元寶楓、三角楓及金沙楓葉片柯里拉京含量的變異與季節(jié)變化

蘇亞靜　魯儀增　喬謙等

關(guān)鍵詞：柯里拉京；元寶楓；三角楓；金沙楓；超高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）01-0031-08

元寶楓（Acer truncatum Bunge）、三角楓（A.buergerianum Miq.）和金沙楓（A.paxii Franch.）均為槭樹科槭屬植物。元寶楓因其翅果形狀像中國古代金錠“元寶”而得名，廣布于東北、華北，西至陜西、四川、湖北，南達(dá)浙江、江西等省，園林景觀應(yīng)用中常見的秋色葉樹種，也是我國特有樹種。元寶楓葉片中含有多種生物活性成分，如黃酮、強(qiáng)心甙、綠原酸、甾體、鞣質(zhì)、多糖等，且有些成分含量較高，如綠原酸、黃酮等，在食品、醫(yī)療、飼料加工方面有著廣闊的應(yīng)用前景。三角楓是我國黃河流域以南自然分布的鄉(xiāng)土秋色葉樹種之一，不僅具有較高的觀賞價(jià)值，也具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與藥用價(jià)值，根可用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，根皮、莖皮可用于清熱解毒、消暑，葉片提取物能夠調(diào)節(jié)血糖。金沙楓則是一種常綠景觀樹種，自然分布于我國金沙江流域的四川西南部和云南西北部，山東地區(qū)偶有栽植，越冬需適當(dāng)防寒；金沙楓也具有一定的藥用價(jià)值，其根皮及枝、葉含有的化學(xué)物質(zhì)具有祛風(fēng)除濕的功效。

柯里拉京（Corilagin）是一種水溶性鞣質(zhì)，具有多種藥理活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖溶、降血壓、抑制病毒、抗菌、抗炎等。特別是在抗腫瘤方面，已有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)肝、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌以及胃癌等細(xì)胞生長具有顯著抑制作用，且柯里拉京對(duì)人體正常細(xì)胞和組織的毒性較低。目前，已在15個(gè)科和50種植物中鑒定出了柯里拉京，主要存在于大戟科（19種）、櫳牛兒苗科（10種）和使君子科（7種）中，槭屬中也有2種鑒定出了柯里拉京，分別是毛果楓（A.nikoense Maxim.）和大葉雞爪楓（A.amoenum Hu.），而同為槭屬的元寶楓、三角楓和金沙楓是否含有柯里拉京則未見報(bào)道。因此，為進(jìn)一步開發(fā)這3種楓樹的藥用價(jià)值，本試驗(yàn)通過UPLC法對(duì)這3種楓樹葉片中柯里拉京的含量進(jìn)行測定，旨在豐富用于提取柯里拉京的植物資源并提升這3種楓樹的藥用價(jià)值以及篩選藥賞兼用型品種。

1材料與方法

1.1采樣地概況

采樣地點(diǎn)位于山東省泰安市山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院園林實(shí)訓(xùn)基地，屬溫帶大陸性半濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，寒暑適宜，光溫同步，雨熱同季。春季干燥多風(fēng)，夏季炎熱多雨，秋季晴和氣爽，冬季寒冷少雪。年平均氣溫13℃，7月份氣溫最高，平均26.4℃，1月份最低，平均-2.6℃。年平均降水量697mm。

1.2試驗(yàn)材料

于2019年5月25日、6月25日、7月25日、8月26日、9月26日和10月27日共計(jì)采樣6次，采集的元寶楓、三角楓和金沙楓各個(gè)品種信息見表1。每個(gè)品種選取3株長勢(shì)一致的健康植株（3年生嫁接苗，株高2m，胸徑3～4 cm），在每株樹冠中部的枝條中部（長枝上第3、4、5對(duì)葉）采集健康無病蟲害的成熟葉片30片以上，帶回實(shí)驗(yàn)室50℃烘至恒質(zhì)量，人工磨成細(xì)粉。

