細(xì)胞凋亡相關(guān)基因CD44 在甲狀腺癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤侵襲和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系的生物信息學(xué)分析

肖志遠(yuǎn), 宋 冰, 馬鑫雨, 金連輝, 鄭 通, 柴 芳

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院甲狀腺外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤之一，其發(fā)病率位于所有癌癥中的第9 位，但其具體發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚［1］。凋亡相關(guān)基因CD44 是一種細(xì)胞表面蛋白，其表達(dá)上調(diào)與腫瘤的細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、血管生成、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)［2-3］。HU 等［4］研究顯示：CD44 蛋白的表達(dá)可能與膀胱癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。既往研究［5-6］表明：生物信息學(xué)分析對(duì)于闡明眾多差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的功能及評(píng)估THCA 發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性具有重要意義。本研究旨在應(yīng)用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)和TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD44 mRNA 在THCA 組織及癌旁組織中表達(dá)水平的差異，并通過(guò)臨床標(biāo)本驗(yàn)證（免疫組織化學(xué)SABC 法），探討CD44 蛋白與THCA 患者臨床病理特征和腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，為T(mén)HCA的診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載從 TCGA 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （https：//portal.gdc.cancer.gov/）中篩選THCA 相關(guān)的RNA 序列表達(dá)譜，得到58 種正常組織和510 種腫瘤組織。從基因集 富 集 分 析 （Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）分 子 特 征 數(shù) 據(jù) 庫(kù) v7.1 的 基 因 集“HALLMARK_ APOPTOSIS”中獲得161 個(gè)凋亡相關(guān)基因（apoptosis-related genes，ARGs）［7］。

1.2 ARGs 的選擇采用mRNA 表達(dá)譜、limma 軟件包和R 軟件（V3.6.3 版 本）中 的 Wilcoxon 秩 和t檢 驗(yàn)［|log2FC|>1，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05）］來(lái)分析THCA 隊(duì)列中表達(dá)顯著不同的ARGs。

1.3 THCA 中CD44 mRNA 的差異 表達(dá)通過(guò)分析TCGA 中CD44 mRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)檢測(cè)CD44 mRNA 在THCA 中表達(dá)。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析CD44 在THCA 樣本和正常樣本間的鑒別價(jià)值。

1.4 基因本體（Gene Ontology，GO）生物功能富集、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和GSEA 分析及蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析通過(guò)GO 富集、KEGG 通路分析和GSEA 分析評(píng)估DEGs 的潛在生物學(xué)功能，通過(guò)R 軟件包（V3.6.3 版本）進(jìn)行可視化［8-9］。使用STRING 數(shù)據(jù) 庫(kù) （http：//www.string-db.org/）中 的PPI 網(wǎng)絡(luò)確定CD44 與所選DEGs 之間的相互作用，并使用 Cytoscape 軟件（www.cytoscape.org/）進(jìn)行可視化［10-11］。

1.5 CD44 mRNA 表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating leukocytes，TILs）的關(guān)系

采用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)Immune Association 模塊中的Gene 分析CD44 mRNA 表達(dá)水平與免疫細(xì)胞（CD4+T 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、CD56 細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）浸潤(rùn)豐度的相關(guān)性?；诨虮磉_(dá)譜，通過(guò)基因組變異分析推斷出TILs 的相對(duì)浸潤(rùn)豐度。

1.6 CD44 蛋白表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因之間的相關(guān)性采用R 軟件（V3.6.3 版 本）分析THCA 中CD44 蛋白表達(dá)與47 個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因之間的相關(guān)性，結(jié)果使用熱圖可視化。

