CXCR3及其配體對脊柱結(jié)核的診斷價值

李汶諭

(鶴壁煤業(yè)(集團)有限責(zé)任公司總醫(yī)院骨科,河南鶴壁 458030)

結(jié)核分枝桿菌主要通過呼吸道傳播,感染后可通過血液到達骨骼和消化系統(tǒng)等身體多個系統(tǒng),脊柱結(jié)核(spinal tuberculosis,ST)是常見的肺外結(jié)核類型,約占肺外結(jié)核發(fā)病率的50%[1]。臨床上ST的診斷比肺結(jié)核更具有挑戰(zhàn)性,穿刺病理檢查和成像雖然可輔助診斷ST,但病理檢查屬有創(chuàng)檢查,而包括磁共振在內(nèi)的影像檢查的特異性較低[2]。因此,探討輔助診斷ST的生物標(biāo)記物對ST的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估具有重要作用。輔助性T細(xì)胞1型(helper T cell type 1,Th1)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在結(jié)核病耐藥中發(fā)揮主導(dǎo)作用,CXC趨化因子受體3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)系統(tǒng)在Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮重要作用。CXCR3配體包括三種趨化因子:趨化因子CXC配體9(chemokine CXC ligand 9,CXCL9),由IFN-c誘導(dǎo)的單因子;趨化因子CXC配體10(chemokine CXC ligand 10,CXCL10),由IFN-c誘導(dǎo)的10kDa蛋白;CXCL11,IFN誘導(dǎo)的T細(xì)胞趨化劑[3]。這些趨化因子誘導(dǎo)CD4效應(yīng)T細(xì)胞運輸?shù)礁腥静课?。CXCL10作為結(jié)核病的生物標(biāo)志物已經(jīng)得到相關(guān)研究證實[4],但CXCL9、CXCL10對ST的診斷價值較少見報道。本研究觀察了ST和非ST患者血清CXCR3配體水平及CXCR3配體對ST的診斷價值,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),選擇2019年1月～2021年6月在本院就診的53例ST患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn):具有典型結(jié)核感染癥狀,且出現(xiàn)脊髓壓迫癥狀,經(jīng)病理學(xué)確診為ST;年齡18～65歲;患者對研究知情并簽署知情同意書。排除患有其他免疫疾病、腫瘤疾病、HIV感染或代謝紊亂者。按年齡“±2歲”、性別相同、1∶1匹配的原則,抽取同期在本院接受健康體檢的53例受試者作為對照組。對照組患者沒有任何活動性結(jié)核史或近期與任何活動性結(jié)核患者密切接觸史。兩組受試者的一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組受試者一般資料比較

1.2 研究方法

所有受試者均于清晨空腹抽取外周靜脈血10 mL,分2管存放,每管5 mL。用于酶聯(lián)免疫吸附法檢測的靜脈血置室溫放置2 h,以3000 r/min的速度離心15 min,分離血清在-80 ℃進行儲存;檢測前從冰箱中取出待測樣品,室溫下放置60 min,采用ELISA法檢測CXCR3及CXCL9、CXCL10、IFN-γ水平,嚴(yán)格按照操作說明書操作,試劑購自賽默飛世爾。另取5 mL靜脈血行紅細(xì)胞溶解,使用TRIzol試劑從白細(xì)胞中提取總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit(賽默飛世爾公司)操作說明通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系:2 μL cDNA、1 μL正向引物,1 μL反向引物,12.5 μL的TB Green Premix Ex Taq和8.5 μL的DEPC。PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性95 ℃30 s,1個循環(huán);PCR95 ℃5 s,60 ℃30 s,40個循環(huán);采用GAPDH作為內(nèi)參,采用比較循環(huán)抑制法(2-ΔΔq)計算相對表達量。引物序列:GAPDH:正向5’-CATCCACTGGTGCTGCCAAGGCTGT-3’,反向5’-ACAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCCA-3’;CXCR3:正向5’-ATGCGAGAGAAGCAGCCTTT-3’,反向:5’-TCCTATAACTGTCCCCGCCA-3’;CXCL9:正向5’-GAAGCAGCCAAGTCGGTTAGTG-3’,反向5’-AATCATCAGCAGTGTGAGCAGTG-3’;CXCL10:正向5’-TGGCATTCAAGGAGTACCTC-3’,反向5’-TTGTAGCAATGATCTCAACACG-3’;IFN-γ:正向5’-CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA-3’,反向5’-ACAGTTCAGCCATCACTTGGA-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用獨立樣本t檢驗(正態(tài)分布資料)或非參數(shù)檢驗(非正態(tài)分布資料);計數(shù)資料采用卡方檢驗,采用ROC曲線計算不同指標(biāo)診斷ST的靈敏度、特異性、最佳截斷值(cut-off)、曲線下面積(area under curve,AUC)和95%CI,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組患者的血清CXCL3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ水平及其mRNA表達水平均顯著高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2-3。

表2 兩組受試者血清IFN-γ、CXCL3及配體表達水平相比較(pg/mL)

