急性髓系白血病患者血清外泌體中miR-92a-3p 的表達及其意義

王 涵, 張亞麗, 全海薇, 母潤紅, 鄒雨彤, 夏 薇

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院血液檢驗教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一類骨髓中髓系原始或幼稚細胞惡性增殖抑制骨髓正常造血功能的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，AML 的臨床診斷主要應(yīng)用骨髓細胞學(xué)檢查，因其影響因素較多，需開發(fā)一種靈敏度高、特異度強的診斷指標(biāo)用以輔助急性白血病的早期診斷。外泌體是細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，直徑為30～150 nm，與細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中并發(fā)揮作用，可在細胞間進行物質(zhì)傳遞及細胞間通訊。作為近年研究熱點，外泌體獨特的分子特征可以改變正?；驉盒允荏w細胞的細胞功能。同時，外泌體能夠影響白血病細胞的生長和分化，該能力使其可作為診斷白血病的生物標(biāo)志物［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是真核生物中一類內(nèi)源性非編碼RNA，可調(diào)控細胞的多種生物學(xué)功能［2］。miRNA 在腫瘤細胞中的調(diào)節(jié)作用也同樣影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后［3］。一些miRNA 已被證實在AML 中明顯表達失調(diào)，但其具體調(diào)控機制尚未明確。因此，靶向miRNA 分子可能是一個很有前景的腫瘤診斷和治療方向。研究［4-5］表明：在一些腫瘤疾病中，miR-92a-3p 表達與正常人比較會有不同程度的升高或降低。有研究者通過組蛋白去乙 酰 酶2 （histone deacetylase 2，HDAC 2）構(gòu) 建U937 白血病細胞株，評估其miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測miR-92a-3p 為AML 中 的 潛 在 調(diào) 節(jié) 因 子［6］。研究［7］顯示：circ_0002232 的表達水平與磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）表達水平呈正相關(guān)關(guān)系，與miR-92a-3p 表達水平呈負相關(guān)關(guān)系，并預(yù)測circ_0002232/miR-92a-3p/PTEN 可能是AML 中的潛在關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。但目前對于miR-92a-3p 為AML 中的調(diào)節(jié)因子的預(yù)測尚未被證實。因此，本研究結(jié)合外泌體中miRNA 穩(wěn)定存在和不易降解的特征［8］，對AML 患者血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平進行分析，以期為AML 的發(fā)病機制、病程進展和作用靶點的研究提供依據(jù)，也為AML的臨床診斷和治療提供方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集的血清標(biāo)本來自2020 年2 月—2021 年9 月期間北華大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院的AML 患者51 例（AML 組），以同期健康體檢志愿者34 名作為對照組。AML 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)等檢查確診；②初診和初治患者；③患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他惡性腫瘤或血液疾病；②肝腎功能異常；③年齡<18 歲。AML 組：男性24 例，女性27 例，年齡18～60 歲，平均年齡（41.29±11.70）歲；對照組：男性19 例，女性15 例，年齡18～69 歲，平均年齡（42.26±10.42）歲；2 組研究對象性別構(gòu)成和年齡分布等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究通過北華大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器抗CD63 抗體和抗CD9 抗體 購 于 英 國 Abcam 公 司，TRIzol 試 劑、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis 和TB Green Premix Ex TaqⅡ試劑盒購于日本TaKaRa 公司，引物購于生工生物工程（上海）有限公司；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（型號：5100）和超速離心機（型號：26616）購于美國Thermo 公司，透射電子顯微鏡（型號：HT7700）購于日本Hitachi 公司，臺式高速微量離心機（型號：D3024）購于美國Scilogex 公司，納米粒度分析儀（型號：Nanotrac wave Ⅱ）購于美國Microtrac 公司，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（型號：MicroChemi 4.2）購于美國MicroChemi 公司。

1.3 標(biāo)本處理采集AML 患者及志愿者靜脈血緩慢滴于EP 管中，4 ℃放置析出血清；4 ℃、5 000 r·min－1離心10 min，取上清；4 ℃、3 000 r·min－1離心10 min，取上清，于－80 ℃條件下凍存。

1.4 外泌體提取采取差速離心法［9］提取外泌體。取出經(jīng)過處理的血清樣本，冰上融化。4 ℃、2 000 g 離心 30 min，取上清。4 ℃、12 000 g 離心45 min，轉(zhuǎn)移上清至無菌超離管。4 ℃、110 000 g，離心2 h，棄上清留沉淀。用1 mL PBS 緩沖液重懸沉淀并使用快速振蕩器充分混勻，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾。過濾后的懸液4 ℃、110 000 g 離心70 min，棄上清。100 μL PBS 緩沖液重懸外泌體，使用快速振蕩器充分震蕩混勻，于－20 ℃條件下保存。

