云南咖啡銹菌生理小種鑒定

白學(xué)慧 ，蕭自位 ，馬關(guān)潤 ，羅 琴 ，陳振佳 ，李錦紅 *

（1.云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南瑞麗 678600；2.中國咖啡工程研究中心，云南芒市 678400）

咖啡是世界上重要的飲料作物和熱帶經(jīng)濟(jì)作物，云南熱區(qū)咖啡適種區(qū)面積約40 萬hm2，截至2021 年底，咖啡種植面積9.29 萬hm2、農(nóng)業(yè)產(chǎn)值26.04 億元，綜合產(chǎn)值339.25 億元。云南省咖啡面積、產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)產(chǎn)值均占全國的98%以上。咖啡產(chǎn)業(yè)是云南省打造世界一流“綠色食品牌”的高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一。 由咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrixBerk. & Br.）引起的咖啡銹病是咖啡生產(chǎn)中最重要的病害，在世界各主要咖啡產(chǎn)區(qū)均有不同程度發(fā)生，并以流行猛烈、傳播迅速、損失慘重而著稱［1］，在適宜的氣候條件下，咖啡銹病可以導(dǎo)致葉片損失達(dá)50%，漿果損失達(dá)70%［2］?？Х蠕P病在中美洲及哥倫比亞、秘魯和厄瓜多爾發(fā)生嚴(yán)重并廣泛流行，造成了很大危害［3-5］?？Х蠕P病對(duì)云南小粒種咖啡的產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大，是限制咖啡產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素［6］，種植咖啡抗病品種是控制該病害最為經(jīng)濟(jì)、有效和安全的措施［7］。

弄清病原菌生理小種分化情況是開展抗銹育種的前提和基礎(chǔ)。在咖啡種植國當(dāng)中，印度最先對(duì)咖啡銹病進(jìn)行研究，印度學(xué)者M(jìn)ayne 首次報(bào)道印度存在咖啡銹菌生理分化現(xiàn)象，鑒定出2 個(gè)小種［8］，并于1939 年鑒定出另外兩個(gè)生理小種（race3 和race4），其研究成果為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)［9］。國際咖啡銹病研究中心（CIFC）經(jīng)過50多年的研究，對(duì)全世界46 個(gè)咖啡種植國的咖啡銹菌樣品進(jìn)行小種鑒定，已發(fā)現(xiàn)小種49 個(gè)，分別用羅馬數(shù)字 I，II，III 等表示［10］。我國陳振佳等 1998年報(bào)道云南咖啡種植區(qū)有 I（v2，v5），II（v5），XV（v4，v5）和 XXIV（v2，v4，v5）4 個(gè)生理小種［11］。白學(xué)慧等2018 年報(bào)道云南咖啡植區(qū)有VIII（v2，v3，v5）、XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，v5，7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXVII（v2，v5，v6，v7，v9）、XLI（v2，v5，v8）、XLII（v2，v5，v7，v8 或 v2，v5，v7，v8，v9），New race（v2，v5，v6，v7），New race（v1，v2，v5，v7 或 v1，v2，v5，v7，v9），New race（v1，v5，v7 或 v1，v5，v7，v9）9 個(gè)生理小種［12］。

Bettencourt 等［13］1985 年報(bào)道，咖啡種群有抗銹病基因9 個(gè)，用SH1～SH9 表示，銹菌小種的毒力基因也有9 個(gè)，用v1～v9 表示，且小種的毒性基因與咖啡種群的抗病基因?qū)?yīng)。Van der Vossen 等［14］2005 年報(bào)道由于世界不同咖啡種植區(qū)新的銹菌生理小種不斷出現(xiàn)，咖啡抗銹基因SH1～SH9 已經(jīng)被陸續(xù)攻克。XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，5，7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXVII（v2，v5，v6，v7，v9）、XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）等生理小種的出現(xiàn)，使抗病品種卡蒂姆7963 先后在印度、巴西、肯尼亞、坦桑尼亞、泰國、印度尼西亞、菲律賓、哥倫比亞和中國等咖啡種植區(qū)逐漸喪失抗銹性［15-20］，由于咖啡銹菌群體遺傳變異，培育具咖啡銹病持久抗病性的抗病品種一直是咖啡抗性育種的挑戰(zhàn)。掌握咖啡銹菌生理小種分化及地理分布對(duì)該病的有效防治具有重要意義。本研究利用19 個(gè)國際通用的咖啡銹菌鑒別寄主，采用人工活體接種的方式，對(duì)2017—2019 年從云南咖啡植區(qū)15 個(gè)縣（市）采集的銹菌樣本進(jìn)行生理小種鑒定，以期為云南咖啡品種合理布局及咖啡育種策略的調(diào)整提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

