則,少量心肌纖維化,胞漿染色不均勻,心肌纖維間隙未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SDF-B組肌纖維排列規(guī)則,可見(jiàn)心肌纖維化,胞漿染色不均勻,肌纖維間隙無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與I/R組比較,各劑量組大鼠心肌細(xì)胞腫脹減輕,細(xì)胞變性、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也減少損傷癥狀明顯減輕。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠HE染色圖(×400)

2.5龍血竭總黃酮對(duì)MIRI大鼠心肌組織PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 Control組與Sham組PI3K、AKT蛋白含量無(wú)差異(P>0.05);與Sham組比較,I/R組PI3K、AKT蛋白含量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與I/R組比較,SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組PI3K、AKT蛋白含量明顯升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與Sham組比較,I/R組大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與I/R組比較,SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組Caspase-3蛋白含量出現(xiàn)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各劑量組之間相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5A、圖5B。

注:A.Western Blot法檢測(cè)各組大鼠PI3K、AKT、Caspase-3蛋白水平情況;B.各組大鼠蛋白表達(dá)水平的比較。*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

MIRI的機(jī)制極其復(fù)雜,迄今為止,人們都未能闡明其作用的機(jī)制。主流的觀點(diǎn)認(rèn)為,自由基和促炎細(xì)胞因子的過(guò)量產(chǎn)生,細(xì)胞凋亡的增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激都參與了MIRI的發(fā)生和發(fā)展[18]。心肌I/R損傷可導(dǎo)致心力衰竭和心肌炎癥等預(yù)后不良,觸發(fā)室性心律失?？赡軐?dǎo)致心肌梗死加重[19]。細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物調(diào)節(jié)的程序性細(xì)胞死亡的一種方式[20]。細(xì)胞凋亡參與MIRI的病理生理過(guò)程,研究表明,MIRI以多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,包括Bax水平升高,Bcl-2水平降低以及抑制PI3K/AKT途徑的激活[21]。防止心肌細(xì)胞凋亡作為保護(hù)心肌免受MIRI損害的新靶點(diǎn),引起了越來(lái)越多的關(guān)注。

PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)體內(nèi)多種細(xì)胞活動(dòng),大量研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活對(duì)于抑制MIRI期間心肌細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[22]。能夠?qū)ax、Bad、Caspase-3等促凋亡基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用,而對(duì)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)作用[23-24],從而發(fā)揮抗凋亡作用,減輕心肌損傷。而當(dāng)缺血缺氧、缺血再灌注等病理因素作用于細(xì)胞時(shí),內(nèi)源性途徑啟動(dòng)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,激活Bcl-2家族蛋白,促使線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C,進(jìn)一步激活Caspase-3,Caspase-3通過(guò)直接切割細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白來(lái)完成細(xì)胞凋亡的過(guò)程,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,是細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要的調(diào)控因子[25]。因此,抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)可以顯著減輕MIRI,當(dāng)出現(xiàn)MIRI時(shí),PI3K/AKT通路受到抑制并使其抗凋亡作用減弱。大量研究證實(shí)龍血竭總黃酮具有抗炎、抗血小板聚集、抑制細(xì)胞凋亡等作用[4,15,26-27]。其在MIRI時(shí)通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡。MIRI過(guò)程中,蛋白水解酶活性發(fā)生變化,細(xì)胞膜通透性增加,影響心肌細(xì)胞代謝的關(guān)鍵酶LDH和CK-MB從胞漿進(jìn)入血液,增加其在血清中的含量。因此,常將其作為反映心肌細(xì)胞損傷程度的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用SDF預(yù)處理后,大鼠LDH和CK-MB水平下降、心肌梗死面積減少,TTC染色結(jié)果提示梗死面積縮小,均能顯著證實(shí)SDF對(duì)MIRI具有保護(hù)作用。與Sham組比較,I/R組的PI3K、AKT、蛋白含量下降,Caspase-3蛋白含量上升,說(shuō)明在MIRI時(shí),細(xì)胞凋亡通路被激活,大量細(xì)胞凋亡,并抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路;相比于I/R組,SDF各劑量組PI3K、AKT蛋白表達(dá)明顯上升,且高劑量組PI3K、AKT蛋白上升顯著,Caspase-3蛋白表達(dá)下降,說(shuō)明心肌細(xì)胞凋亡受到抑制,這可能與SDF激活PI3K/AKT信號(hào)通路途徑有關(guān)。綜上,SDF的抗凋亡作用在心腦血管疾病治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),但其有效化學(xué)成分復(fù)雜,目前的研究熱點(diǎn)依舊是有效成分的分析和提取。本實(shí)驗(yàn)表明,SDF可激活PI3K/AKT通路,發(fā)揮抗凋亡作用,減少細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生心肌保護(hù)功效。當(dāng)然,MIRI發(fā)病機(jī)制較多,并且各通路間相互協(xié)同,目前對(duì)其具體保護(hù)機(jī)制尚不能明確。本實(shí)驗(yàn)僅從PI3K/AKT信號(hào)通路角度,探討SDF與MIRI的關(guān)系,其具體機(jī)制還需進(jìn)一步論證。

本研究表明SDF能改善大鼠MIRI,以龍血竭高劑量組療效最佳。SDF可降低心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、CK-MB的活性,減少心肌梗死面積,抑制心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌組織的病理?yè)p傷。綜上所述,SDF通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡,從而對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。