1.5 透射電子顯微鏡觀察外泌體超微結(jié)構(gòu)將外泌體吸取適量滴加在銅網(wǎng)上，室溫環(huán)境下靜置1 min，滴加磷鎢酸鈉溶液負染5 min，使用濾紙輕輕吸去余液，透射電子顯微鏡觀察外泌體超微結(jié)構(gòu)。

1.6 納米粒度分析儀檢測外泌體粒徑納米粒度分析儀樣品室注入無氣泡純水200 μL 清洗，清洗后吸出擦干，PBS 緩沖液調(diào)零；加入經(jīng)PBS 緩沖液 1∶10 稀釋的外泌體溶液200 μL 進行粒徑檢測。

1.7 Western blotting 法檢測外泌體中CD63 和CD9 蛋白表達情況采用Western blotting 法檢測外泌體中。采用RIPA 裂解液將外泌體膜裂解，加入5×Loading Buffer 混合，100 ℃水浴15 min。上樣后設(shè)置電壓，4%濃縮膠電壓80 V、10%分離膠部分設(shè)置電壓100 V 電泳；采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫環(huán)境放置搖床封閉2 h；5%脫脂牛奶稀釋一抗（1∶1 000），4 ℃搖床過夜；加入5%脫脂奶粉開啟搖床清洗20 min，重復(fù)3 次；將膜放入配制好的5%脫脂牛奶稀釋二抗（1∶2 000）中，充分混勻，室溫環(huán)境開啟搖床孵育1 h；加入5%脫脂牛奶開啟搖床清洗5 min；開啟搖床PBS緩沖液清洗5 min，重復(fù)2 次；配制發(fā)光底物，利用成像系統(tǒng)進行顯影，觀察CD63 和CD9 蛋白表達情況。

1.8 外泌體中miR-92a-3p 提取在含外泌體的EP 管中加入1 mL TRIzol，充分混勻后于冰上靜置5 min；轉(zhuǎn)移至無酶EP 管中，加入200 μL 預(yù)冷氯仿，顛倒混勻，冰上靜置15 min；4 ℃、12 000 r·min－1離心15 min；吸取上層無色水相至無酶EP 管，加入500 μL 預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，冰上靜置20 min；4 ℃、12 000 r·min－1離心10 min；棄上清，加入75%乙醇（DEPC 配制）1 mL 洗滌管內(nèi)白色膠狀沉淀，4 ℃、7 500 r·min－1離心5 min；棄上清加DEPC 水充分混勻，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的樣本外泌體總RNA 逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束后加入90 μL ddH2O 補足至100 μL，分裝后－20 ℃條件下保存。

1.9 RT-qPCR 法檢測外泌體中miR-92a-3p 表達水平使用RT-qPCR 儀，以U6 為內(nèi)參基因，檢測miR-92a-3p 表 達 水 平，引 物 序 列 見 表1。miR-92a-3p 表 達 水 平 采 用2－ΔΔCt法 計 算。ΔΔCt=（實驗組目的基因Ct 值－實驗組內(nèi)參基因Ct 值）－（對照組目的基因Ct 值－對照組內(nèi)參基因Ct 值）。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。2 組研究對象血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)［四分位數(shù)］［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評價診斷效能。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體超微結(jié)構(gòu)透射電子顯微鏡下觀察到外泌體呈圓形且中間凹陷的膜狀結(jié)構(gòu)，粒徑分布30～150 nm。見圖1。

圖1 透射電子顯微鏡下外泌體形態(tài)表現(xiàn)（Bar=100 nm）Fig.1 Morphology of exosomes under transmission electron microscope（Bar=100 nm）

2.2 外泌體的粒徑通過納米粒度分析儀檢測得到的外泌體樣品粒徑為30～100 nm，與透射電子顯微鏡所觀察到的平均粒徑基本相同。見圖2。

圖2 納米粒度分析儀檢測提取的外泌體粒徑Fig.2 Sizes of extracted exosomes detected by nanoparticle analyzer

2.3 Western blotting 法檢測2 組研究對象血清外泌體中CD63 和CD9 蛋白表達應(yīng)用Western blotting 法檢測所提取外泌體中蛋白表達水平，所提取外泌體中出現(xiàn)條帶，證明所提取外泌體中有CD63 和CD9 蛋白表達。見圖3。

