ADAM10 在人動靜脈內瘺狹窄處血管組織中的表達及其對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響

孫利軍, 馮 杰, 劉小明, 任廣偉, 阮 琳

（河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院腎內科，河北 石家莊 050031）

2015 年，全世界約有262 萬人患有終末期腎?。╡nd stadge renal disease，ESRD），多數(shù)患者接受血液透析治療作為腎臟替代療法［1］，其中血液透析治療需要功能良好的血管通路。根據(jù)腎臟病預后質量指南（kidney disease outcomes quality initiative，KDOQI）和 臨 床 實 踐 建 議，自 體 動 靜 脈 瘺（arteriovenous fistula，AVF）是血液透析的首選血管通路［2］，其全因死亡率較低［3］。然而，靜脈狹窄一直是AVF 失敗的主要原因。內膜增生作為AVF狹窄的始動環(huán)節(jié)，其主要細胞來源是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs），而內膜增生的生物學機制之一為炎癥［4］。研究［5］顯示：AVF 小鼠動靜脈吻合口血管內膜增生，炎癥因子水平明顯升高。去 整 合 素 金 屬 蛋 白 酶 10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）作為去整合素金屬蛋白酶超家族一員，參與調控機體炎癥等生理過程。ADAM10 能夠水解Notch 蛋白膜外段受體，激活Notch 信號通路［6］，阻斷Notch 信號通路可抑制細胞增殖，減少內膜增生［7］。Notch信號通路抑制劑DAPT 能有效阻斷Notch 介導的神經細胞炎癥［8］。由此推測，ADAM10 高表達導致Notch 信號通路激活，刺激VSMCs 增殖，導致內膜增生，進而引起動靜脈內瘺狹窄。本研究探討ADAM10 在人動靜脈內瘺狹窄處血管組織中的表達水平，通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理VSMCs 模擬體外AVF 炎癥環(huán)境，闡明沉默ADAM10 基因表達對VSMCs 細胞表型的影響及其可能的分子機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2018 年3 月—2021 年1 月因AVF 狹窄再次來本院接受手術治療的42 例終末期腎?。╡nd stadge renal disease，ESRD）患者臨床資料及臨床樣本（AVF 組），年齡29～68 歲，其中男性30 例，女性12 例；取上述42 例ESRD 患者第一次手術正常靜脈組織樣本作為正常對照組。所有患者在診斷為ESRD 后立即接受血液透析。AVF 狹窄診斷標準：①靜脈腔直徑較上游靜脈縮小50%以上；②當狹窄部位位于吻合口2 cm 以內時，該狹窄部位的血流峰值收縮速度（peaksystolicvelocity，PSV）與上游靜脈2 cm 處PSV 之比超過3.0，或當狹窄部位位于吻合口2 cm以上時，PSV 之比超過2.0；③流出道狹窄：移植物 中 部PSV<100 cm·s－1，或 遠 端 靜 脈PSV>300 cm·s－1；④在流入狹窄中，PSV 在狹窄部位增加，遠端呈單相和減少的波形，或流出吻合處移植物受壓，血流加速［9］。滿足以上任何一項即可認為AVF 狹窄。納入標準：①年齡18～80 歲；②行前臂AVF 手術；③透析時間均≥2 年，且透析頻率每周2 或3 次；④抗凝劑均使用肝素。排除標準：①患者出現(xiàn)全身感染及心力衰竭癥狀；③過去6 個月內有激素或免疫增強治療史；④收集組織后1 個月內懷孕；⑤未獲得書面同意書。術中采集靜脈組織，其中AVF 組患者取狹窄上游2 cm 處的狹窄靜脈血管組織，正常對照組患者取正常靜脈血管組織?；颊叩呐R床參數(shù)包括年齡、性別、體質量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙狀況、酒精史、糖尿病和高血壓史比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲得河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞、主要試劑和儀器人源VSMCs 購自美國ATCC 公司。si-ADAM10 干擾質粒（5′-CAGUGUGCAUUCAAGUCAA-3′）及其陰性對照si-NC（5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）由 上海吉瑪制藥技術有限公司提供，DAPT 購自美國Abcam 公司，轉染試劑Lipofectamine 2000 購自美國Thermo Fisher Scientific 公 司，ADAM10 抗 體、β-actin 抗體、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）抗體均購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，Notch 同 源 蛋 白1 （Notch homolog protein 1，Notch1）抗 體、Notch 細 胞 內 結 構 域（Notch intracellular domain，NICD）抗體和發(fā)狀分裂相關增強子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司，CCK-8 試劑盒購自北京陽光生物科技有限公司，全蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司，BCA 蛋白分析試劑盒購自北京安諾倫生物科技有限公司，ECL 試劑盒購自美國Bio-Rad 公司，RNA 提取試劑盒購自廈門艾德生物公司，Reverse Transcription System 逆轉錄試劑盒購自北京Promega 公司，SYBR?Green qPCR SuperMix 熒光定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。iMark 酶標儀購自美國Bio-Rad 公司，7500 ABI 實時 熒 光 定 量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司，CX33 顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，Tanon 5200 凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 免疫組織化學法檢測靜脈血管組織中ADAM10 蛋白表達情況利用10%甲醛室溫固定靜脈血管組織24 h，梯度乙醇脫水，進行石蠟包埋，再將5 μm 厚石蠟組織切片置于55 ℃ 烤片6 h。經二甲苯脫蠟和梯度乙醇復水后，將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中高溫修復抗原，滴 加3% H2O2室溫 孵 育15 min，5%山羊血清室溫封閉1 h，再滴加ADAM10 抗體（1∶500）于4 ℃孵育過夜。PBS緩沖液洗滌3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二級抗體（1∶5 000）室溫孵育1 h，滴加3，3′-二氨基聯(lián) 苯 胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯 色，0.5%蘇木精復染，0.1%HCl 溶液分化，自來水沖洗反藍，二甲苯透明，中性樹脂封片。利用光學顯微鏡觀察組織中陽性染色區(qū)域（棕色區(qū)域）。