1.3方法

1.3.1色譜條件 采用超高效液相色譜（UPLC）法對(duì)元寶楓、三角楓和金沙楓葉片中的柯里拉京進(jìn)行檢測，儀器為二維超高效液相色譜儀（美國Waters，型號(hào)：ACQUITY UPLC），以XBridge C18 （4.6×150 mm，3.5μm）為色譜柱，以0.4%甲酸水溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0.4%甲酸：0～2 min， 80%～75%; 2～15 min， 75%～55%; 15～20 min， 55%～10%; 20～30 min， 10%;30～32 min，10%～80%），流速為0.3 mL·min^-1，柱溫為25℃，檢測波長270 nm，進(jìn)樣量2μL。

1.3.2供試樣品和對(duì)照品溶液的制備

1.3.2.1對(duì)照樣品溶液 準(zhǔn)確稱取柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（上海源葉公司，Lot23094-69-1，純度≥98%） 5.00 mg，于50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即為含0.10 mg·mL^-1柯里拉京的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2.2供試樣品溶液 取樣品粉末約1.00 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50%的乙醇水溶液50 mL，采用超聲波儀器（成都—科儀器設(shè)備有限公司，kH-599B型）超聲（功率500 W，頻率40 kHz）提取30 min，收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮，RE-2000A）蒸發(fā)后，將固體粉末溶解于50 mL 50%甲醇中，過0.22μm濾膜進(jìn)樣待測。

1.3.3線性關(guān)系考察 取對(duì)照樣品溶液，用50%甲醇稀釋，配置濃度梯度為0.005、0.01、0.025、0.05、0.10、0.20 mg.mL^-1的溶液，按本文“1.3.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定。以柯里拉京的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析計(jì)算。

1.3.4精密度試驗(yàn) 取對(duì)照樣品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD）。

1.3.5重復(fù)性試驗(yàn) 稱取供試樣品“S-2”樣品粉末6份，每份約1.00 g，按1.3.2.2節(jié)方法制備供試溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算其RSD。

1.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液μL，每隔2 h進(jìn)樣1次，按“1.3.1”節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD。

1.3.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取供試樣品“S-2”粉末1g，共5份，分別加入柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)品1.410 mg，按1.3.2.2節(jié)的方法制備，在1.3.1色譜條件下測定，記錄色譜圖并計(jì)算加樣回收率及其RSD。

1.3.8供試樣品測定 精密稱取元寶楓、三角楓和金沙楓各品種供試樣品粉末3份，每份約1.0 g，按1.3.2.2節(jié)的方法制備，在1.3.1節(jié)色譜條件下測定其絕對(duì)含量。

2結(jié)果與分析

2.1 3種楓樹葉片柯里拉京的測定

通過比較供試樣品與柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間，可以確定這3種楓樹葉片中均含柯里拉京（圖1）。

進(jìn)一步對(duì)方法學(xué)進(jìn)行考察，結(jié)果表明：標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5×10⁷X+28 168，r=0.999 3，線性范圍為0.005～0.20 mg；精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.12%、0.42%、0.92%；平均加樣回收率為95.31%，RSD為1.45%（表2）。以上結(jié)果表明，所建立的UPLC方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，回收率達(dá)到了95.31%，可用于元寶楓、三角楓和金沙楓葉片中柯里拉京的測定。

2.2 3種楓樹葉片中柯里拉京的含量差異及月動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 3種楓樹葉片柯里拉京含量的比較分析對(duì)元寶楓、三角楓和金沙楓葉片柯里拉京含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果（圖2）表明：3個(gè)樹種之間含量存在較大差異，三角楓柯里拉京含量最多，金沙楓次之，元寶楓最低。元寶楓、三角楓、金沙楓葉片中柯里拉京含量范圍分別為0.097 6～0.6079、1.496 4～6.888 7、0.062 7～2.664 0 mg·g^-1，平均分別為0.244 5、3.311 7、1.179 2 mg·g^-1。由上可見，三角楓更適合作為提取柯里拉京的原材料，金沙楓和元寶楓可作為候選資源。

