溫補脾腎經(jīng)驗方治療視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

宮玉霜, 付業(yè)繁, 許會靜, 郭 健, 相 琳, 胡 睿, 樊 睿, 王 捷, 李 淼, 孫美艷

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130033；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院實驗中心，吉林 吉林 132013；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130033）

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾?。╪euromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是一種罕見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病，呈復(fù)發(fā)-緩解病程，可導(dǎo)致失明及長節(jié)段脊髓損傷［1-2］。NMOSD 好 發(fā) 于32.6～45.7 歲 女 性 人 群［3］，其 發(fā) 病機制尚未完全明確。目前主要通過糖皮質(zhì)激素和血漿置換等方法緩解急性期癥狀，緩解期多以免疫抑制劑和單克隆抗體進行治療，但以上治療費用高昂且效果不佳，甚至存在嚴重不良反應(yīng)。因此，如何為NMOSD 患者提供安全有效的治療方法仍是臨床面臨的一大難題。NMOSD 在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中屬于“痿病”“暴盲”范疇［4］。研究［5］顯 示：NMOSD以“脾腎陽虛”“痰淤濕熱”等為病機?！鹅`樞·海論》云：“髓海不足，目無所見，懈怠安臥”。中醫(yī)學(xué)認為：腎藏精，為先天之本，主骨生髓，腎陽虛衰，髓?？仗?，不能充髓生骨，則會腰膝酸軟，肢冷麻木無力，發(fā)為痿病，髓?？仗撘嗖荒艹漯B(yǎng)睛目，目失所養(yǎng)而視物模糊，發(fā)為青盲病?！饵S帝內(nèi)經(jīng)靈樞·本神》記載：“脾虛則四肢不用。若脾虛弱，則氣血乏源，運化布散精氣失司，則視物昏花、肌肉筋骨痿弱麻木無力”，因此導(dǎo)致視力障礙和運動障礙，治療上則以“補脾益腎、填精補髓”為治療要點。由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中醫(yī)科教授親自擬定的由15 味中藥組成的溫補脾腎經(jīng)驗 方 （Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription，TSKEP），主要被用于近5 年來明確診斷為NMOSD 且于門診復(fù)診的約30 例患者。其中熟地黃滋陰填精益血、補益肝腎；黃連及三顆針清熱燥濕、瀉火解毒；黃芪可大補元氣、健脾益氣；茯苓及白術(shù)滲濕健脾以杜生痰之源；當(dāng)歸養(yǎng)血活血。諸藥合用，可改善NMOSD 患者臨床癥狀，減輕神經(jīng)功能缺損，降低復(fù)發(fā)頻率，臨床療效顯著。鑒于中藥方劑多組分和多靶點的作用特點，TSKEP 治療NMOSD 的效果及發(fā)病機制尚未完全明確。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法構(gòu)建多維靶點網(wǎng)絡(luò)，探索TSKEP 治療NMOSD 的效果及其作用機制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器SPF 級C57BL/6 雌性小鼠，體質(zhì)量（25±5）g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2021-0001。實驗由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會審查批準，編號：2017-104。小鼠分為對照組、NMOSD組和TSKEP組，每組6只。2019 年10 月—2021 年10 月 收 集10 例NMOSD 患 者 和10 名健康志愿者的血清標本，10 例患者均在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診并參照2015 年NMOSD 的診斷標準明確診斷為抗水通道蛋白4 抗體（antiaquaporin 4-immunoglobulin，AQP4-IgG）陽 性 的NMOSD。本研究使用的人血清標本獲得吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會批準，編號：2017022238。

