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    ATP7Bp.Ser1369Tyrfs*24突變致肝豆?fàn)詈俗冃?例報告

    2023-04-29 00:12:41劉玉婷唐志慧賓瓊
    臨床肝膽病雜志 2023年4期

    劉玉婷 唐志慧 賓瓊

    關(guān)鍵詞:肝豆?fàn)詈俗冃? 高通量核苷酸序列分析; ATP7B基因

    基金項目:廣西自然科學(xué)基金(2018JJB140029);? 廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點學(xué)科項目

    A case of hepatolenticular degeneration caused by ATP7B p.Ser1369Tyrfs*24 mutation

    LIU Yuting, TANG Zhihui, BIN Qiong. (Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin, Guangxi 541001, China)

    Corresponding author:

    BIN Qiong, binqiong1386@126.com (ORCID:0000-0002-0555-4219)

    Key words:

    Hepatolenticular Degeneration; High-Throughput Nucleotide Sequencing; ATP7B Gene

    Research funding:

    Natural Science Foundation of Guangxi Province (2018JJB140029); Guangxi Medical and Health Key Disciplines

    肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson?。╓ilsons disease, WD),是由一種銅代謝障礙所致的常染色體隱性遺傳病,其發(fā)病機制主要是位于第13號染色體長臂(13q14.3~q21.1)上的ATP7B基因突變,導(dǎo)致ATP7B蛋白功能障礙引起銅排泄障礙,進(jìn)而造成銅大量沉積于組織器官,尤以肝臟、大腦多見[1]。目前WD全球患病率為1/5 000~1/30 000,ATP7B突變基因攜帶率為1/90[2-3],該疾病主要通過血清銅藍(lán)蛋白、24 h尿銅、青霉胺負(fù)荷試驗、肝細(xì)胞含銅測定及基因測序等檢查進(jìn)行輔助診斷[1]。WD是一種早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可有效遏制疾病進(jìn)展、預(yù)后良好的遺傳性疾病,因此早期診斷和治療可大大減少該病的致殘率及死亡率。本文通過對先證者及其家系的基因檢測并結(jié)合相關(guān)輔助檢查,明確了患兒及其胞兄WD的診斷,進(jìn)一步豐富了ATP7B基因突變譜。

    1 病例資料

    先證者,患兒男性,5歲3月齡,1年前因體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常,未予處理。于2021年11月以“發(fā)現(xiàn)肝功能異常1年”為主訴至本院兒科住院。查體:肝肋下4 cm可觸及,質(zhì)韌,邊鈍,無壓痛,余無特殊。完善WD相關(guān)檢查:肝功能示總膽紅素4.95 μmol/L,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶180.59 U/L,天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶119.6 U/L;銅藍(lán)蛋白5.9 mg/dL;24 h尿銅92.7 μg;頭顱MRI未見明顯異常;腹部MRI提示脂肪肝,肝肋下4 cm;眼部檢查提示雙眼上方角鞏膜緣見血管翳,下方角鞏膜緣見少量色素沉著,裂隙燈檢查未見明顯角膜色素環(huán)(K-F環(huán));其余檢查:凝血功能示纖維蛋白原1.71 g/L;凝血因子檢測示多種凝血因子活性降低,其中凝血因子Ⅱ活動度54.5%,凝血因子Ⅸ活動度60.3%,凝血因子Ⅹ活動度65.1%,凝血因子Ⅺ活動度62.9%;肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒核酸、自身免疫性肝病相關(guān)檢查均未見異常。追問家族史,先證者胞兄亦有長期肝功能異常病史,檢查銅藍(lán)蛋白5.0 mg/dL,父母否認(rèn)肝功能異常,因此建議該家族完善WD相關(guān)基因檢測。采集先證者、父母及兄長外周血2~3 mL,根據(jù)核酸提取及純化試劑(博奧木華)操作說明書要求,從外周血中提取基因組DNA。采用QIAseq FX DNA Library Kit試劑盒及定制的單基因病panel,制備包含ATP7B基因全部外顯子及剪切區(qū)域的文庫,采用AMPure XP beads純化體系進(jìn)行純化并采用Quant-iTTM 1X dsDNA HS Assay Kit和QubitTM熒光計對文庫進(jìn)行定量檢測。采用NadPrep NanoBlockers(for Illumina)、NadPrep Hybrid Capture Reagents、KAPA Library Amplification、NovaSeq 6000 Reagent試劑盒,按照操作說明書要求,對先證者文庫雜交捕獲并進(jìn)行捕獲后產(chǎn)物的擴(kuò)增、純化并在NovaSeq 6000測序儀上進(jìn)行高通量測序。與hg19的參考序列和基因組分析工具包進(jìn)行比對,進(jìn)行變異調(diào)用。使用ANNOVAR工具對變異進(jìn)行分析,該工具包含注釋數(shù)據(jù)庫,如1000基因組數(shù)據(jù)庫、dbSNP數(shù)據(jù)庫、ClinVar數(shù)據(jù)庫、多態(tài)性表型v2數(shù)據(jù)庫以及SIFT數(shù)據(jù)庫。對先證者的可疑致病位點設(shè)計相應(yīng)引物,進(jìn)行Sanger測序驗證。擴(kuò)增區(qū)域1∶chr13∶52523855+52524461,對應(yīng)的引物序列正向為CAACGTCAAAGTTGACATGATG,反向為TGGATGGGAAAGTCCTGG;擴(kuò)增區(qū)域2∶chr13∶52509545+52510015,對應(yīng)的引物序列正向為AATTGCCTGCTCATGGTG,反向為CAGCTTTCTAGGAAGCCTCAC,擴(kuò)增長度為500 bp。采用ABI9700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件如下:95 ℃變性5 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物純化后用ABI3730基因分析儀進(jìn)行雙向測序,Sequencher軟件分析測序結(jié)果。

