多浪羊PRLR基因克隆測序及不同組織差異表達(dá)分析

李孝君，隋志遠(yuǎn)，王晨光，張永杰，張志帥，邢 鳳*

（1. 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

初情期是雌性動物初次發(fā)情并發(fā)生排卵獲得生殖能力的時期，這一時期始于下丘腦內(nèi)GnRH 神經(jīng)元分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)，這是由表達(dá)高水平跨膜催乳素受體的Kisspeptin 神經(jīng)元調(diào)節(jié)的。初情期的發(fā)生受生殖激素的調(diào)控，催乳素對黃體生成素和卵泡刺激素具有協(xié)調(diào)作用[1]。哺乳期間發(fā)現(xiàn)的血清PRL 水平升高，或由慢性催乳素（PRL）輸注引起，會降低促性腺激素和Kisspeptin 的分泌，并影響動物的發(fā)情周期及排卵，而在試驗中發(fā)現(xiàn)PRL有助于初情期的啟動從而獲得生殖能力[2]。

PRL跟其受體（PRLR）作用于靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)繁殖相關(guān)生殖激素的合成和分泌，PRLR基因的表達(dá)[3],研究發(fā)現(xiàn)PRL結(jié)合其PRLR能產(chǎn)生不同的生理作用[4]。該基因變異對初情期年齡會產(chǎn)生影響[5]。PRLR 基因首先在大鼠上被發(fā)現(xiàn)的，隨后在小鼠上也被發(fā)現(xiàn)，學(xué)者們對其他動物的PRLR基因進(jìn)行了克隆，如在猴、牛、羊、馬、兔，雞、鵝、羊駝、魚和豬等動物也發(fā)現(xiàn)了PRLR基因。

目前PRLR基因在綿羊、山羊、鴿子、烏龜、雞、鴨、羊駝、小鼠和大鼠等動物的下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管和胎兒的一些細(xì)胞中均有表達(dá)，且不同時期的組織中的表達(dá)量存在差異[6-9]。多浪羊是新疆南疆的優(yōu)良綿羊品種，具有發(fā)情早，生長速度快等優(yōu)點。但國內(nèi)并沒有PRLR基因?qū)d羊初情期的影響的報道。因此，本試驗為多浪羊垂體中PRLR基因克隆測序后，進(jìn)行生物信息學(xué)分析和熒光定量PCR（qPCR）的方法，對多浪羊的PRLR 基因的CDS 序列分析以及測定初情期前后3 個時期垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管各組織中的PRLR基因的表達(dá)差異，為研究PRLR基因功能和進(jìn)一步說明PRLR基因在綿羊初情期的啟動過程產(chǎn)生的影響提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料的采集

試驗動物是從南疆麥蓋提多浪羊種羊繁殖羊場購買，同一飼養(yǎng)條件下的小母羊（2 月齡）15 只飼養(yǎng)于塔里木大學(xué)實驗站，觀察其發(fā)情特征，初情期前（90日齡），初情期（初次發(fā)情后的4～6 d），初情期后（發(fā)情10 d后)在無菌條件下用專門處理過的手術(shù)器械快速采集以上羊的下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管整個組織，其中同一年齡階段的5 個組織樣本視為生物學(xué)重復(fù)，采集的組織用酒精消毒剪成1 cm3大小的組織放入凍存管內(nèi)，儲存在液氮中，帶回放入-80 ℃的冷凍室備用。

1.2 試驗試劑

Trizol 購自Invitrogen；qPCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞從北京全式金生物技術(shù)有限公司進(jìn)行購買；膠回收試劑盒和DNA Marker2000均在北京天根生化科技有限公司購買；藍(lán)白斑試劑從北京索萊寶科技有限公司購買；PMD19-T購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 提取RNA與cDNA合成

使用 Trizol 法提取多浪羊各組織中的RNA，檢測其濃度后計算后在同一濃度下（1 000 ng/μL)使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成,將得到的cDNA放到-20 ℃的冷凍室備用。

1.4 引物設(shè)計及PRLR基因CDS區(qū)的克隆

從GeneBank 上找到的Ovis areas PRLR mRNA登錄號為；AF041257.1，根據(jù)Primer Premier5.0 設(shè)計PRLR基因克隆的引物見表1。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，9.5 μL ddH2O，上下引物各1 μL，1 μL cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；重復(fù)35個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測后，使用膠回收試劑盒回收的CDA 與PMD19-T 載體連接，將連接好的載體于DH5α 感受態(tài)細(xì)胞混合不含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，進(jìn)行搖床復(fù)蘇，條件為120 min，37 ℃，225 r/min。將含有大腸桿菌液接種在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，放置30 min，培養(yǎng)皿倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。挑出陽性重組子后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將合格菌液送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。利用測序獲得的序列設(shè)計qPCR引物，以β-actin為內(nèi)參基因。上海生工生物工程公司合成引物。

