接種4種外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗生長、光合及養(yǎng)分含量的影響

戴偉紅，鄒 鋒，江 盈，左榮花，田詩義，殷慧敏，熊 歡

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院/經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

【研究意義】板栗（Castanea mollissima）屬殼斗科（Fagaceae）栗屬（CastaneaMiller）植物，其堅果美味可口，營養(yǎng)價值高，素有“鐵桿莊稼”“木本糧食”之美譽(yù)[1-2]。發(fā)展板栗產(chǎn)業(yè)，對于推動山區(qū)綠色經(jīng)濟(jì)和鄉(xiāng)村振興具有重要的意義[3]。目前，我國板栗仍處于大田實生苗嫁接良種的繁殖階段，移栽定植過程中起苗易傷主根，加之板栗主根再生能力較弱[4]，苗木質(zhì)量不能得到有效保障。在丘陵山地造林存在緩苗期長、苗木生長慢等問題，如何培育優(yōu)質(zhì)板栗苗木以適應(yīng)瘠薄的山地亟待解決。經(jīng)研究表明，菌根化育苗可提高苗木生物量、苗木質(zhì)量和山地造林成活率，增強(qiáng)其抗逆性[5-6]。菌根化育苗技術(shù)是實現(xiàn)菌根在林業(yè)中應(yīng)用的技術(shù)關(guān)鍵。板栗是外生菌根真菌宿主植物，探究不同外生菌根真菌對板栗幼苗生長的影響，對板栗優(yōu)勢菌種篩選及菌根化育苗技術(shù)應(yīng)用具有現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】菌根（mycorrhiza）是指土壤中真菌與高等植物根系形成的一種互惠互利的共生體（mutualistic symbiont）[7]。世界上約有10%的植物能形成外生菌根，大多為喬木樹種，主要有松科（Pinaceae）、柏科（Cupressaceae）、楊柳科（Salicaceae）、樺木科（Betulaceae）、殼斗科（Fagaceae）等34科100余屬的植物[8]。對杉木（Cunninghamia lanceolata）、遼東櫟（Quercus liaotungensis）、紅錐（Castanopsis hystrix）及臺灣相思（Acacia confusa）等其他林木的研究表明，接種外生菌根真菌具有促進(jìn)林木幼苗存活[9]、養(yǎng)分吸收與生長[10-11]、抗逆特性[12]等方面的多重生態(tài)功能。接種外生菌根真菌通過顯著提高宿主植物的光合作用效率，從而提高碳水化合物在植物體內(nèi)的積累，實現(xiàn)幼苗的快速生長。然而，一些用幼苗和幼樹的試驗也表明，因菌根提高的光合作用可能不總能補(bǔ)償菌根對碳水化合物的需求，而導(dǎo)致明顯較矮小的外生菌根植株[13-14]。這個效果不僅和與宿主植物共生的真菌種類相關(guān)，也和宿主植物的營養(yǎng)狀態(tài)相關(guān)[15]。因此，像“適地適樹”一樣，應(yīng)提倡“適樹適菌”，不能盲目使用菌根真菌[16]。【本研究切入點】目前，關(guān)于板栗接種外生菌根真菌研究主要集中在我國北方[17-19]，然而關(guān)于接種外生菌根真菌對湖南主栽品種‘檀橋’板栗幼苗生長的研究尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究以‘檀橋’板栗家系苗為材料，設(shè)置4個不同菌種的接菌處理，以不接菌為對照，通過測定和分析其菌根侵染率、生長（苗高、地徑、生物量、根系）、光合指標(biāo)及植株氮、磷、鉀養(yǎng)分含量，研究接種不同外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗生長的影響，篩選出促生作用較好的外生菌根真菌，以期為南方丘陵山地板栗菌根化育苗技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘檀橋’板栗，該品種具有果大、色亮、淀粉含量高，香甜可口，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗性強(qiáng)等特點[20]。試驗材料為‘檀橋’板栗家系苗，其種子由中南林業(yè)科技大學(xué)栗種質(zhì)資源圃提供。種子消毒：播種前采取水浸法進(jìn)行選種，利用多菌靈（含量50%）消毒20 min、無菌水沖洗2～3 次后，于4 月下旬播種。供試基質(zhì)∶由黃心土∶草炭土∶珍珠巖∶蛭石=6∶4∶2∶1 的體積比混合制成?；|(zhì)消毒：將五氯硝基苯（含量為40%）稀釋10 倍后均勻噴灑供試基質(zhì)，并用塑料薄膜覆蓋3 d。打開薄膜后，將基質(zhì)翻勻攤開晾曬，7 d 后裝入16 cm×30 cm（口徑×高）的盆中用于播種。5月中旬，待板栗幼苗第一對真葉展開后[21]，選擇整齊一致的苗木進(jìn)行接種。