    先證者家系遺傳圖及基因測序結(jié)果如圖1所示,先證者的ATP7B基因編碼區(qū)存在2個變異,其中遺傳自母親的c.2662A>C(p.Thr888Pro)為ATP7B基因編碼區(qū)的錯義變異(圖1a),該基因位點突變最近已有文獻(xiàn)[4-5]報道為WD的致病突變,且與現(xiàn)有文獻(xiàn)[6-8]報道的WD致病突變(p.Ile1148Thr;p.Pro992Leu)呈反式排列,故該變異確定為致病變異。另一變異遺傳自父親的c.4106delC(p.Ser1369Tyrfs*24)為ATP7B基因編碼區(qū)的移碼變異(圖1b),該變異目前未見ATP7B基因變異數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報道,為新發(fā)突變。同時,先證者兄長的ATP7B基因測序結(jié)果同先證者,突變位點詳見表1。通過基因分析可見,該家系中父親的ATP7B基因發(fā)生c.4106delC缺失突變,引起第1369位點發(fā)生移碼突變,由絲氨酸突變?yōu)槔野彼幔⒗^續(xù)編碼23個氨基酸后終止。此突變理論上導(dǎo)致該基因編碼氨基酸序列的提前終止,該變異下游仍有多個無義變異致病的報道[9-11],提示該變異所致氨基酸序列缺失部分對蛋白質(zhì)功能有重要作用。先證者和兄長均有WD的表型,基因測序結(jié)果顯示二者基因型相同,根據(jù)遺傳圖譜分析(圖1c),父母分別攜帶1個突變,2個小孩均遺傳了2個突變,符合常染色體隱性遺傳模式中復(fù)合雜合突變致病的機制。根據(jù)以上證據(jù),ATP7B c.4106delC(p.Ser1369Tyrfs*24)考慮為新發(fā)的致病突變。

