應(yīng)用脈沖標(biāo)記粗枝云杉和四川紅杉幼苗的13C分配特征研究

楊玉婷，楊紅艷，劉金超，曲煒辰，杜 婷，張 玉，張 麗，游成銘，譚 波，徐振鋒，李 晗

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)研究所/長江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長江上游森林資源保育與生態(tài)安全國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，成都 611130）

20 世紀(jì)80 年代以來，穩(wěn)定碳同位素示蹤成為研究生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)最科學(xué)有效的方法之一，可分析大氣-植物-土壤中碳的同位素變化規(guī)律，能夠真實(shí)地反映植物源土壤有機(jī)碳的累積及分解轉(zhuǎn)化過程[1-4]。自然界中12C 和13C 的相對豐度分別為98.89%和1.11%，14C只有極微量且具有放射性[5]，無放射性13C 無放射性對人體不具危害且具有標(biāo)記均勻、可長期標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，因而近年來研究者們更傾向于把穩(wěn)定同位素13C作為示蹤物[6]。目前，碳穩(wěn)定性同位素人工標(biāo)記方法主要分為連續(xù)標(biāo)記法和脈沖標(biāo)記法，與連續(xù)標(biāo)記相比，脈沖標(biāo)記費(fèi)用低、設(shè)備和環(huán)境條件要求簡單，在生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)研究中得到了廣泛應(yīng)用[7]。國內(nèi)外許多學(xué)者對小麥、水稻和玉米等植物運(yùn)用脈沖標(biāo)記法進(jìn)行同位素標(biāo)記，研究其生長過程中光合碳的分配和轉(zhuǎn)移，對認(rèn)識碳的轉(zhuǎn)化途徑和地球化學(xué)循環(huán)具有重要意義[8-12]。

隨著研究的深入，穩(wěn)定碳同位素技術(shù)逐漸被用于研究植物-土壤系統(tǒng)碳循環(huán)[13-14]、植物體與環(huán)境的關(guān)系[15-17]、植物群落的動態(tài)變化[18]、土壤呼吸的動態(tài)變化及區(qū)分[19-20]、凈生態(tài)系統(tǒng)碳交換的區(qū)分[21-22]等研究領(lǐng)域。冉珊珊等[23]對互花米草進(jìn)行了4 次13C 脈沖標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，各器官固定的13C 量隨標(biāo)記次數(shù)增加而增加，而孫昭安等[24]在13C脈沖標(biāo)記法定量冬小麥光合碳分配及其向地下的輸入研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4 周的示蹤期后，13C 在冬小麥-土壤系統(tǒng)中的分配已基本穩(wěn)定，已有研究多選取生長周期較短的草本植物進(jìn)行標(biāo)記，對生長緩慢的木本植物尤其是針葉樹種的標(biāo)記研究鮮有報(bào)道[25-26]。粗枝云杉（Picea asperata）是川西亞高山森林主要的建群種之一，亦是長江上游生態(tài)屏障帶的重要組成部分[27-28]，而四川紅杉（Larix masteriana）作為四川特有彩葉樹種[29]，是維持川西亞高山森林生態(tài)價(jià)值和景觀價(jià)值的重要組成樹種[30]。因此，本研究選取針葉常綠樹種粗枝云杉和針葉落葉樹種四川紅杉幼苗為研究對象，采用13C脈沖標(biāo)記法，探究標(biāo)記后兩種針葉樹種植物體不同器官和土壤13C 富集的分布規(guī)律，為了解應(yīng)用脈沖標(biāo)記法在針葉樹種13C 穩(wěn)定同位素標(biāo)記過程中的光合碳分配規(guī)律提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以生長良好、無病蟲害的5 a 生粗枝云杉和四川紅杉幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，兩種幼苗各25 株，高分別為50 cm和120 cm左右。將幼苗移栽至直徑20 cm，高30 cm的花盆中。培育土選用幼苗培育原土與營養(yǎng)土的混合土，每盆裝土約8 kg?；ㄅ柚糜诤銣?0 ℃、恒濕60%并裝有定時生長燈的培養(yǎng)室內(nèi)，模擬幼苗原生環(huán)境，每天供給12 h光照。根據(jù)土壤水分情況，5～7 d 澆水1 次。培養(yǎng)4 個月后，選擇生長狀況良好的幼苗進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