TSKEP 由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)系制備，中藥復(fù)方由15 味中藥組成：熟地15 g，千金藤30 g，山梔10 g，枸杞15 g，牡丹皮10 g，當(dāng)歸15 g，黃連10 g，十大功勞葉30 g，三顆針30 g，黃芪30 g，黨參30 g，生地15 g，茯苓10 g，白術(shù)15 g，黃柏10 g。所有中藥藥材均購自北京同仁堂股份有限公司并經(jīng)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中醫(yī)科主任醫(yī)師、副教授馮桂梅鑒定，均符合《中國藥典》要求。中藥原材料混合，加潔凈的冷水浸泡30～60 min 后，每劑藥煎2～3 次，首次煎煮加水至超過藥物表面3～5 cm；第2 和3 次煎煮加水 至 超 過 藥 物 表 面1～2 cm，煎煮時沸前用強火，沸后用文火。每次煎煮濾出藥汁150～200 mL，煎后將3 次藥汁混合。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進行濃縮并在烘箱中 60 ℃烘干至粉末狀，置于4 ℃冰箱中備用。每1 g 干提取物含有3.56 g 生藥材，臨用前用水配置成相應(yīng)濃度藥液。Melon Gel IgG 純化試劑盒（賽默飛世爾科技公司，商品號45206），增強型 BCA 蛋白檢測試劑盒（碧云天科技公司，商品號P0010），髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白肽 MOG35-55（由上海頂肽生物技術(shù)公司合成），酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司），蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，商品號C0105S）。Amicon Ultra 離心過濾器（美國密理博科技公司，商品號ES-A01-4243），SpectraMax M5/M5e 多 功 能 酶 標 儀 （美 國Molecular Devices 公司），伯樂Mini-PROTEAN?Tetra小型垂直電泳套裝（美國伯樂公司），5418R 型Eppendorf 高速冷凍離心機（德國艾本德公司），ChemiDocTMMP 型全能成像系統(tǒng)（美國伯樂公司），愛華QPJ-1C 石蠟切片機（天津愛華醫(yī)療器械有限公司），HH-MMB-2 型移動式微屏障鼠籠（蘇州猴皇動物實驗設(shè)備科技有限公司）。

1.2 NMOSD 動物模型制備及給藥方式用PBS緩沖液稀釋 MOG35-55至終濃度為0.5 g·L－1，并與含有 12.5 g·L－1熱滅活結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）1∶1 混合，充分乳化，誘導(dǎo)實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmue encephalomyelitis，EAE）模型［6］。分別于小鼠背部中線兩側(cè)皮下注射100 μL乳化液，免疫當(dāng)天（第0 天）和48 h（第2 天）腹腔內(nèi)注射百日咳毒素（PTX，每只300 ng）。對照組小鼠以生理鹽水代替。免疫第5～7 天，實驗組小鼠腹腔注射 NMO-IgG［7］（4 g·L－1PBS 緩沖液）和10 μL 人補體，對照組以IgG（4 g·L－1PBS 緩沖液）代替。NMO-IgG 和IgG 分別來自于NMOSD患者和健康志愿者血清，利用Melon Gel IgG 純化試劑盒和Amicon Ultra 離心過濾器純化濃縮［8］。根據(jù)人與小鼠的體表面積折算等效劑量確定給藥濃度和劑量［9］，即TSKEP 組小鼠在免疫第5 天開始以灌胃方式連續(xù)給予TSKEP（15.6 g·kg－1體質(zhì)量）26 d。對照組和NMOSD 組每天灌胃等量生理鹽水，在免疫第30 天處死所有小鼠。

1.3 動物行為學(xué)觀察免疫當(dāng)天開始每日觀察小鼠發(fā)病情況，同時采用5 分法記錄神經(jīng)功能評分［10］。評分標準：0 分為無明顯異常；0.5 分為尾巴略微無力或步態(tài)略有異常；1.0 分為尾巴無力或尾巴略微無力且輕度后肢麻痹；1.5 分為尾巴無力且后肢輕度麻痹；2.0 分為尾巴無力伴中度后肢麻痹；2.5 分為后肢麻痹，但有部分腿部活動；3.0 分為后肢麻痹且無活動；3.5 分為后肢麻痹且前肢輕度麻痹；4.0 分為四肢完全麻痹，但頭部有一定活動；4.5 分為垂死；5.0 分為死亡。