    2 討論

    WD發(fā)病可見于任何年齡,但多起病于兒童及青少年期[12],根據(jù)臨床癥狀可分為以下分型。(1)肝型:WD中最常見類型,該型多見于兒童及青少年,以肝損傷為表現(xiàn),可見進(jìn)行性轉(zhuǎn)氨酶升高、急性或慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至急性肝衰竭,但也可以無癥狀表現(xiàn)。(2)腦型:以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主,常較肝型發(fā)病晚10年,可出現(xiàn)智力倒退、構(gòu)音障礙、吞咽障礙、運動障礙、不自主運動、震顫、精神癥狀,該型癥狀輕時不易發(fā)現(xiàn),察覺時已進(jìn)入中后期。(3)其他型:如出現(xiàn)腎臟疾病、骨病、肌肉疾病、皮膚色素沉著、K-F環(huán)及溶血性貧血等。(4)混合型:以上各型的組合[1,13]。WD的診斷金標(biāo)準(zhǔn)為肝穿刺活組織檢查肝細(xì)胞銅含量>250 μg/g,但其為有創(chuàng)性檢查,故臨床應(yīng)用較少[14]。目前該病主要通過臨床表現(xiàn)結(jié)合輔助檢查如生化指標(biāo)、影像學(xué)及基因檢測進(jìn)行診斷,其中生化指標(biāo)主要包括血清銅藍(lán)蛋白<200 mg/L、24 h尿銅>100 μg,影像學(xué)例如腹部彩超、CT、MRI及頭顱MRI(最常見的是基底節(jié)區(qū)或橋腦的改變)等。結(jié)合本病例,先證者為學(xué)齡前兒童,以肝臟病變?yōu)槭装l(fā)癥狀,出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、多種凝血因子活動度降低、脂肪肝,肝大、血清銅藍(lán)蛋白明顯降低、尿銅升高等表現(xiàn),因此考慮可能為肝型WD,為進(jìn)一步驗證,建議家屬完善家系基因檢測。

    隨著基因檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步,加之ATP7B基因突變位點的報道增加,基因檢測成為WD的一線篩查方法。根據(jù)人類基因數(shù)據(jù)庫記載,目前ATP7B基因發(fā)現(xiàn)有938個突變位點,種族、地域分布與突變的頻率和種類顯著相關(guān),其中歐洲WD以c.3207C>A(His1069Gln)為最常見的突變位點,基因頻率為13%~61%,亞洲WD以c.2333G>T(Arg778Leu)為常見突變位點,基因頻率為34%~38%[13]。另外Cheng等[15]針對中國WD人群研究發(fā)現(xiàn),肝型多見于p.Ser406Ala、p.Val456Leu突變,腦型多見于c.2755C>G(p.Arg919Gly)、c.3443T>C (p.I1e1148Thr)突變,而c.2804C>T(p.Thr935Met)突變常表現(xiàn)為混合型。Li等[16]研究統(tǒng)計結(jié)果顯示,WD先證者的直系兄弟姐妹患WD的概率為25%,而其子女患WD的概率為0.5%。在歐洲兒童WD診療指南[17]中也提出,一旦確診WD,先證者的一級親屬(兄弟姐妹、后代及父母)均應(yīng)完善肝功能、銅代謝指標(biāo)及基因檢測。

    根據(jù)2001年德國萊比錫第8次WD國際會議上制訂的Leipzig評分[18],并結(jié)合本病例已完善的相關(guān)檢查結(jié)果進(jìn)行評分,先證者Leipzig評分為5分(24 h尿銅92.7 μg計1分,ATP7B基因外顯子測序為復(fù)合雜合突變計4分),其兄長Leipzig評分為4分(ATP7B基因外顯子測序為復(fù)合雜合突變計4分),兩者總分均≥4分,故均診斷為WD。

    綜上,通過本病例研究明確了c.2662A>C(p.Thr888Pro)及c.4106delC(p.Ser1369Tyrfs*24)突變位點為該家系患有WD的遺傳因素,同時該家系的c.4106delC(p.Ser1369Tyrfs*24)移碼突變?yōu)锳TP7B基因新發(fā)突變位點,進(jìn)一步豐富了ATP7B基因突變譜。年齡<10歲的患者若以肝臟疾病為首發(fā)癥狀起病時,需警惕WD可能。對高度疑似及確診的WD患者應(yīng)進(jìn)行直系親屬的WD篩查,以便于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療,進(jìn)而有效遏制疾病進(jìn)展,減少該病的致殘率及死亡率。

    倫理學(xué)聲明:本例報告已獲得患者家屬知情同意。

    利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:劉玉婷負(fù)責(zé)撰寫論文;唐志慧負(fù)責(zé)收集資料;賓瓊負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章,修改文章及最后定稿。

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    收稿日期:

    2022-08-04;錄用日期:2022-09-05

    本文編輯:葛俊

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