表1 引物設(shè)計以及產(chǎn)物長度Table 1 Primer design and product length

1.5 實時熒光定量 PCR

以多浪羊cDNA為模板，利用qPCR檢測多浪羊各組織中PRLR的表達(dá)量。反應(yīng)總體系為15 μL：7.5 μL 2Transtant qPCR Mix，5.5 μL ddH2O，上下游引物各0.5 μL（10 nmol/μL），1 μL cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；55 ℃，15 s；68 ℃，20 s，重復(fù)反應(yīng)40次。

1.6 生物信息學(xué)分析

用MEGA7.0 軟件對PRLR 蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析圖：ExPASy-PrortScale 和ExPASy-ProtParam tool 在線軟件分析PRLR 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用TMHMM2.0分析PRLR 蛋白跨膜區(qū)域；利用NetPhos 3.1軟件對PRLR蛋白進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測；SignalP 5.0 預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽；利用SOPMA 在線軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL 軟件蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.7 統(tǒng)計分析

采用2-ΔΔct法計算得到的CT 值，使用SPSS 26.0單因方差分析差異是否顯著。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多浪羊PRLR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以多浪羊下丘腦cDNA 模板，通過RT-PCR 對多浪羊的PRLR基因進(jìn)行擴(kuò)增，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后（圖1）。獲得含有目的基因的條帶，測序?qū)Y(jié)果進(jìn)行了比對后發(fā)現(xiàn)，已獲得該基因序列。

圖1 多浪羊PRLR基因PCR產(chǎn)物Figure 1 PCR product of PRLR gene of Duolang sheep

2.2 PRLR 基因氨基酸序列對比相似性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹

通過NCBI 分別獲取綿羊登錄號（Ovis aies登錄號：KAG5199221.1）、山羊（Capra hircus登錄號：NP_001272598.1）、人（Homo sapiens登 錄 號：NP_000940.1）、家 鼠（Mus musulus登 錄 號：NP_00124071）、馬（Equus asinus登 錄 號：XP_001500154.1）、豬（Sus scrofa登 錄 號：NP_001001868）、雞（Gallus gallus登 錄 號：NP_001384495.1）和馬鹿（Cervus elaphus登錄號：XP_043743252.1）的蛋白序列。由圖2 可得知，多浪羊PRLR基因氨基酸序列與綿羊、人、山羊、家鼠、豬、馬、雞和馬鹿的相似性分別為99.7%、70.7%、96.4%、43.5%、75.4%、75.5%、47.0%和49.7%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，多浪羊與綿羊、山羊、馬鹿的親緣關(guān)系較近，與人、豬、馬和家鼠次之，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3）。

圖2 多浪羊PRLR蛋白質(zhì)氨基酸相似性對比分析Figure 2 Comparative analysis of amino acid similarity of PRLR protein of Duolang sheep

圖3 多浪羊PRLR蛋白氨基酸序列的進(jìn)化分析樹Figure 3 Evolutionary analysis tree of PRLR amino acid sequence of Duolang sheep

2.3 PRLR蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析

2.3.1 多浪羊PRLR編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

使用在線軟件ProtParam 分析多浪羊PRLR 蛋白物理化性質(zhì)，結(jié)果顯示：其分子質(zhì)量為65 208.33 Ku,其理論等電點為5.12；該蛋白分子式為：C2952H4538N734O883S24；ProtParam預(yù)測顯示PRLR蛋白序列中親水性氨基酸區(qū)域比疏水性的氨基酸區(qū)域多（圖4）；脂肪族指數(shù)：28.24；親水性的大平均值（GRAVY）：-0.432 為親水蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為49.28，為不穩(wěn)定蛋白。

圖 4 多浪羊 PRLR蛋白疏水性/親水性預(yù)測Figure 4 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of PRLR protein from Duolang sheep

2.4.2 PRLR蛋白磷跨膜區(qū)域預(yù)測

使用TMHMM2.0 蛋白結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)域預(yù)測分析顯示PRLR蛋白2含跨膜結(jié)構(gòu)位于25到235，第259 到581。由圖5 可知，PRLR 蛋白存在2 個跨膜區(qū)域，跨膜區(qū)域起始位置與SMART 軟件預(yù)測序列一致。