1.4 HE 染色觀察各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)免疫第30 天處死小鼠，4%甲醛灌注。取出小鼠腦組織后石蠟包埋，常規(guī)處理，制備成厚度為5 μm 切片進行HE 染色，顯微鏡下觀察。根據(jù)病理評分評估腦組織病理學(xué)改變。病理評分標準：0 分為無炎性細胞；1 分為散在的炎性細胞（輕度）；2 分為血管周圍炎細胞浸潤，有“袖套樣”改變（中度）；3 分為致密的炎性細胞浸潤和實質(zhì)壞死（嚴重）。

1.5 TSKEP 潛在活性化學(xué)成分及靶點篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺［11］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以 口 服 生 物 利 用 度（oral bioavailability，OB）≥30% 和 藥 物 相 似 性（drug-likeness，DL）≥0.18 等 毒 藥 物 動 力 學(xué)ADME （Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion）參數(shù)［12］作為篩選條件，依次檢索熟地、黃芪和黨參等15 味中藥的活性化學(xué)成分及其 對 應(yīng) 靶 點，借 助STRING v11.0b 數(shù) 據(jù) 庫［13］（https：//cn.string-db.org/）將得到的靶點轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名，匯總?cè)ブ睾蟮玫饺降幕钚曰瘜W(xué)成分和靶點。

1.6 NMOSD 相關(guān)靶點以視神經(jīng)脊髓炎、視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病、NMO 和NMOSD 為關(guān)鍵詞，利用DisGeNET v7.0［14］（https：//www.disgenet.org）、GeneCard v5.3［15］（https：//www.genecards.org）、The Online Mendelian Inheritance in Man［16］（OMIM，https：//mirror.omim.org）和Drugbank v5.1.8［17］（https：//www.drugbank）數(shù)據(jù)庫進行檢索，匯總?cè)ブ睾蟮玫絅MOSD 相關(guān)靶點。

1.7 TSKEP 治療NMOSD 潛在靶點的獲取利用在線網(wǎng)站Venny 2.1.0［18］（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪 制TSKEP治療NMOSD 相關(guān)靶點的韋恩圖，得到交集靶點。

1.8 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，并進行拓撲結(jié)構(gòu)分析，挑選度值（degree）較高的化合物，從而尋找發(fā)揮重要作用的核心活性成分。

1.9 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將TSKEP 治療NMOSD 的潛在作用靶點映射到STRING 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)定最低的置信區(qū)間為0.7（置信度高），得到的數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件生成PPI 網(wǎng)絡(luò)并使用Network Analyzer 插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析。拓撲特征包括3 個參數(shù)：degree 值、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）和 接 近 中 心 性（closeness centrality，CC），上述3 個參數(shù)是新藥發(fā)現(xiàn)和靶點預(yù)測的關(guān)鍵指標［19］，其中節(jié)點的大小代表degree 值，節(jié)點越大，表示degree 值越大。通過拓撲結(jié)構(gòu)分析來確定PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。

1.10 潛在核心靶點基因本體論（Gene Ontology，GO）功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析將潛在核心靶點導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫中進行GO 和KEGG 通路富集分析，GO 包括分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組成（cellular component，CC）［20］。利 用OmicShare 云平臺（https：//www.omicshare.com/）對富集分析結(jié)果進行可視化處理。

1.11 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將Omicshare 平臺輸出的KEGG 通路富集結(jié)果進行分析，選擇最相關(guān)的通路信息整理成表格，輸入到Cytoscape 3.6.0 軟件中得到靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.12 分子對接篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)及靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中degree 值較高的核心靶點與化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中degree 值較高的核心化合物進行分子對接驗證。在PDB 數(shù) 據(jù) 庫［21］（https：//www.rcsb.org/）中 找到核心靶點的PDB 文件，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫［22］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到核心化合物的sdf 文件，基于AutoDock Tools 軟件進行分子對接。以結(jié)合能評價化合物與靶點結(jié)合能力的高低，結(jié)合能<0 表明可以自由結(jié)合，結(jié)合能越低，結(jié)合活性越強，受體與配體之間的親和力越大，二者之間發(fā)生相互作用的可能性越大，結(jié)合能小于?5 kcal·mol?1表明結(jié)合良好。