2.2.2三角楓不同品種葉片柯里拉京的含量差異及月動(dòng)態(tài)變化對(duì)三角楓4個(gè)不同品種葉片柯里拉京在5月到10月的含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果（表3）表明：三角楓不同品種葉片的柯里拉京含量在不同月份間均存在較大差異，5月到10月的變異系數(shù)范圍為12.86%～52.58%；4個(gè)品種中，‘興旺的平均含量最高（4.4200 mg·g^-1），其次是‘千里紅、‘龍楓、‘齊魯金的含量最低，僅為‘興旺含量的一半；4個(gè)品種的月平均含量為2.479 8～4.778 9 mg·g^-1，10月份較高，其次是7、8月份，5、6、9月份含量較低。

三角楓4個(gè)不同品種葉片柯里拉京含量對(duì)比可知：‘興旺在5、7、8和9月的含量明顯高于其它品種，具有較大優(yōu)勢(shì)，而在10月稍低于‘千里紅，‘千里紅9月到10月含量急劇上升，達(dá)最高值（6.888 7 mg·g^-1）；‘齊魯金和‘龍楓9月到10月含量緩慢上升，同樣在10月達(dá)峰值，分別為3.320 4、3.087 6 mg·g^-1，明顯低于‘興旺和‘千里紅?？傮w看，三角楓4個(gè)品種的柯里拉京含量相比，‘興旺和‘千里紅更優(yōu)，‘齊魯金和‘龍楓次之；采收時(shí)間以10月份最佳。

2.2.3金沙楓不同品種葉片柯里拉京的含量差異及月動(dòng)態(tài)變化表4表明：金沙楓不同品種在不同月份葉片柯里拉京的含量存在顯著性差異，5月到10月的變異系數(shù)范圍為10.17%～90.21%。金沙楓月平均含量介于0.404 5～1.9181 mg·g^-1，5-10月月均含量一直呈下降趨勢(shì)，5月平均含量最高為1.9181mg·g^-1。

金沙楓2個(gè)品種葉片柯里拉京含量對(duì)比可看出：‘魯綠為先升后降，5月到6月含量升高，6月達(dá)最高值（ 2.664 0 mg·g^-1），6月到10月含量持續(xù)降低；‘豐彩為先降再升后降，在5月含量最高（1.723 0 mg·g^-1），5月到7月逐步降低，7月到8月含量有所升高，8月到10月緩慢降低。2個(gè)品種的變化趨勢(shì)雖有較大差異，但其5月和6月的含量都高于其他月份。由此可見，金沙楓‘魯綠和‘豐彩葉片采收時(shí)間最好在6月和5月。

2.2.4元寶楓不同品種葉片柯里拉京的含量差異及月動(dòng)態(tài)變化表5表明：元寶楓不同品種在不同月份的柯里拉京含量均存在較大差異，4個(gè)品種葉片的柯里拉京含量5月到10月的變異系數(shù)范圍為36.00%～67.74%，6月份變異系數(shù)最大；4個(gè)品種月平均含量介于0.1717～0.2994 mg·g^-1，其中，5、6月份平均含量較高，其次是10月份，7、8、9月份含量較低。

元寶楓4個(gè)不同品種葉片柯里拉京含量月動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)：‘彩蝶翻飛和‘紅精靈這2個(gè)品種的變化趨勢(shì)一致，均為先降后升，即5月到8月含量降低，8月到10月含量升高，最高值分別出現(xiàn)在5月（0.4380 mg·g^-1）和10月（0.359 8mg·g^-1）；‘綠寶石5月到6月含量快速升高，在6月達(dá)峰值（0.6079 mg·g^-1），7月到10月含量變化不大；‘慶典的變化趨勢(shì)一直處于波動(dòng)中，在5月到10月出現(xiàn)了多次升高和降低，但幅度都較小，最高值出現(xiàn)在5月（0.2111 mg·g^-1）。總之，4個(gè)品種中‘綠寶石更適宜用作提取柯里拉京的候選資源，最佳采葉時(shí)間在6月份。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，槭屬的不同樹種之間、同一樹種不同品種之間以及不同采收時(shí)間葉片柯里拉京含量均存在較大差異。首先，同為槭屬的3種楓樹，三角楓柯里拉京含量要明顯高于金沙楓，金沙楓又高于元寶楓。前人研究表明，同屬不同樹種之間柯里拉京含量通常會(huì)存在較大差異。如同為葉下珠屬（Phy/lanthus L.）的葉下珠（Phyllanthus urinariaL.）、珠子草（Phyllanthus niruri L.）和蜜柑草（Phyllanthus ussuriensis Rupr. et Maxim.）地上部分柯里拉京含量分別為2.288、2.400、0.1613mg·g^-1，蜜柑草與前二者存在較大差異。同為老鸛草屬（Geranium）的老鸛草（Geranium wilfordii Maxim.）、鼠掌老鸛草（Geranium sibiricum L.） 和野老鸛草（Geranium carolinianum L.）全株的柯里拉京含量分別為2.0、0.593 6、4.10 mg·g^-1，三者之間也存在較大差異。牻牛兒苗屬的芹葉櫳牛兒苗（Erodiumcicutarium （L.）L'Herit.）和櫳牛兒苗（Erodium stephanianum Willd.），欖仁樹屬的微毛訶子（Termina/ia chebula Retz. var. tomentella （Kurz）C.B.Clarke）、油欖仁（Terminalia bellirica（Gaertn.） Roxb.）和欖仁樹（Terminalia catappaL.） 同樣存在較大差異。