圖5 多浪羊 PRLR跨膜區(qū)域預(yù)測Figure 5 PRLR transmembrane region prediction in Duolang sheep

2.3.3 PRLR蛋白磷酸化位點的預(yù)測

在線軟件NetPhos3.1 分析多浪羊PRLR 蛋白質(zhì)的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測；結(jié)果顯示共有73個磷酸化位點見（圖6）其中11酪氨基酸、19個蘇氨基酸和41個絲氨酸。

圖6 多浪羊PRLR蛋白磷酸化位點預(yù)測圖Figure 6 PRLR Protein phosphorylation site prediction map of Duolang sheep

2.3.4 PRLR 蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測

在線軟件SignalP 5.0 預(yù)測多浪羊PRLR 蛋白質(zhì)的信號肽，測到該基因的蛋白信號肽（圖7）。

圖7 多浪羊PRLR跨膜信號肽的預(yù)測分析Figure 7 Predictive analysis of PRLR transmembrane signal peptide

2.3.5 多浪羊PRLR蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA 在線軟件預(yù)測結(jié)構(gòu)可知，PRLR 蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由59.21%的無規(guī)則卷曲和21.69%的延伸鏈組成，其余結(jié)構(gòu)為15.83%的β-轉(zhuǎn)角和3.27%的α-螺旋結(jié)構(gòu)。（圖8）S WISS-MODEL 軟件對PRLR 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測驗證了PRLR 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，GMQE為0.25, PRLR蛋白無配體結(jié)構(gòu)(圖9)。

圖8 多浪羊PRLR二級蛋白預(yù)測分析Figure 8 PRLR secondary protein prediction analysis of Duolang sheep

圖9 多浪羊PRLR蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 9 Tertiary structure prediction of PRLR protein of Duolang sheep

2.4 PRLR基因不同情期不同組織中的表達(dá)差異

通過qPCR方法對PRLR基因在多浪羊垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管各組織5種組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測（圖10）。結(jié)果顯示：PRLR基因在多浪羊初情期前垂體的表達(dá)量較高，顯著高于其他4 個組織；初情期PRLR基因在垂體的表達(dá)量任相對較高，顯著高于下丘腦、子宮、卵巢和輸卵管；初情期后PRLR基因在垂體和下丘腦的表達(dá)量相對較高，顯著高于子宮、卵巢和輸卵管；初情期PRLR基因在垂體和輸卵管有升高的趨勢顯著高于初情期前和初情期后；初情期到初情期后PRLR基因在下丘腦持續(xù)升高的趨勢，初情期后顯著高于初情期，初情期顯著高于初情期前。初情期子宮中的PRLR基因的表達(dá)量先降低初情期后上升但差異不顯著。卵巢PRLR基因在初情期前先升高初情期后降低但差異不顯著。

圖10 不同時期不同組織多浪羊PRLR 相對分泌量Figure 10 Relative secretion of PRLR in different tissues of Duolang sheep in different periods

3 討論

雌性動物發(fā)情周期的不同階段PRLR基因的表達(dá)量發(fā)生變化，而PRLR基因的表達(dá)受生殖的激素調(diào)控。此外不同類型的PRL 受體在激素信息傳導(dǎo)中的產(chǎn)生的功能可能有所不同[10]。本文RT-RCR技術(shù)克隆了從多浪羊垂體提取的PRLR基因的片段共1 763 bp，其中CDS 區(qū)編碼區(qū)的序列長為1 746 bp，編碼氨基酸581 個，在其他羊上發(fā)現(xiàn)均為581 個氨基酸，在其他哺乳動物氨基酸數(shù)為小鼠589個、大鼠591 個、兔子592 個、牛和鹿557 個、人與猴598 個。通過生物學(xué)信息分析結(jié)果顯示，PRLR 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由59.21%的無規(guī)則卷曲和21.69%的延伸鏈組成，屬于不穩(wěn)定親水蛋白，有蛋白信號肽，有2個蛋白跨膜結(jié)構(gòu)屬于跨膜蛋白[11]，PRLR蛋白屬于分泌蛋白，合成后會發(fā)生轉(zhuǎn)運。對蛋白磷酸化位點的預(yù)測發(fā)現(xiàn)了73 個蛋白磷酸化位點，其中11 個酪氨基酸(Y)位點、19個蘇氨基酸（T）位點和41個絲氨酸（S）位點。PRLR基因在動物之間有較高的保守[11]。試驗獲得的多浪羊PRLR蛋白氨基酸序列在不同物種分析同源性及構(gòu)建進(jìn)化發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)多浪羊與綿羊、山羊、馬鹿親緣關(guān)系較近，與人、豬、馬、家鼠的親緣關(guān)系次之，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，該結(jié)果符合動物進(jìn)化的特征與其他的學(xué)者研究結(jié)果一致[12-17]。