1.2 外生菌根真菌及培養(yǎng)

供試菌種如表1，由課題組前期分離、鑒定所得[22]。液體菌劑制作：選用MMN 固體培養(yǎng)基[23]，對真菌進(jìn)行平板培養(yǎng)后，分別切取1 片菌餅放入經(jīng)滅菌的裝有150 mL MMN 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床上（25 ℃、180 r/min）振蕩培養(yǎng)1個月。固體菌劑制作：將泥炭土∶蛭石=9∶1的體積比混合后，裝入10 cm×20 cm 組培瓶中，于高壓滅菌鍋中120 ℃滅菌20 min，滅兩次。每瓶固體基質(zhì)倒入約50 mL 液體菌劑后，于25 ℃暗培養(yǎng)30 d，即可備用[24]。

表1 供試菌種Tab.1 The tested strains

1.3 試驗設(shè)計

設(shè)置5個水平，分別為：不接種（CK）、接種LY-8、LY-9、LY-17-2和MB，每15盆為1個小區(qū)，每種處理重復(fù)4次，共計300株苗，各小區(qū)之間間隔0.5 m。采用品字形接種于幼苗近根部土壤，每盆接種30 g固體菌劑。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 菌根侵染率 在9 月中旬，即接種4 個月后，取根系非木質(zhì)化的部位，將其剪成1 cm 長的根段，隨機(jī)取100根段，用培養(yǎng)皿置于體式顯微鏡（Olympus SZX16）下，用觀察統(tǒng)計法測定菌根侵染率[25]。菌根侵染率=侵染成功的菌根根段數(shù)/總根段數(shù)×100%。每個處理隨機(jī)選擇10 株苗木，單株為1 次重復(fù)。

1.4.2 苗木生長指標(biāo)測定 從6月到11月，連續(xù)每月用卷尺和游標(biāo)卡尺測定其苗高和地徑，每個處理隨機(jī)選擇20 株幼苗。待11 月苗高地徑調(diào)查結(jié)束后，用電子天平稱量單株苗木地上部和地下部鮮重，然后將地上部和地下部分別于105 ℃殺青30 min，60 ℃烘干至恒重，稱取地上部和地下部干重[26]。根據(jù)生物量計算苗木質(zhì)量指數(shù)[27]：苗木質(zhì)量指數(shù)=苗木總干物質(zhì)量（g）/[苗高（cm）/地徑（mm）+莖干物質(zhì)量（g）/根干物質(zhì)量（g）]。每個處理隨機(jī)選擇10株幼苗，單株為1次重復(fù)。

1.4.3 根系形態(tài)觀測 于11月，取各處理的地下部，利用根系掃描儀（Epson expression 11000XL）掃描圖像，運(yùn)用Win-Rhizo 根系分析儀軟件分析根總長、根系總表面積、根平均直徑、根體積和根尖數(shù)[28]。每個處理隨機(jī)選擇10株幼苗，單株為1次重復(fù)。

1.4.4 光合參數(shù)和葉綠素含量測定 在8 月中旬，定于晴天09：00—11：00，使用Li-6400XT 便攜式光合儀測定凈光合速率、蒸騰速率，并計算水分利用效率（水分利用效率=光合速率/蒸騰速率），并采摘其葉片進(jìn)行葉綠素含量測定[29]。每個處理隨機(jī)選擇5株苗木，每株選擇成熟的功能葉3片，重復(fù)測定3次。