1.7 臨床資料收集錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2021 年4—9 月行手術(shù)切除的THCA 患者標(biāo)本，包括腫瘤組織和癌旁配對(duì)正常甲狀腺組織（距癌灶2 cm 內(nèi)）110 例，其中男性25 例，女性85 例，年齡（48±12）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①全部患者未行放療、化療和內(nèi)分泌等針對(duì)腫瘤的任何治療；②經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)為T(mén)HCA。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)橋本甲狀腺炎等甲狀腺相關(guān)疾??；②THCA 家族史。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：202233），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.8 主要試劑和儀器兔 抗 人CD44 （貨 號(hào)：WL03521，中 國(guó)Wanleibio 公司），HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號(hào)：111-035-003，美 國(guó)Jackson Immuno Research 公司），DAB 顯色液（貨號(hào)：DAB-1031，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），顯微鏡（型號(hào)：Eclipse Ci-L，日本尼康儀器有限公司），顯微鏡拍照系統(tǒng)（型號(hào)：Nikon DS-F12，日本尼康儀器有限公司），微波爐（型號(hào)：P70D20N1P-G5，中國(guó)格蘭仕集團(tuán)有限公司）。

1.9 免疫組織化學(xué)SABC 法檢測(cè)CD44 蛋白表達(dá)情況

將所收集的110 例THCA 組織及癌旁組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，采用10%甲醛溶液固定組織，常規(guī)脫水、透明和蠟塊包埋，以厚度為4 μm 連續(xù)切片，微波修復(fù)，3%過(guò)氧化氫孵育，血清封閉。依次添加一抗（4 °C 過(guò)夜）和二抗，DAB 顯色后，蘇木精復(fù)染后常規(guī)脫水透明中性膠封口。PBS 緩沖液取代一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法獨(dú)立閱片。判定為陽(yáng)性的結(jié)果是胞漿中具有棕黃色的顆粒沉淀。按照著色強(qiáng)度確定分級(jí)：無(wú)著色為0 級(jí)，淺黃色為1 級(jí)，黃色為2 級(jí)，棕黃色為3 級(jí)。根據(jù)細(xì)胞染色比例計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目占全部細(xì)胞的數(shù)目百分率≤9%計(jì)為0 分，10%～25% 計(jì)為1 分，26%～50%計(jì)為2 分，51%～74%計(jì)為3 分，≥75%計(jì)為4 分。著色強(qiáng)度乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分率大于3 為陽(yáng)性，其結(jié)果分為4 級(jí)：0～2 分（－），3～4 分（+），6～8 分（?），9～12 分（?）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R 軟件（V3.6.3 版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖，采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。TCGA-THCA 中CD44 mRNA表達(dá)水平和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)性指標(biāo)不符合正態(tài)分布，組間比較采用Wilcoxon 檢驗(yàn)。利用pROC包（1.17.0.1 版本）對(duì)ROC 曲線進(jìn)行CD44 臨界值檢測(cè)，用ggplot2 包（3.3.0 版本）進(jìn)行可視化。采用 Pearson 相關(guān)分析法分析CD44 mRNA 與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中THCA 與CD44 的相關(guān)性

2.1.1 THCA 組織中DEGs 的表達(dá)水平 按照篩選條件，共獲得32 個(gè)差異表達(dá)的DEGs，其中基因表 達(dá) 上 調(diào)（GPX1、CDKN1A、TGFB2、BAX、BCL2L1、CD44、ANXA1、PMAIP1、CCND2、F2R、CLU、TNFRSF12A、CCND1、ERBB3、BID、LGALS3、IGFBP6、CCNA1、TIMP1 和EREG）20 個(gè)，表 達(dá) 下 調(diào)（BMP2、AVPR1A、DCN、JUN、CTH、EGR3、IL6、CD69、ATF3、CD38、TGFBR3 和HGF）12 個(gè)，橙色代表表達(dá)上調(diào)基因，藍(lán)色代表表達(dá)下調(diào)基因，黑色代表無(wú)差異基因，568 個(gè)樣本中32 個(gè)差異表達(dá)基因熱圖見(jiàn)圖1。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中THCA 組織中DEGs 的表達(dá)Fig.1 Expression of DEGs in THCA tissue in TCGA Database