1.13 ELISA 法檢測各組小鼠血清中細胞因子水平分別在免疫第5、15 和30 天收集小鼠尾靜脈血，室溫下靜置20 min，使血液凝固。4 ℃、1 000 g離心10 min（離心半徑=10 cm），去除血清中的凝塊。采用腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素10 （interleukin-10，IL-10）和白細胞介素17 （interleukin-17，IL-17）ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中相應(yīng)細胞因子水平。

1.14 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠神經(jīng)功能評分、病理學(xué)評分及血清中炎性細胞因子水平等數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能評分對照組小鼠在免疫后30 d 內(nèi)無神經(jīng)功能障礙。NMOSD組和TSKEP組小鼠在造模后第6 天開始陸續(xù)發(fā)病，疾病程度逐漸加重，表現(xiàn)為尾巴無力、四肢不同程度麻痹、精神萎靡和活動減少等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。NMOSD 組小鼠最高神經(jīng)功能評分為3.5 分。TSKEP 組小鼠平均神經(jīng)功能評分第11～30 天均低于NMOSD 組，從第17 天開始到實驗結(jié)束與NMOSD 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)功能評分Fig.1 Neurological function scores of mice in various groups

2.2 各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織切片HE 染色結(jié)果（圖2），對照組小鼠腦結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)膠質(zhì)細胞均勻分布；NMOSD 組小鼠腦組織中有大量炎性細胞浸潤，有部分細胞核固縮，病理學(xué)評分為（2.83±0.41）分；與NMOSD 組比較，TSKEP 組小鼠腦組織中炎性細胞浸潤程度明顯減輕，病理學(xué)評分［（1.33±0.52）分］明顯降低（P<0.05）。

圖2 各組小鼠大腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×100）Fig.2 Pathomorphology of brain tissue of mice in various groups(HE，×100)

2.3 TSKEP 中潛在活性成分及靶點根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 的條件在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，剔除重復(fù)項后TSKEP 中共得到304 個活性化合物和655 個有效活性成分對應(yīng)的靶點。

2.4 TSKEP 治療NMOSD 的潛在靶點在DisGeNET、GeneCard、OMIM 和Drugbank 數(shù) 據(jù)庫中分別檢索到171、171、84 和3 個NMOSD 相關(guān)的靶點，刪除重復(fù)項后共得到358 個疾病靶點。將疾病靶點與藥物靶點取交集，共獲得TSKEP 治療NMOSD 的潛在靶點43 個。見圖3。

圖3 655 個藥物靶點（A）和358 個疾病靶點（B）的共同靶點基因Fig.3 Common target genes of 655 drug targets (A) and 358 disease targets (B)

2.5 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過Cytoscape 3.6.0 軟件對化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，以degree 值和CC 值作為拓撲分析的主要參考指標，結(jié)合degree 值和CC 值篩選，包括槲皮素（Quercetin）、山柰酸（Kaempferol）和木犀草素（Luteolin）等在內(nèi)的12 種化合物，均具有較高的degree 值和CC 值，可能是TSKEP 治療NMOSD的核心活性成分。見表1。

表1 TSKEP 核心化合物的相關(guān)參數(shù)Tab.1 Related parameters of core compounds of TSKEP

2.6 GO 和KEGG 富集分析以P值作為篩選條件并按照P值大小進行排列，GO 功能富集分析分別選取BP、CC 和MF 的前20 條通路進行展示（圖4A～C），TSKEP 治療NMOSD 主要作用于以下環(huán)節(jié)：①對外界刺激的反應(yīng)調(diào)控、對有機物質(zhì)反應(yīng)及對化學(xué)刺激的細胞應(yīng)答反應(yīng)等生物過程；②細胞外間隙、細胞外區(qū)部分及細胞組分、胞漿內(nèi)部分等細胞組成；③細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、受體調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)控和信號受體結(jié)合等分子功能等。以P<0.05 作為篩選條件并按照P值大小展示前20 條KEGG 通路（圖4D），共同靶點主要通過細胞因子受體相互作用、Toll 樣 受 體（Toll-like receptor）信 號 通 路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Jak-STAT 信號通路和核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路等多條信號通路在NMOSD 的治療中發(fā)揮重要作用。見表2。