圖3 Western blotting 法檢測2 組研究對象血清外泌體中CD63 和CD9 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of CD63 and CD9 proteins in serum exosomes of subjects in two groups detected by Western blotting method

2.4 2 組研究對象血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平AML 組患者血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平［0.273（0.128，0.476）］明顯低于對照組［1.061 （0.704，1.554）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-6.427，P<0.01）。

2.5 AML 患者血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平在AML 中的診斷價值根據(jù)AML 患者血清外泌體miR-92a-3p 表達水平構(gòu)建ROC 曲線，選取靈敏度和特異度總和最高時所對應(yīng)的血清外泌體miR-92a-3p 表達水平為最佳臨界值，結(jié)果顯示：血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平對AML 診斷的最佳臨界值為0.51，其靈敏度為76.47%，特異度為94.12%，ROC 曲 線 下 面 積（area under curve，AUC）為0.913 （95%CI：0.856，0.971）（P<0.001），診斷效能良好，見圖4。

圖4 AML 患者血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平診斷AML 的ROC 曲 線Fig.4 ROC curve of AML diagnosed by expression level of miR-92a-3p in serum exosomes of AML patients in diagnosis of AML

3 討 論

AML 是一類造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，影響正常髓系細胞分化、增殖和凋亡等，并且伴隨著細胞遺傳學(xué)異常和突變［10］。AML 發(fā)病率和死亡率極高，因此對其早期診斷和早期治療策略尤為重要。脫離細胞和蛋白水平的局限，一些miRNA 表達上調(diào)或下調(diào)也影響AML 的發(fā)生和發(fā)展進程［11-12］，miRNA也將成為對AML 診斷、治療和預(yù)后判斷的重大突破。

外泌體具有多種生物學(xué)功能和獨特的遺傳特征，可影響白血病細胞生長和分化，調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境，抑制骨髓造血等，可作為白血病的臨床診治靶點［13-14］。外泌體源miRNA 由外泌體包裹轉(zhuǎn)移至細胞外，能夠穩(wěn)定地存在于體液和組織中，不易降解，同時擁有較高水平［15-17］。血清miRNA 和外泌體miRNA 的結(jié)合也成為研究熱點，血清中提取的外泌體miRNA 也具有良好的診斷價值。

本研究采用RT-qPCR 法檢測51 例AML 和34 名同期健康體檢志愿者血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平，結(jié)果顯示：AML 組患者血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平明顯低于對照組，提示血清外泌體中miR-92a-3p 在AML 的發(fā)生過程中為抑癌基因，與miR-92a-3p 在其他腫瘤疾病中的表達呈下調(diào)的研究結(jié)果一致［18-21］。

外泌體中富集miRNA，且外泌體膜能夠使miRNA 免受RNA 酶的降解［22-24］。血清外泌體衍生的miRNA-532 可 作 為AML 新 的 生 存 預(yù) 測 因 子［25］。在血清中采用外泌體miRNA 作為生物標(biāo)志物基于其高穩(wěn)定性和特異性。在AML 中可能存在Circ_0002232/miR-92a-3p/PTEN 的潛在關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)［7］；miR-92a-3p 也影響白血病的耐藥機制，血清外泌體中miR-92a-3p 可能是白血病患者伊馬替尼耐藥的潛在生物標(biāo)志物［25］。血清中miR-150 和miR-342 的組合是臨床診斷AML 的新的候選生物標(biāo)志物［26］。通過干擾受體細胞對外泌體miRNA 的攝取，從而調(diào)控靶基因，可以提高白血病細胞的藥物敏感性，擴展白血病治療的概念，為白血病早期診斷、病程發(fā)展、治療及預(yù)后提供了新方向［27-29］。

綜上所述，AML 患者血清外泌體中miR-92a-3p 表達水平降低，有抑癌作用，可能成為AML 潛在的診治靶點，為其臨床推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。今后，可進一步研究AML 細胞來源的外泌體在蛋白質(zhì)及RNA 等內(nèi)含物的表達譜，探討其關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，以AML 特異性外泌體miRNA 為靶點，探討其信號傳導(dǎo)途徑，尋找靈敏度高的血清外泌體miRNA 作為非侵襲性生物標(biāo)志物，進一步論證外泌體miR-92a-3p 在AML 治療及預(yù)后中的意義。