1.4 細胞培養(yǎng)和LPS 濃度篩選將VSMCs 凍存管迅速放入37 ℃水浴中解凍，加入含4 mL DMEM培養(yǎng)基的離心管中，混合均勻；1 000 r·min－1離心3 min，棄上清液；加入1 mL DMEM 培養(yǎng)基混勻，移入含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至傳代2～3 次后，進行后續(xù)細胞檢測；采用0.25%胰酶消化VSMCs，計數(shù)后將1×105個細胞轉至24 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞密度接近80% 時取不同濃度（0、0.1、1.0、10.0 和100.0 mg·L－1）LPS 處理VSMCs 24 h，采用CCK-8 實驗檢測細胞增殖活性，最終確定10 mg·L－1LPS 為后續(xù)實驗的最佳干預濃度。

1.5 細胞轉染及分組處理取對數(shù)期VSMCs，以每孔1×105個細胞的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)至80%～90%匯合率，分為si-NC 組和si-ADAM10 組。提前用50 μL 減血清 培 養(yǎng) 基 （OPTI minimal essential medium，OPTI-MEMI）稀 釋3 μL 的Lipofectamine 2000，室溫孵育5 min。同時，50 μL OPTI-MEMI 培養(yǎng)基分別稀釋1 μg 質粒si-NC 和si-ADAM10，將含轉染質粒的混合物加入提前稀釋的Lipofectamine 2000 中，室溫孵育20 min。將孵育好的復合物加入含VSMCs 的6 孔細胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻后，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞采用RT-qPCR 法驗證轉染是否成功。將VSMCs 分為6 組：①對照組，VSMCs不經任何處理；②模型組（LPS 組），VSMCs 經10 mg·L－1LPS 處理24 h；③LPS+si-NC 組，轉染si-NC 質粒的VSMCs 經10 mg·L－1LPS 處理24 h；④LPS+si-ADAM10 組，轉 染si-ADAM10 質 粒的VSMCs 經10 mg·L－1LPS 處 理24 h；⑤LPS+DAPT 組，VSMCs經10 mg·L－1LPS 和10 μmol·L－1DAPT 共處理24 h；⑥LPS+si-ADAM10+DAPT組，轉染si-ADAM10 質粒的VSMCs 經10 mg·L－1LPS 和10 μmol·L－1DAPT 共處理24 h。