1.2 13C脈沖標(biāo)記

在幼苗生長旺盛期2020 年8 月初開始13C 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，間隔10 d，共標(biāo)記4 次，每次標(biāo)記均在晴朗白天進(jìn)行。將生長架用透明加厚塑料膜覆蓋，用丁基防水膠帶內(nèi)外密封（架高1.9 m、長4.2 m、寬0.8 m），上下層生長架分別放置粗枝云杉和四川紅杉幼苗，利用Na213CO3（99 atom%13C）與2 mol/L HCL 反應(yīng)提供13CO2進(jìn)行標(biāo)記。在箱內(nèi)安裝4個小型電風(fēng)扇，用于保證箱內(nèi)氣體混合均勻。另選取四川紅杉和粗枝云杉未標(biāo)記的幼苗各6株作為對照。具體標(biāo)記步驟為[23]：

①.生長架每層放置4 個250 mL 的燒杯，其中2 個燒杯中放置5 g Na213CO3，另外2 個燒杯中放置5 g Na212CO3；

②.標(biāo)記箱每層放置2 個1 L 量杯，向量杯中分別倒入250 mL 500 g/L NaOH，密封標(biāo)記箱，打開風(fēng)扇，讓幼苗進(jìn)行光合作用的同時吸收CO2，造成幼苗“饑餓”狀態(tài)，提高后期幼苗對13CO2的固定;

③.一段時間后，取出量杯，關(guān)閉生長燈，迅速分別向每層裝有Na213CO3的1個燒杯中倒入200 mL 2 mol/L HCL 溶液，待反應(yīng)5 min 后，打開生長燈，打開風(fēng)扇，靜待幼苗進(jìn)行光合作用45 min；

④.重復(fù)步驟③，繼續(xù)向每層裝有Na213CO3的另1個燒杯中倒入HCL 溶液產(chǎn)生13CO2，靜待幼苗進(jìn)行光合作用45 min。最后2 次則分別向每層裝有Na212CO3的燒杯中倒入HCL 溶液產(chǎn)生12CO2，同樣前后分別靜待幼苗進(jìn)行光合作用45 min，促進(jìn)箱內(nèi)13CO2同化，減少13CO2的損失，提高幼苗對13C 固定率。

⑤.整個標(biāo)記過程持續(xù)5 h，標(biāo)記完成后，撤除塑料蓋膜。

1.3 樣品采集與室內(nèi)分析

脈沖標(biāo)記完成后，對幼苗進(jìn)行干旱處理，待幼苗枯死葉片凋落后，分別從組合標(biāo)記架上隨機(jī)采集粗枝云杉和四川紅杉標(biāo)記各6株以及未標(biāo)記幼苗各6株，每株幼苗分別采集葉片、枝、根以及盆中土壤，密封帶回實(shí)驗(yàn)室。采集植物器官和土壤樣品用去離子水洗凈后，于65 ℃烘干至恒重，分別磨碎混勻，過200 目篩，采用同位素質(zhì)譜儀（CCIA-38, ABB Inc, Canada）測定δ13C值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用配對樣本t-檢驗(yàn)比較各樹種幼苗同一器官（土壤）在標(biāo)記前后δ13C值的差異顯著性；利用雙因素方差分析檢驗(yàn)器官（土壤）和樹種以及二者交互作用對標(biāo)記前后幼苗13C 分布的影響。以上分析在Microsoft Excel 2013、SPSS 27.0（IBM Corp.）和Prism 8.0（Graphpad Software Inc.）中運(yùn)行，顯著性水平設(shè)定為α = 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖標(biāo)記前后粗枝云杉與四川紅杉各器官δ13C值變化

由圖1（a）可見，未標(biāo)記粗枝云杉的根、枝、葉和土壤的δ13C 值范圍分別為：-27.01‰～-26.87‰、-27.54‰～-27.58‰、-29.11‰～-29.02‰和-26.01‰～-25.87‰，其表現(xiàn)為葉＜枝＜根＜土壤，但是粗枝云杉根、枝、葉片以及土壤中δ13C值差異不明顯；而經(jīng)過了4次13C脈沖標(biāo)記后，粗枝云杉的根、枝、葉和土壤的δ13C值范圍分別為：-23.02‰～63.97‰、-23.72‰～18.52‰、-20.09‰～14.09‰ 和-20.27‰～-15.71‰，其表現(xiàn)為土壤＜枝＜葉＜根，并且粗枝云杉根的δ13C值遠(yuǎn)大于粗枝云杉其他器官或土壤的δ13C 值，土壤的δ13C值遠(yuǎn)小于粗枝云杉其他器官的δ13C值。對粗枝云杉不同器官（土壤）標(biāo)記前后δ13C 值進(jìn)行配對樣本t-檢驗(yàn)，結(jié)果表明：粗枝云杉各器官以及土壤在標(biāo)記前后均差異顯著（P＜0.05）。

