葉菜型甘薯資源耐寒性評價體系研究

耿亞林,李 瑤,潘 攀,唐道彬,羅啟燕,王季春

(1.西南大學農學與生物科技學院/薯類生物學與遺傳育種重慶市重點實驗室,重慶 400700;2.彭水縣農業(yè)技術推廣中心,重慶 彭水 409600)

【研究意義】甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.],也稱白薯、山芋、紅薯、地瓜等,為喜溫短日照作物,當氣溫低于15 ℃時,其地上部生長停滯,氣溫低于6～8 ℃時,植株出現(xiàn)柔軟、萎蔫現(xiàn)象,一旦經霜就會枯死。葉菜型甘薯是指將蔓莖生長點以下長約12 cm鮮嫩莖葉用作蔬菜食用的一種專用型甘薯[1],富含多種營養(yǎng)物質,如維生素C、蛋白質、花色苷、黃酮、膳食纖維、綠原酸等,具有抗腫瘤、保護肝臟、抗氧化等功效[2]。葉菜型甘薯無明顯生育期,本可周年生產,但秋冬、早春的低溫冷害會阻礙甘薯生長,限制其生產應用。因此,篩選耐寒能力強的葉菜型甘薯品種,利用現(xiàn)代農業(yè)保溫設施,實現(xiàn)春季提早栽培、秋季延后采摘,是解決甘薯生產中低溫冷害難題的重要途徑。建立一套快速、準確的種質資源耐寒性評價體系,對選育耐寒性強的葉菜型甘薯品種、擴大葉菜型甘薯種植規(guī)模意義重大?！厩叭搜芯窟M展】植物處在逆境時,體內會產生一系列適應性生理生化反應,如活性氧含量大幅增加、細胞膜脂過氧化程度加劇等,進而影響生物膜及其他大分子結構和功能,造成代謝失衡,嚴重時甚至導致植株死亡[3-4]。關于植物的耐寒性,前人已對大白菜、油菜、茄子、甜瓜、青蒿等不同種屬作物的耐寒性開展了大量研究,結果表明植物的耐寒能力與其體內抗氧化酶活性、滲透調節(jié)類物質含量等密切相關[5-8]。目前,國內外學者已篩選出多個與植物耐寒性評價相關的指標[9],前人多對少數(shù)品種的幾個生理指標進行耐寒性比較[10-11],但作物抗逆性是受多因子影響的復雜性狀[12],易受外界環(huán)境影響,不同種類、不同品種的植物耐寒機制也不相同,某一單項指標很難反映植物的耐寒本質[13-14],且許多評價指標之間存在一定的相關性,導致這些指標對植物逆境信息的反映發(fā)生交叉重疊,而各指標對抗寒性的反映貢獻程度也不相同,因此有必要運用多元分析法對植物耐寒性生理指標進行綜合評價,建立可靠的綜合評價體系。對甘薯的耐寒性研究,前人多分析了低溫貯藏條件下甘薯塊根品質的變化[15-17],而對葉菜型甘薯低溫脅迫下生理變化的報道較少,關于葉菜型甘薯品種的耐寒性綜合評價研究更為鮮見?！颈狙芯壳腥朦c】本研究嘗試利用多種多元分析方法,比較不同葉菜型甘薯品種的耐寒能力,并探討其生理生化指標與耐寒性之間的相關性?！緮M解決的關鍵問題】基于各生理生化指標與耐寒性的關系,建立葉菜型甘薯耐寒性評價數(shù)學模型,為葉菜型甘薯耐寒種質資源的挖掘,耐寒性品種的選育,快速、準確的耐寒性評價提供依據(jù)和方法,以期解決葉菜型甘薯生產中的實際問題,推動葉菜型甘薯產業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甘薯品種13個(表1),于西南大學現(xiàn)代農業(yè)示范園區(qū)4號溫室中采用“大棚+小拱棚”育苗,做到同期、同方式育苗。

表1 供試13個葉菜型甘薯品種特征及來源Table 1 Characteristics and sources of tested 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗在西南大學薯類生物學與遺傳育種重慶市重點實驗室的人工氣候培養(yǎng)箱中進行,以13個葉菜型甘薯品種為材料,每個品種3盆,花盆規(guī)格為直徑18 cm×高20 cm。選用的植株已經完全適應盆栽環(huán)境,無緩苗現(xiàn)象,無病蟲害,生長健壯。所有處理的栽培基質、管理方法一致?；|配方為草炭土、椰磚、蛭石(體積比為1∶1∶1),營養(yǎng)液參考日本園試配方[18],利用人工氣候培養(yǎng)箱模擬低溫環(huán)境(表2),以25 ℃為對照,研究在10 ℃低溫脅迫下甘薯葉片生理生化指標的變化。