元寶楓不同品種之間葉片柯里拉京含量差異顯著。目前，不同品種之間柯里拉京含量的差異還未見報(bào)道，但不同產(chǎn)地的葉下珠、余甘子（Phyllanthus emblica L.）柯里拉京含量均存在較大差異。3種楓樹不同品種之間柯里拉京含量差異較大，元寶楓品種間變異系數(shù)最高為67.74%，三角楓為52.58%，金沙楓為90.21%。本文屬首次研究不同品種之間柯里拉京含量的差異，只是研究的品種量不夠多，且所選品種有些較獨(dú)特，如三角楓‘興旺是天然四倍體植株，‘齊魯金是一種黃葉突變體，這可能也是導(dǎo)致品種間差異過大的原因。因此，不同品種之間柯里拉京的含量差異還有待更細(xì)致的研究。

3種楓樹葉片柯里拉京含量5月到10月的變化趨勢(shì)不同，且最佳采收時(shí)間也不一致。元寶楓和金沙楓多在5月和6月柯里拉京含量高，三角楓則是在10月。據(jù)報(bào)道，鼠掌老鸛草在7月達(dá)到最高值；與鼠掌老鸛草同屬的老鸛草柯里拉京含量則在8月達(dá)到最高值。這說明確定某樹種葉片最佳采收時(shí)間是必要的，不能直接參照同屬植物的研究結(jié)果。

植物是動(dòng)態(tài)變化的有機(jī)體，柯里拉京作為多酚中的單寧類，它在植物中不是固定不變的，而是受到了多種內(nèi)在和外在因子的影響。內(nèi)在因子如不同的基因型、關(guān)鍵酶的調(diào)控等，都會(huì)導(dǎo)致不同樹種、同一樹種不同品種的柯里拉京含量存在較大差異；而外在環(huán)境因子如光照、溫度、生長發(fā)育階段、產(chǎn)地等都可能造成柯里拉京含量季節(jié)變化的不同。柯里拉京的生物合成機(jī)制尚未見報(bào)道，影響其含量的關(guān)鍵因子還無從得知，由此可知，針對(duì)柯里拉京及其資源探索還有太多的研究空間。

4結(jié)論

首次測定并發(fā)現(xiàn)元寶楓、三角楓和金沙楓葉片中含有柯里拉京。所建立的UPLC法具有良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和精密度，且平均加樣回收率達(dá)95.31%，可用于3種楓樹葉片中柯里拉京的定量分析。槭屬的不同樹種、同一樹種的不同品種之間和不同采收時(shí)間葉片柯里拉京的含量均存在顯著性差異。元寶楓葉片柯里拉京在5月到10月的含量變化范圍為0.097 6～0.6079 mg·g^-1，三角楓的含量變化范圍為1.496 4～6.888 7 mg·g^-1，金沙楓的含量變化范圍為0.062 7～2.664 0 mg·g^-1。可見，3種楓樹葉片柯里拉京含量相比，三角楓含量最高，金沙楓次之，元寶楓最低。