2.1.2 THCA 患者癌組織和癌旁組織中CD44 mRNA 表達(dá)水平 THCA 患者癌組織（n=58）中CD44 mRNA 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（n=58）（P<0.001）。非配對(duì)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：THCA 患者癌組織（n=510）中CD44 mRNA 的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（n=58）（P<0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 THCA 患者癌組織和癌旁組織中CD44 mRNA 表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of CD44 mRNA in cancer and paracancerous tissues of THCA patients

2.1.3 ROC 曲 線 確 定CD44 mRNA 對(duì)THCA 組織及癌旁組織的鑒別效能 ROC 曲線分析結(jié)果顯示：ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）最大為0.865（95% CI：0.833～0.897）。在臨界值為6.855 時(shí)，其靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性分別為89.71%、75.13% 和72.91%，陽(yáng) 性 預(yù) 測(cè) 值 為98.52%，陰性預(yù)測(cè)值為29.13%。見(jiàn)圖3。

圖3 CD44 mRNA 表達(dá)鑒別THCA 組織和癌旁組織的ROC 曲線Fig.3 ROC curves of expression of CD44 mRNA in THCA tissue and paracancerous tissue

2.1.4 DEGs 功能富集分析和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 GO分析主要包括細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過(guò)程（biological process，BP）3 個(gè)部分，分析結(jié)果顯示：BP 主要與外源性凋亡信號(hào)通路、線粒體釋放細(xì)胞色素C 和凋亡信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，MF主要與生長(zhǎng)因子活性、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)活性有關(guān)。GSEA 分析結(jié)果顯示：DEGs 表達(dá)與中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)有關(guān)。KEGG 分析結(jié)果顯示：DEGs主要富集在 p53 和磷脂酰肌醇 3-激酶（phospatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號(hào)通路。PPI 分析結(jié)果顯示：CD44 與DEGs 相互作用。見(jiàn)圖4。

2.2 THCA 患者CD44 mRNA 表達(dá)水平與TILs 浸潤(rùn)豐度的相關(guān)性

應(yīng)用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD44 mRNA 表達(dá)水平與7 種TILs 浸潤(rùn)豐度的相關(guān)性，結(jié)果顯示：CD44 mRNA 表達(dá)水平與B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān)關(guān)系（partial.cor>0，P<0.01），與腫瘤純度和CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)豐度無(wú)相關(guān)性（partial.cor≤0，P<0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 THCA 患者癌組織中CD44 mRNA 表達(dá)水平與TILs 浸潤(rùn)豐度的相關(guān)性Fig.5 Correlations between expression level of CD44 mRNA in cancer tissue of THCA patients and infiltration abundance of TILs

2.3 THCA 組織中CD44 蛋白表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因的關(guān)系

R 軟件分析結(jié)果顯示：在THCA 組織中CD44蛋 白 表 達(dá) 水 平 與NRP1、CD27、TNFSF15、TNFRSF25、CD276、CD200、HHLA2、TNFRSF8 和CD40 基因表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與CD274 基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.01）。見(jiàn)圖6。

圖6 THCA 患者癌組織中CD44 蛋白表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的關(guān)系Fig.6 Relationships between expression of CD44 protein and expression levels of immune checkpoint gene in cancer tissue of THCA patients

2.4 THCA 患者癌組織及其癌旁組織中CD44 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

免疫組織化學(xué)SABC 法檢測(cè)結(jié)果顯示：CD44蛋白主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，顯微鏡下可見(jiàn)黃色或棕黃色顆粒，癌旁組織局灶呈弱表達(dá)或不表達(dá)。見(jiàn)圖7。在癌組織中CD44 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于 癌 旁 組 織 ［69.09% （76/110）vs20.91%（23/110）］，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2=51.589，P<0.001）。

圖7 THCA 患者癌組織和癌旁組織中CD44 蛋白的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)，×200）Fig.7 Expressions of CD44 protein in cancer tissue and paracancerous tissue of THCA patients（Immunohistochemistry,×200）