表2 人工氣候培養(yǎng)箱相關參數(shù)設置Table 2 Relevant parameter settings of artificial climate incubator

1.2.2 測定指標 移入人工氣候培養(yǎng)箱24 h后取樣,取樣部分為地上部倒3、倒4完全展開葉,取樣后立即用液氮速凍,放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＿^氧化物酶(Peroxidase,POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚氧化比色法[19];抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性測定采用抗壞血酸比色法[19];過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性測定采用紫外吸收法[19];超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性測定采用氮藍四唑法[19];可溶性蛋白(Soluble protein,SP)含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[20];可溶性糖(SS,Soluble sugar)含量測定采用蒽酮試劑法[20];組織含水率(Tissue moisture content,TMC)測定采用烘干法[20];葉綠素(Chlorophyll,Chl)、類胡蘿卜素(Carotenoids,Car)含量測定采用分光光度法[20]。

1.3 耐寒性評價及數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理和制圖,用DPS軟件進行相關性分析、主成分分析和聚類分析。

單項指標耐寒系數(shù):CTC=處理測定值/對照測定值×100%

(1)

隸屬函數(shù)值:U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1, 2, 3,...,n

(2)

(3)

式中,Xj表示第j個指標,Xmin、Xmax表示第j個指標的最小值、最大值;Wj表示第j個指標在所有指標中的重要程度,即權重;Pj表示經主成分分析所得各甘薯品種第j個指標的貢獻率。

(4)

式中,D表示葉菜型甘薯品種綜合耐寒評價值,綜合評價值越大,表示其抗寒性越強。

2 結果與分析

2.1 單項指標耐寒系數(shù)及相關性分析

植物遭受逆境時會產生一系列應激反應,其抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分POD、APX、CAT、SOD等的活性會發(fā)生變化。由表3可以看出,與對照相比,不同葉菜型甘薯品種受低溫脅迫后的各項生理指標產生了不同程度的變化。13個葉菜型甘薯品種在低溫脅迫下的葉片POD、APX酶活性均增加(CTC>1),POD酶活性增加尤為顯著,其中福菜薯23、福菜薯18、渝菜薯3號的POD、APX酶活性變化最大,其POD酶活性變化是對照的6倍以上,而福菜薯22、鄂菜薯1號、浙菜薯726的POD、APX酶活性變化較小,表明POD、APX可能是葉菜型甘薯適應低溫的主要貢獻者;而CAT、SOD這兩個起保護細胞膜作用的酶在低溫脅迫下均較對照減少(CTC<1),表明這兩種酶在低溫下沒有起到保護細胞的作用。

低溫脅迫下,各甘薯品種的葉片可溶性蛋白、可溶性糖含量較對照均有不同程度的增加(CTC>1),增加幅度與品種耐寒性密切相關,即耐寒性強的品種增加幅度大,如渝菜薯3號的可溶性蛋白含量是對照的1.194倍,可溶性糖含量是對照的1.226倍。

葉綠素是植物光合色素中最重要的一類色素,逆境脅迫會使其含量發(fā)生變化。低溫脅迫下,葉綠素、類胡蘿卜素含量有增有減,耐寒性強的品種葉綠素、類胡蘿卜素含量較高。產生以上變化的原因:葉綠素、類胡蘿卜素含量降低是因為低溫脅迫使葉綠素的生物合成減弱,以及植物體內活性氧的積累,導致葉綠素分解加快,進而使葉片綠色變淡;葉綠素、類胡蘿卜素含量增加是由于低溫脅迫刺激酶保護系統(tǒng)的高效應答,使得部分品種的葉綠體細胞器未受到損傷。進一步分析發(fā)現(xiàn),各品種低溫脅迫下的葉綠素a/b較對照均呈增加趨勢(CTC>1),表明在葉綠素降解過程中葉綠素a與葉綠素b兩者的降解速率不一樣,葉綠素b降解更快。

采用不同單項生理指標的耐寒系數(shù)來評價甘薯品種的耐寒能力,其評價結果可能存在較大差異。

由表4可以看出,單項生理指標之間存在不同程度的相關性,多數(shù)達顯著或極顯著水平,如POD酶活性與APX酶活性、SP含量、SS含量之間呈正相關(r分別為0.79**、0.65*、0.73**),與CAT酶活性、SOD酶活性呈負相關(r分別為-0.57*、-0.63*);APX酶活性與SP含量、SS含量呈正相關(r分別為0.79**、0.78**),與CAT酶活性呈負相關(r=-0.64*);CAT酶活性與SP、SS含量呈負相關(r分別為-0.63*、-0.63*);SP含量與SS含量呈正相關(r=0.92**);TMC與Chl含量、Car含量呈負相關(r分別為-0.58*、-0.63*);Chl含量與Car含量、Chl a/b比值呈正相關(r分別為0.92**、0.57*);Car含量與Chl a/b比值呈正相關(r=0.55*)。結果表明各單項指標存在不同程度的相關性,具有相關性的兩個獨立指標對耐寒性的貢獻部分有所重疊。