圖1 標(biāo)記前后粗枝云杉（a）與四川紅杉（b）不同器官（土壤）δ13C值 (n=6)Figure 1 δ13C values of different organs(soil) of P. asperata (a) and L. masteriana (b) before and after labeling (n=6)

由圖1（b）可見，未標(biāo)記四川紅杉的根、枝、葉和土壤δ13C值表現(xiàn)為枝＜根、葉＜土壤，其根、枝和土壤的δ13C 值 范 圍 分 別 為：-27.67‰～ -27.54‰、-28.98‰～-28.95‰和-26.67‰～-26.54‰，葉的δ13C值均為-27.57‰，但是未標(biāo)記四川紅杉根、枝、葉以及土壤的δ13C 值差異不明顯；完成4 次脈沖標(biāo)記后，四川紅杉根、枝、葉以及土壤δ13C 值表現(xiàn)為土壤＜根＜枝＜葉，其根、枝、葉和土壤的δ13C 值范圍分 別 為：25.33‰～171.64‰、36.68‰～206.84‰、79.40‰～230.91‰和-16.49‰～-11.28‰，并且四川紅杉中葉的δ13C 值遠(yuǎn)大于四川紅杉其他器官以及土壤中的δ13C 值、土壤中的δ13C 值遠(yuǎn)小于四川紅杉其他器官中的δ13C 值、根與枝中的δ13C 值相接近。對四川紅杉不同器官標(biāo)記前后δ13C 值進(jìn)行配對樣本t-檢驗(yàn)，結(jié)果表明：四川紅杉各器官以及土壤在標(biāo)記前后均差異顯著（P＜0.05）。

2.2 粗枝云杉和四川紅杉13C分布規(guī)律的差異

將未標(biāo)記的四川紅杉與粗枝云杉各體內(nèi)器官與土壤中的δ13C進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：13C在四川紅杉與粗枝云杉各器官以及土壤中無明顯差異且均表現(xiàn)為葉＜枝＜根＜土壤；而對標(biāo)記后四川紅杉與粗枝云杉各幼苗體內(nèi)器官與土壤中的δ13C值作比較，結(jié)果顯示標(biāo)記后四川紅杉13C富集量明顯高于粗枝云杉13C富集量，四川紅杉與粗枝云杉δ13C 值表為：四川紅杉＞粗枝云杉，且四川紅杉葉的13C富集量遠(yuǎn)高于四川紅杉其余器官或土壤以及粗枝云杉各器官或土壤中的13C 富集量，其δ13C 值在標(biāo)記前為-27.57‰，標(biāo)記后δ13C 達(dá)到79.40‰～230.91‰，而粗枝云杉與四川紅杉土壤的13C富集量相接近，其δ13C值分別為-20.27‰～-15.71‰、-16.49‰～-11.28‰。對標(biāo)記前后四川紅杉和粗枝云杉不同器官（土壤）δ13C值進(jìn)行雙因素分析，結(jié)果表明：器官（土壤）、樹種以及二者的交互作用對標(biāo)記前后幼苗的13C 分布均具有顯著的影響（表1）。

表1 標(biāo)記前后四川紅杉和粗枝云杉不同器官（土壤）δ13C值的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA results of δ13C values in different organs(soil) of L. masteriana and P. asperat before and after labeling

3 討論

3.1 脈沖標(biāo)記13C在不同樹種的富集分布規(guī)律

近年來，穩(wěn)定性同位素技術(shù)的發(fā)展使得定量研究光合產(chǎn)物碳的去向成為可能[31]，發(fā)現(xiàn)器官（土壤）、樹種以及二者的交互作用對標(biāo)記前后幼苗的13C 分布均具有顯著影響。在脈沖標(biāo)記13C 時各器官及土壤13C 的富集量總體表現(xiàn)為：四川紅杉＞粗枝云杉，并且四川紅杉葉片富集的13C 值遠(yuǎn)高于其他器官或土壤的13C 富集。造成這種差異的原因可以從兩種樹種的形態(tài)特征和對環(huán)境的適應(yīng)性展開。