血清IFN、CXCL3、CXCL9、IFN-γ診斷ST的靈敏度分別為88.7%、84.9%、88.7%、81.1%,特異性分別為88.7%、96.2%、94.3%、94.3%,AUC分別為0.933、0.915、0.961、0.918。見表4和圖1。

圖1 血清IFN-γ、CXCL3及配體診斷ST的ROC曲線

表4 血清IFN-γ、CXCL3及配體診斷ST的臨床價值

外周血IFN、CXCL3、CXCL9和IFN-γ的mRNA水平診斷ST的靈敏度分別為81.1%、81.1%、86.8%和84.9%,特異性分別為73.6%、96.2%、98.1%和88.7%,AUC分別為0.829、0.926、0.921和0.935。見表5和圖2。

表3 兩組受試者外周血中IFN-γ、CXCL3和配體mRNA表達水平比較

表5 外周血中IFN-γ、CXCL3和配體mRNA表達水平診斷ST的臨床價值

圖2 外周血中IFN-γ、CXCL3和配體mRNA水平診斷ST的ROC曲線

3 討論

ST是最常見的骨關(guān)節(jié)結(jié)核,其病因是結(jié)核分枝桿菌入侵宿主,繁殖并通過血液和淋巴管傳播到椎體邊緣,導(dǎo)致椎體或椎間盤破壞、脊柱畸形、功能障礙、截癱甚至死亡[5]。結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),在此期間,特異性Th1細(xì)胞被結(jié)核分枝桿菌抗原致敏,產(chǎn)生IFN-γ。IFN-γ是細(xì)胞抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的重要因子,可誘導(dǎo)趨化因子發(fā)揮作用,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活,從而發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌的免疫作用[6]。

趨化因子受體主要表達于骨髓中的各種白細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等,可調(diào)節(jié)白細(xì)胞在組織中的轉(zhuǎn)運和細(xì)胞歸巢,在免疫細(xì)胞和免疫器官的發(fā)育、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和病原體感染中發(fā)揮生理和病理作用[7]。CXCR3主要表達于活化的T淋巴細(xì)胞(特別是Th1細(xì)胞)、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等表面,是活化T細(xì)胞中重要的趨化因子受體,受到刺激時,在T細(xì)胞表面迅速上調(diào)并高度表達[8]。既往研究顯示,ST患者病灶區(qū)的CXCR3陽性表達面積高于對照組[9]。ST患者感染結(jié)核分枝桿菌后,T細(xì)胞能夠識別結(jié)核分枝桿菌并與其對抗,同時分泌IFN-γ,IFN-γ進一步誘導(dǎo)CXCR3配體產(chǎn)生,促進CXCR3和CXCR3配體在Th1細(xì)胞的結(jié)合,招募更多的Th1細(xì)胞進入炎癥部位以發(fā)揮炎癥作用。

CXCL9是趨化因子CXC亞族的一員,體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞受到IFN-γ刺激產(chǎn)生CXCL9,其受體是CXCR3,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。CXCL9的趨化性主要由CXCR3介導(dǎo),CXCL9和CXCR3結(jié)合后,CXCR3被激活,刺激Src磷酸化和Src激酶活性,并增加磷脂酰肌醇3激酶和AKT活性,參與炎癥反應(yīng)的病理過程[10]。ST組中CXCR3和CXCL9表達增加,可能加強CXCR3和CXCL9結(jié)合,激活下游通路,增強結(jié)核分枝桿菌感染期間的炎癥反應(yīng)[11]。CXCL10是CXC非ELR亞家族中的趨化因子之一,受IFN-γ刺激的細(xì)胞可直接分泌CXCL10,CXCL10選擇性激活T細(xì)胞中IFN-γ基因的表達,正反饋可招募更多T細(xì)胞,參與細(xì)胞生長、分化、凋亡和炎癥[12]。本研究中,ST組IFN-γ和CXCL10表達增加,與CXCL9的表達趨勢一致,這些結(jié)果提示CXCR3及其配體表達在ST中具有臨床意義。

既往一項研究顯示,CXCR3及其配體在肺結(jié)核的診斷中具有臨床意義[13]。本研究結(jié)果進一步提示了CXCR3及其配體在ST中的作用。本研究顯示,血清CXCR3、CXCL9、CXCL10、IFN-γ水平診斷ST的AUC均高于0.9,外周血CXCR3及其配體mRNA診斷ST的AUC均>0.8。理想的ROC曲線下面積為1,診斷性試驗中AUC在0.7～0.9之間的診斷價值中等,0.9以上時診斷價值高。本研究結(jié)果說明,血清CXCR3及其配體、外周血CXCR3及其配體mRNA診斷ST的臨床價值較高,外周血RT-qPCR獲得的CXCR3及其配體mRNA診斷價值不高于血清ELISA法結(jié)果,結(jié)果提示,ST患者可首選血清CXCR3及其配體而非RT-qPCR檢測進行診斷。

綜上所述,本研究顯示,ST患者的CXCR3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ高表達,血清CXCR3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ水平可能是輔助診斷ST的有效方式。本研究的局限性在于:樣本量較少,且來自單中心;未來需要收集更多病例進行多中心研究,進一步論證研究結(jié)論。