1.4.5 養(yǎng)分含量測定 于11 月，分別將根、莖、葉烘干后粉碎，各稱取0.3 g 經(jīng)硫酸-雙氧水消化后，采用自動間斷分析儀（Smart chem200）測定氮、磷，火焰光度計（Model 410）測定鉀[30]。每個處理隨機(jī)選擇10 株苗木，單株為1次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Excel 2010軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用IBM SPSS statistics 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。不同處理之間試驗參數(shù)顯著差異性采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的鄧肯氏檢驗（Duncan’s test，P＜0.05），運(yùn)用Origin 2019軟件進(jìn)行繪圖。采用皮爾森法（Pearson）分析苗木質(zhì)量指數(shù)與苗木根、莖、葉中氮、磷、鉀養(yǎng)分吸收的相關(guān)性[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘檀橋’板栗幼苗根系的侵染情況

接種LY-8、LY-9、LY-17-2 和MB 后，均觀察到根尖膨大，菌根為黃色或白色，并有外延菌絲，而CK未形成外生菌根（圖1A，圖1B，圖1C，圖1D）。然而，不同外生菌根真菌接種‘檀橋’板栗幼苗后，其菌根侵染率有顯著差異（圖1F）。其中，LY-17-2的侵染率最高，達(dá)86.40%；其次是MB，為73.17%；而LY-8與LY-9的侵染率差異不顯著。

圖1 不同外生菌根真菌接種板栗幼苗后形成的菌根共生體形態(tài)及侵染率Fig.1 Morphology and infection rate of mycorrhizal symbionts formed by different ectomycorrhizal fungi inoculating Castanea mollissima seedlings

2.2 外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗生長的影響

接種4 種外生菌根真菌的‘檀橋’板栗幼苗苗高和地徑均高于對照，且差異顯著（P＜0.05，圖2），較對照分別增加19.81%～32.74%和17.89%～24.80%。在6月至11月期間，接種MB 的幼苗苗高生長速度最快且最大為51.33 cm，其次是LY-17-2，苗高為48.67 cm（圖2A）；接種LY-8 的幼苗地徑生長速度最快且最大為6.14 mm，其次是MB，地徑為5.98 mm（圖2B）。

圖2 不同外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗苗高（A）和地徑（B）的影響Fig.2 Effects of different ectomycorrhizal fungi on seedling height（A）and ground diameter（B）of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

由表2可以看出，接種4種外生菌根真菌的‘檀橋’板栗生物量均高于對照，且差異顯著（P＜0.05），其接菌苗較對照分別提高了78.75%、71.47%、95.50%、86.36%。并且，接種處理均能顯著提高‘檀橋’板栗地上和地下部分的鮮重、干重。其中，接種LY-17-2 效果最好，生物量最大12.61 g/株，苗木質(zhì)量指數(shù)也最大，為1.44，且地上鮮重、干重較對照分別增加57.97%、73.88%；地下鮮重、干重較對照分別增加72.81%、122.81%。

表2 不同外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗生物量的影響Tab.2 Effects of different ectomycorrhizal fungi on the biomass of Castanea mollissima‘Tanqiao’ seedlings

2.3 外生菌根真菌對板栗幼苗根系構(gòu)型的影響

接種LY-8、LY-9、LY-17-2和MB的‘檀橋’板栗根系總長度、表面積、體積、平均直徑、根尖數(shù)均高于對照，且除了平均直徑，其他均差異顯著（P＜0.05，表3，圖3）。接種處理與對照相比，根系長度分別增加183.68%、126.25%、143.31%、141.11%；表面積分別增加216.69%、156.91%、190.39%、176.29%；根系體積分別增加235%、160%、197.25%、146.25%；根系平均直徑分別增加16.36%、21.82%、21.82%、16.36%；根尖數(shù)分別增加157.60%、107.49%、121.60%、131.61%。并且，從總根長、表面積、體積、根尖數(shù)來看，接種LY-8效果最好，其次是LY-17-2。

圖3 不同接菌處理‘檀橋’板栗幼苗的根系形態(tài)Fig.3 Root morphology of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings under different inoculation treatments