表2 核心靶點的KEGG 代謝通路相關(guān)參數(shù)Tab.2 Related parameters of KEGG metabolic pathways of core targets

圖4 43 個候選靶點的GO 和KEGG 富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of 43 candidate targets

2.7 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將14 條顯著富集的信號通路及對應(yīng)的靶點導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.0 軟件中，得到靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。根據(jù)degree 值篩選核心成分，結(jié)果提示IL-6、IL-1β、TNF、IL-4和PIK3CA 等degree 值較高，可能在中藥復(fù)方治療NMOSD 中發(fā)揮主要作用。

圖5 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Target-pathway network diagram

2.8 分子對接將9個核心靶點（IL-6、TNF-α和IL-1β 等）與10 個核心化合物（槲皮素、芹菜素、大豆黃酮和木犀草素等）進行分子對接來評估化合物與靶點的結(jié)合能力。結(jié)果提示：所有對接結(jié)合能均<－5 kcal·mol－1，說明核心靶點與核心化合物之間具有較好的親和力。其中，IL-6 與槲皮素、ALB 與 芹 菜 素、IL-10 與 豆 甾 醇、IL-1β 與 木 犀 草素、C-X-C 基序趨化因子配體10 （C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）與β-谷甾醇之間具有相對較好的結(jié)合能力，部分分子對接模式圖見圖6。

圖6 分子對接結(jié)果示意圖Fig.6 Schematic diagrams of molecular docking

2.9 各組小鼠血清中細胞因子水平造模后第5、15 和30 天，與正常組比較，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α 和IL-17 水平明顯升高（P<0.01），IL-10 水平明顯降低（P<0.01）；與NMOSD 組比較，TSKEP 組 小 鼠 血 清 中IL-6、TNF-α 和IL-17 水平明顯降低（P<0.05 或P<0.01），IL-10水平明顯升高（P<0.01）。見圖7。

圖7 各組小鼠不同時間點血清中IL-6（A）、TNF-α(B)、IL-10(C)和IL-17(D)水平Fig.7 Levels of IL-6（A）, TNF-α(B), IL-10(C), and IL-17(D) in serum of mice in various groups at different time points

3 討 論

本研究首先對TSKEP 治療NMOSD 的效果進行了實驗驗證，結(jié)果顯示：TSKEP 可以明顯減緩NMOSD 模型小鼠的神經(jīng)功能障礙，降低腦組織中炎性細胞的浸潤程度，下調(diào)血清中炎性因子水平，表明TSKEP 在治療NMOSD 方面具有一定的效果。TSKEP 中的黃芪可有效降低血清IL-6 和TNF-α 水平，減輕全身炎癥反應(yīng)。在自身免疫性脊髓炎模型中，黃芪可明顯抑制IL-17、IL-23 和單核細胞趨化蛋白 （monocyte chemoattractant protein，MCP）的表達，降低血清中的氧自由基，同時增加損害性細胞凋亡，減少神經(jīng)阻滯［23］。本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示：槲皮素、木犀草素、豆甾醇、芹菜素和β-谷甾醇等與核心靶點之間具有較好的結(jié)合能力。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，可減輕由雙環(huán)己酮草酰二腙（cuprizon，CPZ）誘導(dǎo)的脫髓鞘模型小鼠的髓鞘損傷，促進髓鞘再生，有一定的神經(jīng)保護作用［24］。槲皮素能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB 的活性，在mRNA 和蛋白水平抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶2 和C 反應(yīng)蛋白的表達，發(fā)揮抗炎作用［25-26］，同時可抑制IL-6 的合成和分泌，從而在炎癥早期減輕炎癥反應(yīng)［27］。植物甾醇是一類具有多種功效的天然化合物，其中含量最為豐富的是豆甾醇和β-谷甾醇。β-谷甾醇可通過抑制多種細胞因子和信號通路的活化，導(dǎo)致細胞中IL-6、TNF-α 和IL-1β 等細胞因子合成明顯減少而起到抗炎作用［28］。同時豆甾醇也可調(diào)節(jié)各種炎性因子而發(fā)揮抗炎作用［29］。木犀草素是一類天然黃酮類化合物，已被證實可通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)（IL-6、IL-4和TNF-α 等炎性因子）發(fā)揮抗炎作用，并能通過抑制NF-κB 的活化來調(diào)節(jié)NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以抑制促炎基因的表達［30］，同時還具有神經(jīng)保護作用。以上研究結(jié)果表明：TSKEP 中的有效活性成分可能是通過抗炎和促進髓鞘再生等發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