許多研究證明PRLR基因在哺乳動物的下丘腦、垂體和性腺等組織中均有的廣泛表達(dá)，并且PRLR在幾乎所有的組織和胎兒的一些細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)。成年內(nèi)蒙古絨山羊的下丘腦、垂體和卵巢均有PRLR基因的表達(dá)，卵巢是催乳素的靶器官，說明PRLR基因?qū)?nèi)蒙古絨山羊的繁殖力具有影響[18]。甘加藏羊發(fā)情周期中PRLR基因在垂體和卵巢組織中均有表達(dá)，且垂體組織中表達(dá)最高，且發(fā)情期前PRLR的表達(dá)顯著高于發(fā)情期和發(fā)情后。發(fā)情期卵巢的表達(dá)量高于發(fā)情前和發(fā)情后，PRLR基因參與了甘加藏羊發(fā)情周期的調(diào)控[19]。中國軟殼龜?shù)乃薪M織中發(fā)現(xiàn)了PRLR基因的表達(dá)，且在垂體得表達(dá)量最高，其基因在爬行動物參與的調(diào)控應(yīng)該與鳥類中的是一致的[20]。浙江白東鵝在產(chǎn)蛋期和就巢期垂體的表達(dá)量顯著高于下丘腦、卵巢和輸卵管等組織[21]。黑番鴨就巢期子宮中PRLR基因的表達(dá)量高于產(chǎn)蛋期前后，卵巢中的表達(dá)量高于下丘腦，垂體中的表達(dá)量基本沒有變化[22]。PRLR基因可能參與了綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)控，成年的小尾寒羊黃體期的PRLR基因的表達(dá)量高于卵泡期[23]。皖西白鵝卵巢的表達(dá)顯著高于垂體和下丘腦，就巢期PRLR基因的表達(dá)量高于產(chǎn)蛋期前和產(chǎn)蛋后[24]；肉鴿嗉囊中PRLR基因在孵化期間到哺育第3 天的表達(dá)量逐漸增加，公鴿嗉囊中的PRLR的表達(dá)量高于母鴿，嗉囊中PRLR基因的表達(dá)量高于垂體、下丘腦和卵巢（睪丸）[25]。雌性條紋倉鼠春秋時期PRLR基因在下丘腦，卵巢的表達(dá)水平與LH 和FSH 血清濃度呈負(fù)相關(guān)，由此說明PRLR基因可能對季節(jié)生殖活動產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)[26]。出生時垂體和卵巢中就有表達(dá)但其表達(dá)量較低在2～4 月齡時PRLR基因表達(dá)顯著高于1月齡和5月齡（性成熟），因此PRLR基因參與了前籽鵝的性成熟調(diào)控[27]。PRLR基因?qū)ξ闯墒煨∈蟮穆雅莅l(fā)育，生長及黃體生長及維持發(fā)揮著重要作用,隨小鼠周齡的增長PRLR基因在小鼠卵巢中的表達(dá)量也升高[28]。本研究PRLR基因在多浪羊垂體、卵巢和輸卵管等組織在初情期前到初情期的過程中的表達(dá)量顯著升高初情期后又降低，證明PRLR基因在多浪羊初情期的啟動過程中發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，多浪羊PRLR基因在下丘腦、垂體、子宮和輸卵管均有表達(dá)，在垂體中高表達(dá)，初情期垂體和卵巢組織中的PRLR基因顯著性升高，而初情期時動物第一次排卵的過程，而卵巢中的PRLR基因可誘導(dǎo)排卵[29]。這為進(jìn)一步多浪羊PRLR基因的在初情過程啟動過程中的調(diào)控基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究獲得了多浪羊PRLR基因的CDs 區(qū)序列，其長度為1 746 bp，PRRL 蛋白在哺乳動物進(jìn)化過程中具有高度的保守；多浪羊PRLR基因主要在垂體和下丘腦中表達(dá)，卵巢和子宮次之，輸卵管中表達(dá)最低，且PRLR基因在多浪羊垂體表達(dá)量顯著高于其他組織；多浪羊垂體和卵巢組織中PRLR基因在初情期前、初情期和初情期后表達(dá)量先升高再降低，揭示了PRLR基因可能參與了多浪羊初情期的啟動過程。