表4 低溫脅迫下葉菜型甘薯單項生理指標的相關系數(shù)矩陣Table 4 Correlation coefficient matrix of single physiological indexes of leaf-vegetable sweet potato under low temperature stress

綜合各項生理指標變化情況,發(fā)現(xiàn)各項指標對甘薯品種的耐寒性產生的作用不盡相同,表明耐寒性是一個復雜的綜合性狀,直接利用單項生理指標不能客觀、準確地評價葉菜型甘薯品種的耐寒性,需在此基礎上利用主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析等多元統(tǒng)計方法進一步分析。

2.2 單項生理指標耐寒系數(shù)的主成分分析

對10個單項生理指標的耐寒系數(shù)進行主成分分析(表5),前4個的貢獻率分別為41.842%、29.164%、11.438%和6.138%,累積貢獻率達88.582%,其余可忽略不計。這4個相互獨立的綜合指標基本代表了原始指標攜帶的絕大部分信息,通過這些綜合指標足以說明耐寒系數(shù),故而取這4個主成分作為此次數(shù)據(jù)分析的有效成分。

表5 單項生理指標耐寒系數(shù)的主成分分析Table 5 Principal component analysis of cold tolerance coefficient of single physiological index

2.3 綜合指標耐寒系數(shù)的隸屬函數(shù)及聚類分析

由表6可見,對綜合指標CI1而言,渝菜薯3號的U(X1)最大,為1,表明在CI1這一綜合指標上該品種的耐寒性最強,而福菜薯22的U(X1)值最小,為0,表明該品種在這一綜合指標上耐寒性最差。各品種在其余3個綜合指標上的耐寒性表現(xiàn)可依此類推。

表6 13個葉菜型甘薯品種的綜合指標值及評價Table 6 Comprehensive indexes and evaluation of 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

根據(jù)綜合指標的貢獻率及累計貢獻率,用公式(3)計算出4個綜合指標的權重(Wj)分別為0.472、0.329、0.129、0.069。采用公式(4)計算甘薯的綜合耐寒性評價D值,發(fā)現(xiàn)渝菜薯1號的D值最小,表明其耐寒能力最弱;福菜薯18的D值最大,表明其耐寒能力最強。

利用卡方距離類平均法(UPGMA)對D值進行聚類分析,可將13個葉菜型甘薯品種按綜合耐寒能力劃分為4類(圖1):渝菜薯1號為第1類,屬于不耐寒型;福菜薯22、浙菜薯726為第2類,屬于輕度耐寒型;福薯7-6、萬菜薯19號、鄂菜薯1號、萬菜薯1號、渝菜薯2號、萬菜薯5號為第3類,屬于中度耐寒型;福菜薯23、廣菜薯6號、福菜薯18、渝菜薯3號為第4類,屬于高度耐寒型。

圖1 13個葉菜型甘薯品種的耐寒性聚類樹狀圖Fig.1 Cluster dendrogram of cold resistance of 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

2.4 回歸方程建立及鑒定指標篩選

為分析各單項生理指標與品種耐寒性之間的關系,篩選可靠的耐寒性鑒定指標,建立可用于葉菜型甘薯品種耐寒性評價的數(shù)學模型,將耐寒性綜合評價值D值作因變量,各單項生理指標的耐寒系數(shù)作自變量進行逐步回歸分析,建立最優(yōu)回歸方程:D=0.283+0.0171X1-0.074X3+0.166X4+0.409X5-0.874X7-0.067X8+0.116X9+0.030X10,方程決定系數(shù)R2=0.9985,P=0.0001。各品種估計精度均在95%以上(表7),證明方程中的指標對葉菜型甘薯的耐寒性影響顯著,可用于葉菜型甘薯品種的耐寒性評價。

表7 13個葉菜型甘薯品種的回歸值及精度分析Table 7 Regression value and precision analysis of 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

由回歸方程可知,10個單項生理指標中有POD(X1)、CAT(X3)、SOD(X4)、SP(X5)、TMC(X7)、Chl(X8)、Car(X9)、Chl a/b(X10)等8個指標對葉菜型甘薯的耐寒性影響顯著。因此,可在相同條件下測定葉菜型甘薯品種的上述8個指標并求得其耐寒系數(shù),進而利用該方程預測葉菜型甘薯品種的耐寒性。