植物通過光合作用固定13CO2，將光合碳產(chǎn)物輸送至植物體各個部位，并通過根系轉(zhuǎn)移到土壤，經(jīng)過土壤微生物作用最終回歸大氣或以有機(jī)質(zhì)的形式固定在土壤中。在這個過程中，由于不同植物的形態(tài)特征及對環(huán)境的適應(yīng)性不同，其對光合產(chǎn)物的分配和累積情況也不同[31]。相關(guān)研究表明，葉片作為光合作用主要器官能直接影響植物的光能利用率和CO2固定能力。孟猛等[32]研究表明，具有較大葉面積指數(shù)的樟樹相比于夾竹桃樟樹能夠接受更多的光合有效輻射，從而使得光合固定碳的能力得到明顯提升[33-34]。同時，葉片的δ13C 值還受環(huán)境溫度、相對濕度、光照與海拔等因素影響[35-36]。在本研究中四川紅杉各器官及土壤對13C 的富集量高于粗枝云杉，可能是因?yàn)樗拇t杉葉面積相比于粗枝云杉更大，能夠固定更多的13C；此外，四川紅杉與粗枝云杉最適生長的環(huán)境狀況也存在差異：四川紅杉幼齡階段有明顯的速生性，為中國落葉松屬植物中較耐陰的種類，喜溫涼、濕潤氣候；粗枝云杉稍耐蔭，能耐干燥及寒冷的環(huán)境條件。在本研究中空氣濕度更適于四川紅杉生長，從而使得四川紅杉的光合速率相對更快，對13C的富集量更大。

3.2 脈沖標(biāo)記13C在不同器官的富集分布規(guī)律

植物體器官在生長發(fā)育與生理代謝過程中執(zhí)行功能和養(yǎng)分需求不同，使得植物體對于光合產(chǎn)物在器官間的分配存在差異。在本研究中，不同器官（土壤）對標(biāo)記前后13C富集量具有顯著影響。植物主要依靠葉片的光合作用13C 固定在植物體內(nèi)，并在植物-土壤系統(tǒng)中進(jìn)一步分配，經(jīng)過4次脈沖標(biāo)記后，四川紅杉各器官（土壤）13C豐度值表現(xiàn)為：葉＞枝＞根＞土壤；粗枝云杉各器官（土壤）13C 豐度值表現(xiàn)為：根＞葉＞枝＞土壤。兩種樹種葉、枝和根的13C 富集量均大于土壤，這與冉珊珊等[24]用13C脈沖標(biāo)記法研究互花米草光合碳的分配和安婷婷等[9]標(biāo)記玉米1 d后同一處理組13C豐度變化的研究結(jié)果一致。此外，器官間光合產(chǎn)物差異也與外部環(huán)境相關(guān)，但是本研究僅在4 次標(biāo)記完成后進(jìn)行一次性采樣，無不同采樣時間對比，未能對各器官13C 富集量細(xì)微變化進(jìn)行追蹤。

而在不同物種間器官的13C 富集量又存在著差異。早前的研究發(fā)現(xiàn)植物光合固定的13C 在不同器官的分配通常表現(xiàn)為莖、葉＞根，這與其本身生理生化過程有關(guān)，大部分固定的碳留在地上部分[37-38]；而在本研究中，四川紅杉葉的13C 富集量要顯著高于其他器官，從植物形態(tài)學(xué)上看，光合產(chǎn)物的運(yùn)輸規(guī)律是先滿足上部器官的積累后再滿足下部器官的積累，這符合光合產(chǎn)物分配的“就近原則”，而粗枝云杉根的13C 富集量要高于其他器官?？赡苁怯蓛蓸浞N的生長特征差異引起，四川紅杉作為速生樹種，幼苗期注重于葉（地上部分）的生長；而粗枝云杉在幼齡期生長緩慢[39]，注重根系（地下部分）生長和養(yǎng)分積累，從而呈現(xiàn)以上結(jié)果。

綜上所述，脈沖標(biāo)記法在實(shí)現(xiàn)針葉樹種13C 穩(wěn)定同位素的標(biāo)記中效果良好。經(jīng)過4 次標(biāo)記，兩樹種各器官和土壤的13C 豐度在標(biāo)記前后發(fā)生了顯著的改變，且落葉樹種四川紅杉表現(xiàn)出對外源13C 更好的固定能力，其中葉片在各器官中實(shí)現(xiàn)了最多的13C 富集。這些結(jié)果表明脈沖標(biāo)記法在探究幼苗期針葉樹種器官-土壤中光合產(chǎn)物分配規(guī)律方面效果良好，為穩(wěn)定同位素脈沖標(biāo)記法在植物生理和生態(tài)中的應(yīng)用提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。但本研究整個標(biāo)記過程均在室內(nèi)模擬進(jìn)行，不能完全代表高山植物生長的實(shí)際環(huán)境，且不同植物的標(biāo)記時間、次數(shù)分別對不同器官標(biāo)記效果的影響也有待進(jìn)一步探究。