表3 不同外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗根系生長參數(shù)的影響Tab.3 Effects of different ectomycorrhizal fungi on root growth parameters of Castanea mollissima‘Tanqiao’seedlings

2.4 外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗光合、蒸騰速率、水分利用效率和葉綠素含量的影響

接種4 種外生菌根真菌的‘檀橋’板栗幼苗凈光合速率較對照明顯升高，且差異顯著（P＜0.05，圖4A），其中接種LY-17-2 的幼苗凈光合速率最高，為6.51 μmol/（m2·s），較對照高131.67%。接種LY-8、LY-17-2 和MB 的幼苗蒸騰速率較對照相比明顯降低，且差異顯著（P＜0.05，圖4B）。對于水分利用效率，接種LY-8和LY-17-2‘檀橋’板栗幼苗較對照顯著（P＜0.05，圖4C），分別提高263.16%和612.03%。

圖4 不同外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗葉片光合速率（A）、蒸騰速率（B）和水分利用率（C）的影響Fig.4 Effect of different ectomycorrhizal fungi on Pn（A），Tr（B），and WUE（C）in the leaves of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

接種4種外生菌根真菌的‘檀橋’板栗幼苗葉綠素a含量、葉綠素b含量和總?cè)~綠素含量均高于對照，且差異顯著（P＜0.05，圖5）。接種后，其幼苗葉綠素a含量明顯增加，增幅在12.05%～55.42%。其中，接種MB 后，葉綠素a 含量最大為1.29 mg/g（圖5A）。接種后，其幼苗葉綠素b 含量也明顯增加，增幅在41.67%～208.33%。其中，接種LY-8 后，葉綠素b 含量最大為1.11 mg/g（圖5 B）。并且，接種LY-8 后，葉片總?cè)~綠素含量較對照增加最多，為100.85%（圖5 C）。

圖5 接種不同外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗葉片葉綠素a含量（A）、葉綠素b（B）含量和總?cè)~綠素含量（C）的影響Fig.5 Effects of different ectomycorrhizal fungi on chlorophyll a content（A），chlorophyll b content（B）and total chlorophyll content（C）in leaves of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

2.5 外生菌根真菌對‘檀橋’板栗幼苗養(yǎng)分積累的影響

接種外生菌根真菌促進(jìn)了‘檀橋’板栗幼苗養(yǎng)分的積累（圖6）。接種苗的根、莖、葉中N 元素含量均高于對照，且有顯著差異（P＜0.05，圖6A）。與對照相比，接種后根、莖、葉中N 的百分含量分別提高了5.97%～22.84%、12.83%～21.32%、13.80%～20.56%，且接種LY-17-2 效果最佳。接種也導(dǎo)致了‘檀橋’板栗幼苗根、莖、葉中P 含量的升高且差異顯著（P＜0.05，圖6B），尤其是根中P 含量提高了192.86%～350.00%，其中接種MB 的根P 含量最高，為0.63 g/kg；其次是LY-17-2，為0.52 g/kg。從對K 的影響看，接種對葉片中的K 含量有顯著影響（P＜0.05，圖6 C），而對莖和根中的K含量并無顯著影響。

圖6 不同接菌處理對‘檀橋’板栗幼苗積累N（A）、P（B）、K（C）的影響Fig.6 Different inoculation treatments on N（A），P（B）and K（C）accumulation by Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

2.6 苗木質(zhì)量指數(shù)與N、P、K線性回歸分析

苗木質(zhì)量指數(shù)與根、莖、葉的N、P和葉中的K呈顯著正相關(guān)，與根、莖中的K無顯著相關(guān)性（圖7）。對于氮積累，根、莖、葉中的相關(guān)系數(shù)分別是0.51（P＜0.01），0.47（P＜0.01）和0.52（P＜0.01）（圖7A，圖7B，圖7C）。對于磷積累，根、莖、葉中的相關(guān)系數(shù)分別是0.63（P＜0.001），0.42（P＜0.01）和0.45（P＜0.01）（圖7D，圖7E，圖7F），其中根中的P極顯著（P＜0.001）。對于鉀積累，葉中的相關(guān)系數(shù)分別是0.41（P＜0.01）（圖7I）。