1.6 CCK-8 法檢測各組VSMCs 增殖活性取對數(shù)期VSMCs，按照每孔2 000 個細胞的密度接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中，每組設置3 個重復孔，分組處理后培養(yǎng)24 h。每孔中加入10 μL CCK-8 反應溶液，于37 ℃孵育4 h，使用酶標儀測定450 nm 波長處吸光度（A）值，細胞增殖活性=（加藥組A 值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組VSMCs 中ADAM10mRNA表達水平采用高效組織裂解緩沖系統(tǒng)和RNA 修復系統(tǒng)提取組織或細胞總RNA。利用Reverse Transcription System 逆轉錄試劑盒將總RNA 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，利用SYBR?Green qPCR SuperMix 試 劑 盒 進 行RT-qPCR。PCR擴增條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性 20 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，進行40 個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。ADAM10 上游引物，5′-CTGGCCAACCTATTTGTGGAA-3′，下 游 引物，5′-GACCTTGACTTGGACTGCACTG-3′；β-actin 上游引物，5′-TCCCTGGAGGCGAAGAGCTACGA-3′，下 游 引 物，5′-AGCACTGATATGTTGGCGTACAG-3′。以β-actin 為 內 參，采 用2－ΔΔCt法計算各組VSMCs 中ADAM10 mRNA 表達水平。

1.8 Transwell 法檢測各組VSMCs 遷移細胞數(shù)

取各組對數(shù)期細胞，調整細胞濃度至每毫升1×105個 細 胞，取100 μL 細 胞 懸 液 接 種 于Transwell 小 室 上 室，取600 μL 含 有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基加到下室中，于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽刮去室內未遷移的細胞，95%乙醇固定細胞30 min，0.1% 結晶紫溶液染色15 min。于200 倍光鏡下選擇5 個視野統(tǒng)計細胞數(shù)量，取平均值作為遷移細胞數(shù)。

1.9 Western blotting 法檢測各組VSMCs 中ADAM10、PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1蛋白表達水平收集各組細胞沉淀，按照全蛋白提取試劑盒說明書操作提取細胞蛋白，利用BCA 蛋白質分析試劑盒測定蛋白質濃度。取30 μg 總蛋白配備上樣體系，沸水浴變性后通過SDS-PAGE 電泳分離蛋白，采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF 膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗ADAM10（1∶1 000）、PCNA（1∶500）、MMP-9（1∶200）、Notch1（1∶1 000）、NICD（1∶1 000）、Hes1（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）于4 ℃下孵育過夜。用PBST 緩沖液洗膜3 次，加入辣根過氧化物酶結合的二級抗體（1∶10 000）于室溫下孵育1 h，隨后通過ECL 試劑盒獲取化學發(fā)光圖像，利用Image J 分析蛋白相對表達水平，以β-actin 為蛋白內參。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組靜脈血管組織和VSMCs 中相關mRNA 和蛋白表達水平、細胞增殖活性及遷移細胞數(shù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ADAM10 在人AVF 狹窄處血管組織中的表達免疫組織化學檢測結果顯示：ADAM10 蛋白主要表達于血管中膜和內膜，其中AVF 組患者靜脈血管組織中ADAM10 蛋白表達量高于正常對照組。與正常對照組比較，AVF 組患者靜脈血管組織中ADAM10 mRNA 表達水平明顯升高（P<0.05）。見圖1 和圖2。

圖1 人AVF 狹窄處血管組織中ADAM10 蛋白表達情況(免疫組織化學，×200)Fig.1 Expression of ADAM10 protein in vascular tissue at stenosis of human AVF (Immunohistochemistry,×200)

圖2 2 組AVF 狹窄處血管組織中ADAM10 mRNA 表達水平Fig.2 Expression levels of ADAM10 mRNA in vascular tissue at stenosis of AVF in two groups