3 討 論

POD、APX、CAT、SOD作為植物抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分,通過酶活性的提高可以有效清除細胞中富余的活性氧自由基等毒害物質,在維護細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起到至關重要的作用。有研究認為POD、CAT活性隨溫度降低而升高[21],也有試驗表明POD活性隨溫度降低而降低[22];各品種的SOD活性有不同的變化規(guī)律,有增亦有減[23]。崔強旺等[11]對低溫脅迫下葉菜型甘薯葉片生理生化變化進行研究,結果顯示不同品種的POD、SOD活性變化規(guī)律不同,可能是由于品種的耐寒性不同。王萍等[24]對耐寒性不同的兩個仁用杏進行8個低溫處理(18 ℃為對照),結果表明抗晚霜能力強的仁用杏品種在低溫脅迫下的APX活性高出對照最多。范博[25]對小麥進行低溫脅迫發(fā)現(xiàn):APX活性與H2O2含量呈正相關,且在清除H2O2的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本試驗中,甘薯品種的CAT、SOD活性在低溫脅迫下均表現(xiàn)出減少的趨勢,表明這部分活性氧清除系統(tǒng)尚未被激活,或這兩類酶所負責的保護系統(tǒng)已被損傷,沒有起到保護細胞的作用;但POD、APX活性增加表明POD、APX可能是葉菜型甘薯適應低溫的主要貢獻者,尤其POD活性變化大,高達對照的6.6倍,這表明保護酶系統(tǒng)已被激活,只是激活不完全。

低溫脅迫下,植物會積累滲透調節(jié)物質,如可溶性蛋白、可溶性糖等,這些物質承擔著調節(jié)細胞滲透壓的責任。低溫條件下,具有強親水能力的可溶性蛋白含量增加,使細胞束縛更多水分以阻止原生質結冰,從而提高植物的耐寒能力[26];可溶性糖作為植物體內重要的滲透調節(jié)物質和防脫水劑,通過降低細胞水勢來增強持水力,對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用,因此常用作抗性篩選指標。武輝等[12]研究表明,低溫脅迫下耐寒性強的植物可溶性蛋白和可溶性糖含量增加幅度比耐寒性差的植物大。這與本研究結果一致,低溫脅迫下各葉菜型甘薯品種葉片中的可溶性蛋白和可溶性糖含量均有不同程度的增加,且耐寒性強的品種增幅比耐寒性弱的品種大。

低溫脅迫導致葉綠體超微結構被破壞,致使葉綠體膜中的光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞受阻,葉綠體色素合成酶活性降低,合成葉綠素原料不足,植物機體代謝減緩,葉片中葉綠素含量降低,從而影響植物的光合作用。前人對耐寒性不同的黃瓜和水稻幼苗研究發(fā)現(xiàn):在低溫下,細胞器中葉綠體反應最為敏感[27]。本試驗結果表明,甘薯葉綠素、類胡蘿卜素含量在低溫下較對照均有所降低,Chl a/b卻呈升高趨勢,表明植物受低溫脅迫時,葉綠體遭到破壞,葉綠素被分解,因此葉綠素、類胡蘿卜素含量降低;而Chl a/b升高可能是由于葉綠素b對低溫更為敏感,分解較葉綠素a快,或是葉綠素b與葉綠素a之間完成了某種形態(tài)的轉化,兩者之間的變化關系與轉化方式還有待進一步研究。

4 結 論

低溫脅迫條件下,不同葉菜型甘薯品種發(fā)生不同程度的生理變化,抗氧化酶系統(tǒng)中的POD和APX是保護細胞的主要貢獻者;葉片中的可溶性蛋白和可溶性糖含量均有不同程度的增加,且耐寒性強的品種增幅比耐寒性弱的品種大;甘薯葉片的葉綠體遭到破壞,葉綠素被分解,導致葉綠素、類胡蘿卜素含量有所降低。

通過隸屬函數(shù)法和聚類分析將13個葉菜型甘薯品種按照耐寒性強弱劃分為4類:不耐寒型、輕度耐寒型、中度耐寒型和高度耐寒型,根據(jù)品種的耐寒性可選擇適合的季節(jié)推廣種植,以獲得較高的經濟效益。通過逐步回歸分析法建立了葉菜型甘薯耐寒性評價模型,根據(jù)回歸方程篩選出POD、CAT、SOD、SP、TMC、Chl、Car及Chl a/b 8個耐寒性鑒定指標。通過測定這些指標,可在相同條件下進行不同葉菜型甘薯品種耐寒性的鑒定和預測。結合隸屬函數(shù)綜合評價模型得出,供試13個葉菜型甘薯品種耐寒能力排名前3的是福菜薯18、渝菜薯3號、廣菜薯6號,可在早春推廣種植耐寒能力強的品種,使其提早上市,搶占市場。