圖7 苗木質(zhì)量指數(shù)（SOI）與根、莖、葉中氮、磷、鉀養(yǎng)分積累的相關(guān)性Fig.7 Correlation between seedling quality index（SOI）and accumulation of nitrogen，phosphorus and potassium in roots，stems and leaves

3 討論與結(jié)論

豆馬勃屬和硬皮馬勃屬的外生菌根真菌是殼斗科植物的常見共生真菌[22,24,28,31]。然而，不同菌種對不同林木或同種林木的侵染率及共生效應(yīng)均有顯著差異[32-35]。本研究供試的4種外生菌根真菌在接種4個月之后，均能成功侵染‘檀橋’板栗幼苗的根系形成菌根，且菌根侵染率均超過60%。其中，接種Sclerodermasp.1（LY-17-2）的侵染率顯著高于接種其他真菌，達(dá)86.40%。

苗木質(zhì)量指數(shù)（SQI）是綜合評價苗木質(zhì)量的重要形態(tài)指標(biāo)之一，SQI＜1.0的是低質(zhì)量的幼苗，而SQI＞1.0是高質(zhì)量的幼苗[36]。本研究發(fā)現(xiàn)接種4種外生菌根真菌均能顯著提高SQI，將低質(zhì)量的‘檀橋’板栗幼苗（未接種SQI=0.76）培育成高質(zhì)量苗木（接種LY-17-2 的SQI=1.44），在錐栗（C.henryi）上接種Sclerodermasp.也得到類似的結(jié)果[24]。通過SQI的計算公式可知，其與苗木根系干質(zhì)量成正比。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，接種4種外生菌根均能顯著提高‘檀橋’板栗幼苗的根系干質(zhì)量和根系構(gòu)型指標(biāo)。這與用其他外生菌根真菌侵染錐栗和歐洲栗（C.sativa）上得到的結(jié)果類似，即接種外生菌根真菌主要促進(jìn)了苗木根系發(fā)育[37-38]。與其他3 種真菌相比，接種LY-8 在總根長和根尖數(shù)上有更明顯的促進(jìn)作用。植物根系是吸收養(yǎng)分的主要器官，總根長增加和根尖數(shù)的增多有助于提升根系對氮、磷、鉀養(yǎng)分的吸收利用[24]。且接種LY-8 和LY-17-2 根部氮的積累顯著高于LY-9 和MB，而氮是葉綠素的重要組成元素之一，導(dǎo)致接種LY-8葉綠素含量顯著高于其他3種。

與未接種相比，接種苗的光合作用速率顯著增加，這與歐洲栗、板栗等菌根化的研究結(jié)果一致[39-40]?？赡苡捎谕馍婢L對碳水化合物的需求，刺激幼苗提高光能轉(zhuǎn)化效率[14]。此外，通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)苗木質(zhì)量指數(shù)與根、莖、葉的N、P 和葉中的K 呈顯著正相關(guān)，特別是根中的P 極顯著。大量研究表明，P 是酸性紅壤地區(qū)限制林木生長的關(guān)鍵因子[41-42]，接種苗更加發(fā)達(dá)的根系及菌絲網(wǎng)絡(luò)，有利于對土壤中礦質(zhì)養(yǎng)分元素（特別是P）的吸收[43-44]。然而，接種苗和未接種苗中除了葉片中的K有顯著差異，其莖和根中的K 含量并無顯著性差異，可能是由于植物不同器官或組織的營養(yǎng)和能量需求不同[45]，而K 在莖和根中積累處于相對平衡的狀態(tài)，因此接種外生菌根真菌對K在莖和根中的積累無顯著影響。

綜上所述，接種4種外生菌根真菌擴(kuò)大了根系，促進(jìn)了植株對養(yǎng)分的積累，提高了光能利用率，最終促進(jìn)了‘檀橋’板栗幼苗的生長。經(jīng)過綜合比較，接種LY-8和LY-17-2對‘檀橋’板栗幼苗促生效果最好。

致謝：湖南省教育廳重點項目（21A0180）同時對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！