2.2 不同濃度LPS 誘導VSMCs 增殖活性與0 mg·L－1LPS 處理組比較，0.1、1.0 和10.0 mg·L－1LPS 組VSMCs 細胞增殖活性明顯升高（P<0.05），其中10 mg·L－1LPS 組細胞增殖活性最高，而100 mg·L－1LPS 組細胞增殖活性明顯降低（P<0.05）。因此選擇10 mg·L－1LPS 為后續(xù)處理濃度。見圖3。

圖3 不同濃度LPS 誘導VSMCs 增殖活性Fig.3 Proliferative activities of VSMCs induced by different concentrations of LPS

2.3 ADAM10 基因沉默后VSMCs 中ADAM10 mRNA 和蛋白表達水平與對照組和si-NC 組比較，si-ADAM10 組VSMCs 中ADAM10 mRNA 和蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 ADAM10 基因沉默后VSMCs 中ADAM10 mRNA 和蛋白表達水平Fig.4 Expression levels of ADAM10 mRNA and protein in VSMCs after ADAM10 gene silencing

2.4 各組VSMCs 增殖活性和遷移能力與對照組比較，LPS 組VSMCs 增殖活性明顯升高（P<0.05），遷移細胞數(shù)均明顯增加（P<0.05）；與LPS 組和LPS+si-NC 組比較，LPS+si-ADAM10組VSMCs 增殖活性明顯降低（P<0.05），遷移細胞數(shù)明顯減少（P<0.05）。見圖5 和6。

圖5 各組VSMCs 增殖活性(A)和遷移細胞數(shù)(B)Fig.5 Proliferation activities(A) and migration numbers(B) of VSMCs in various groups

圖6 各組VSMCs 遷移形態(tài)表現(xiàn) (結晶紫，×200)Fig.6 Migration morphology of VSMCs in various groups(Crystal violet,×200)

2.5 ADAM10 基因沉默后各組VSMCs 中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平與對照組比較，LPS 組VSMCs 中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均明顯升高（P<0.05）；與LPS 組 和LPS+si-NC 組 比 較，LPS+si-ADAM10 組VSMCs 中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05）。見圖7。

圖7 各組VSMCs 中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達電泳圖和直條圖Fig.7 Electrophoregram and histograms of expressions of PCNA, MMP-9, Notch1, NICD, and Hes1 proteins in VSMCs in various groups

2.6 各組VSMCs增殖活性和遷移能力與LPS組比 較，LPS+si-ADAM10 組 和 LPS+DAPI 組VSMCs 增殖活性明顯降低（P<0.05），遷移細胞數(shù)明顯減少（P<0.05）；與LPS+si-ADAM10 組比 較，LPS+si-ADAM10 + DAPT 組VSMCs 增殖活性明顯降低（P<0.05），遷移細胞數(shù)明顯減少（P<0.05）。見圖8 和9。

圖8 各組VSMCs 增殖活性(A)和遷移細胞數(shù)（B）Fig.8 Proliferation activities(A) and migration numbers(B) of VSMCs in various groups

圖9 各組VSMCs 遷移形態(tài)表現(xiàn) (結晶紫，×200)Fig.9 Migration morphology of VSMCs in various groups (Crystal violet,×200)

2.7 抑制Notch 信號通路后各組VSMCs 中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平與LPS 組 比 較，LPS+si-ADAM10 組 和LPS+DAPI 組 VSMCs 中 PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05）；與LPS+si-ADAM10 組比較，LPS+si-ADAM10+DAPT組VSMCs中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05）。見圖10。

圖10 各組VSMCs 中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達電泳圖和直條圖Fig.10 Electrophoregram and histograms of expressions of PCNA, MMP-9, Notch1, NICD, and Hes1 proteins in VSMCs in various groups

3 討 論

AVF 是通過將血液透析患者上肢的動脈和淺靜脈吻合來建立血液透析治療的體外循環(huán)而產生的，這種人工制造的瘺管改變了淺靜脈的血流和血流動力學，但仍有部分患者的長期通暢率較低。研究［10］顯示：第1 年AVF 通暢率為62% ，第2 年為40%。多條相關信號通路參與新生內膜病理學過程，如炎癥細胞浸潤、AVF 手術損傷、尿毒癥、缺氧和血流動力學［11-12］，均能誘導平滑肌細胞、巨噬細胞和單核細胞遷移至血管內膜。在AVF 新生內膜增生的病理過程中，平滑肌細胞可分化為肌成纖維細胞，從中膜遷移到內膜并增殖，最終導致AVF 組織新生內膜增生、細胞外基質沉積、血管腔縮小和流出道阻塞［13］。因此，解決AVF 狹窄的復雜發(fā)病機制是AVF 成功的關鍵因素。