2.5 CD44 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與THCA 患者臨床病理特征的關(guān)系

免疫組織化學(xué)SABC 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與癌旁組織比較，THCA 患者癌組織中CD44 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），與患者性別、年齡和腺外侵犯無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 THCA 患者癌組織中CD44 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between expression of CD44 protein in cancer tissue and clinicopathological characteristics of THCA patients [n(η/%)]

3 討 論

近年來(lái)THCA 的發(fā)病率迅速上升［12］，通過(guò)手術(shù)治療THCA 雖然可以取得滿(mǎn)意的效果，但甲狀腺活檢呈特殊病例亞型及并發(fā)甲狀腺局部晚期癌的患者預(yù)后仍然較差。本研究采用生物信息學(xué)方法篩選出32 個(gè)與THCA 相關(guān)的ARGs，GO 分析結(jié)果顯示：上述32 個(gè)基因主要參與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路；KEGG 分析結(jié)果顯示：32 個(gè)基因主要與p53、PI3K-Akt 和凋亡途徑信號(hào)通路有關(guān)。而PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路的過(guò)度激活在THCA 的發(fā)生 發(fā) 展 過(guò) 程 中 起 重 要 作 用［13］。RYU 等［14］研 究 顯示：CD44 mRNA 表達(dá)水平與THCA 患者的生存率有明顯相關(guān)性。CD44 是編碼人類(lèi)11 號(hào)染色體上高度保守的基因，由20 個(gè)外顯子和19 個(gè)內(nèi)含子組成，是一種非激酶細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和遷移等［15-16］。NAM 等［17］認(rèn)為：沉默CD44 mRNA 表達(dá)可以抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。CD44蛋白在膀胱癌、膽囊癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、頭頸部鱗癌和胃癌組織中廣泛高表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)［18-23］。本研究結(jié)果顯示：在THCA 患者癌組織中CD44 蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，并與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑有關(guān)，與FIGGE 等［24］研究結(jié)果一致，提示該基因在促進(jìn)THCA 進(jìn)展的過(guò)程中起到一定作用。本研究中ROC 曲線分析結(jié)果顯示：CD44 mRNA 表達(dá)水平在區(qū)分THCA 組織及癌旁組織中具有診斷意義，其靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性分別為89.71%、75.13%和72.91%。提示CD44 基因可作為一種診斷性腫瘤標(biāo)志物，用于與正常組織相鑒別。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由細(xì)胞外基質(zhì)、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞組成［25-26］。實(shí)體腫瘤中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)是TME 相關(guān)致癌機(jī)制中的關(guān)鍵因素［27］。腫瘤細(xì)胞中可通過(guò)調(diào)節(jié)TME 影響細(xì)胞凋亡，進(jìn)而產(chǎn)生促癌作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展［28］。本研究結(jié)果顯示：THCA 患者癌組織中CD44 mRNA 表達(dá)水平與TILs（B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān)關(guān)系，提示THCA 組織中CD44 mRNA 過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)TILs 的增殖，進(jìn)而改變TME，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示CD44 蛋白表達(dá)與9 個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因呈正相關(guān)關(guān)系，與1 個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示CD44 基因可能參與THCA 的免疫調(diào)節(jié)功能。上述結(jié)果顯示：CD44 蛋白可能是THCA 潛在的免疫調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，CD44 蛋白表達(dá)上調(diào)可能與THCA的發(fā)生和發(fā)展及免疫浸潤(rùn)有關(guān)。本研究為T(mén)HCA發(fā)病的分子機(jī)制研究提供了理論依據(jù)，CD44 蛋白有可能成為鑒別良、惡性甲狀腺腫瘤的分子標(biāo)志物，同時(shí)CD44 蛋白也有望成為T(mén)HCA 新的臨床治療靶點(diǎn)。本研究未能進(jìn)一步闡述CD44 蛋白作用機(jī)制及相關(guān)的信號(hào)通路，其具體的作用機(jī)制仍有待深入研究。