PPI 網(wǎng)絡(luò)和靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示：IL-6、IL-1β、IL-10、TNF- α、IL-4、白 蛋 白（albumin，ALB）、胰 島 素 （insulin，INS）和CXCL10 等可作為TSKEP 治療NMOSD 的關(guān)鍵靶點。多種炎性細胞因子在NMOSD 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)細胞因子參與神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)和再生過程［31］。IL-10 可通過代謝重組對巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用。IL-6 作為重要的核心靶點，是免疫系統(tǒng)中的多效細胞因子，參與抗體的產(chǎn)生和T 細胞的活化［32-33］。研究［34-36］顯示：NMOSD 患者血清和腦脊液中較高的IL-6 水平可能與神經(jīng)功能的缺損有關(guān)。IL-1β 和TNF-α 是一類促炎細胞因子，IL-1β 能夠招募白細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。IL-1β 可通過激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋 白（cAMP-response element binding，CREB）和NF-κB 促進血漿上皮嗜中性粒細胞活化肽78（epithelial neutrophil activating reptide 78，ENA78）的表達，同時IL-1β 和TNF-α 在中性粒細胞募集的過程中可促進激肽B1 受體（kinin B1 receptor，KB1R）蛋白表達，從而提高中性粒細胞的活性，誘 導(dǎo) 中 性 粒 細 胞 的 黏 附 和 遷 移［37］。TNF-α 與IL-17A 具有協(xié)同作用，參與輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本研究經(jīng)動物實驗驗證TSKEP 可降低外周血中多種炎性細胞因子（IL-6、IL-1β 和TNF-α）的表達，由此減輕緩解期NMOSD 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而改善神經(jīng)功能損傷。

本研究KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示：富集的通路主要與感染性疾病、免疫系統(tǒng)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，包括IL-17 信號通路、Jak-STAT、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B （protein kinase B，Akt）、TNF 和NF-κB 等多條信號通路。IL-17 是一種重要的促炎癥細胞因子，由Th17 和先天性免疫細胞等分泌，IL-17 與相關(guān)的IL-17R 結(jié)合通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體IL-17R-Act1-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）激活下游NF-κB 和MAPK 等信號通路，以誘導(dǎo)多種細胞因子的表達，并在多種自身免疫性疾病的炎癥病理過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究動物實驗驗證TSKEP 可通過對IL-17 相關(guān)信號通路的調(diào)控降低血清細胞因子在外周血中的表達。另外，Jak-STAT、PI3K-Akt、TNF-α 和NF-κB 等信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)功能有密切關(guān)聯(lián)，可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、生長，以及促進軸突生長和神經(jīng)再生等發(fā)揮 作 用［38］。NF-κB 和Jak-STAT 與PI3K-Akt 信 號通路相互交織，并在NMOSD 治療中發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用［39-41］。

綜上所述，TSKEP 可通過槲皮素、木犀草素、豆甾醇和β-谷甾醇等多種活性成分作用于IL-6、IL-1β 和TNF-α 等 多 種 炎 癥 及 神 經(jīng) 細 胞 因 子，由IL-17 和NF-κB 等多條信號通路參與調(diào)控外周血中炎性細胞因子的表達、改善神經(jīng)功能缺損癥狀以及促進神經(jīng)功能的修復(fù)再生，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而達到治療效果。本研究為中藥復(fù)方通過多組分、多靶點和多通路協(xié)同作用治療NMOSD提供了理論依據(jù)。