LPS 是革蘭陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，主要由脂質和多糖構成，是一種常見的內毒素，可以通過細胞信號轉導系統(tǒng)激活單核巨噬細胞、內皮細胞和上皮細胞等，合成和釋放多種細胞因子和炎性介質，進而引起機體的一系列反應［14］。因此，常利用LPS 進行炎癥疾病相關的體外造模。ADAM10-Notch 信號通路在特殊血管結構發(fā)展中發(fā) 揮 關 鍵 作 用［15］。研 究［16］顯 示：Notch 受 體 是 血管生成的關鍵調節(jié)因子，在小鼠胚胎和卵黃囊的血管生成和血管生成的早期階段具有重要作用。冠狀動脈支架內再狹窄豬模型中，冠狀動脈血管內膜中ADAM10 蛋白較狹窄段表達量增多［17］。在狹窄冠狀動脈內皮細胞中，ADAM10 蛋白表達異常升高［18］。上述研究均提示ADAM10 蛋白表達水平與冠狀動脈再狹窄密切相關。本研究結果顯示：ADAM10 在AVF 狹窄處血管組織中表達量高于AVF 非狹窄處和對照組。細胞實驗結果表明：LPS 處 理24 h 后，VSMCs 增 殖 活 性、ADAM10 mRNA 和蛋白表達水平均升高，表明ADAM10 高表達與AVF 狹窄可能有關，與以往的研究結果［17-18］一致。

Notch 受體1-4 是膜錨定轉錄因子家族的一部分，通過膜錨定Notch 配體的結合被激活［19］。Notch 配體與Notch 受體的結合觸發(fā)2 個高度協(xié)調的連續(xù)蛋白水解步驟，從其膜錨定蛋白中完成酶切過程，釋放NICD，允許其進入細胞核并激活Notch 依賴的轉錄。第1 個蛋白水解過程依賴于膜錨定ADAM10［20］，第2 個依賴于稱為早老素/γ-分泌 酶 的 膜 內 蛋 白 酶［21］。γ-分 泌 酶 在 未 進 行ADAM10 預先處理的情況下無法切割細胞外膜旁結構域中的Notch，因此ADAM10 被認為是生理Notch 信 號 的 重 要 調 節(jié) 因 子。研 究［6］顯 示：ADAM10 能通過水解Notch 蛋白膜外段受體，激活Notch 信號通路，而下調Notch 信號通路活性可抑制平滑肌細胞增殖，減少內膜增生［22］。結合前期研究［5-7，22］推測：ADAM10 過表達導致Notch 信號通路激活，炎癥水平加劇，刺激血管平滑肌細胞增殖，促進內膜增生，這可能是引起動靜脈內瘺狹窄的病理機制之一。本研究結果顯示：沉默ADAM10 表達能有效抑制LPS 處理后VSMCs 細胞增殖活性、遷移和Notch 信號通路活性。Notch信號通路抑制劑DAPT 能逆轉沉默ADAM10 對LPS 處理后VSMCs 細胞增殖活性、遷移和Notch信號通路活性的影響，說明沉默ADAM10 對AVF狹窄的作用可能與阻斷Notch 信號通路有關。但本研究僅從VSMCs 增殖活性和細胞遷移2 個方面探討沉默ADAM10 對LPS 處理后VSMCs 的影響，未涉及細胞凋亡等其他細胞行為或其他除Notch 外可能的信號通路。本課題組后續(xù)將從多方面深入探討ADAM10 對AVF 狹窄的作用及其可能的分子機制，完善分子信號通路。

綜上所述，ADAM10 在人AVF 狹窄處血管組織中高表達，沉默其基因表達可抑制LPS 誘導的VSMCs 細胞增殖和遷移，其作用機制可能與阻斷Notch 信號通路有關。