菌株樣本主要為2017/2018 年度、2018/2019 年度、2019/2020 年度從云南15 個(gè)縣（市）采集的銹菌孢子，采集地咖啡栽培品種及生態(tài)環(huán)境較具代表性。孢子經(jīng)純化、擴(kuò)繁、保存了58 份用于生理小種鑒定，其中 2017/2018 年度 24 份、2018/2019 年度25 份、2019/2020 年度9 份。樣本采集信息詳見表1。

1.1.2 鑒別寄主

采用19 個(gè)通用的鑒別寄主，包括15 個(gè)小?？Х龋–offea arabica）或四倍體雜交咖啡（Tetrapliod interspecific hybrids），4 個(gè) 二 倍 體 咖 啡（Coffeaspp.），品種所含抗病基因詳見表2。

表2 咖啡銹菌小種鑒定所用鑒別寄主及其攜帶抗病基因

1.2 鑒定方法

鑒定在云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所溫室進(jìn)行，菌株的保存、擴(kuò)繁和鑒定方法按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T3331—2018）《熱帶作物品種資源抗病蟲鑒定技術(shù)規(guī)程咖啡銹病》中描述的方法進(jìn)行［21］。將采集的銹菌樣本用解剖刀輕輕刮下單個(gè)夏孢子堆，接種在鑒別品種Matari（849/1）幼嫩的新葉背面，用毛刷輕輕涂抹均勻，并輕輕噴施水霧，至有水膜產(chǎn)生為止，然后套塑料袋保濕遮光48 h。約30 d 后收集夏孢子并接種至不同鑒別品種，接種后30～45 d 開始調(diào)查，間隔1 周調(diào)查2 次，每個(gè)銹菌樣本重復(fù)3 次。

1.3 抗病性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T3331-2018）《熱帶作物品種資源抗病蟲鑒定技術(shù)規(guī)程 咖啡銹病》的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［21］，按10 級(jí)劃分（表 3，圖 1）。其中 0～3 級(jí)為抗?。≧）、4～5 級(jí)為中抗（MR）、6～7 級(jí)為中感（MS）、8～9 級(jí)為感?。⊿）。

圖1 咖啡銹病不同病級(jí)癥狀圖

表3 咖啡銹病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 銹菌生理小種類型及地理分布

根據(jù)咖啡銹菌樣本與鑒別接種的抗感反應(yīng)，鑒定出12 個(gè)生理小種（表4），分別為I（v2，v5）、II（v5）、VIII（v2，v3，v5）、XVII（v1，v2，v5）、XXIV（v2，v4，v5）、XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，v5，v7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXV（v2，v4，v5，v7，v9）、XXXVIII（v2，v5，v6，v7，v9）、XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）、XLI（v2，v5，v8）和 XLII（v2，v5，v7，v8 或 v2，v5，v7，v8，v9）。其中：云南德宏植區(qū)有 7 個(gè)，分別為 I、VIII、XVII、XXIV、XXXIV、XXXV 和 XLII 型 小 種；大 理 1 個(gè)，僅 有 II 型小 種 ；普洱 6 個(gè)，分別為 I、II、XXXIV、XXXVII、XXXIX 及XLII 型小種；保山 5 個(gè)，分別為 I、II、XXXIII、XXXIV 及 XLII 型 小種 ；臨 滄 5 個(gè) ，分 別為 II、XXXIII、XXXIV、XLI 及 XLII 型小種（表1，表5）。

表1 咖啡銹菌樣本采集點(diǎn)及寄主

表4 不同銹菌小種在鑒別寄主上的抗病類型

表5 銹菌小種類型及地理分布

2.2 銹菌生理小種出現(xiàn)頻率及毒力基因種類

本次研究中對(duì)58 份銹菌樣本進(jìn)行鑒定，共鑒定出12 個(gè)生理小種。其中，XXXIV 型生理小種為優(yōu)勢(shì)小種，占樣本的24.14%；I 型和XXXIII 型小種均占樣本的18.97%；II 占樣本的10.34%；XLII 占樣本的8.62%；XXXVII 和XLI 均占樣本的5.18%；VIII、XVII、XXIV、XXXV 和 XXXIX 分別占樣本的1.72%（表6）。本次鑒定結(jié)果表明，云南咖啡主產(chǎn)區(qū)包含v1～v9 共9 個(gè)毒力基因。其中，含單個(gè)毒力基因（II 號(hào)生理小種）僅占樣本總數(shù)的10.34%，其余均為雙至多個(gè)毒力基因（表6）。

從地區(qū)看，德宏地區(qū)共17 個(gè)樣本，I 型生理小種7 個(gè)，占德宏地區(qū)41.18%，保山地區(qū)19 個(gè)樣本，XXXIII 型生理小種 9 個(gè)，占保山地區(qū)47.37%。普洱和臨滄差距不大。與2018 年白學(xué)慧等的報(bào)道相比，新鑒定出6 個(gè)生理小種，分別為 I（v2，v5）、II（v5）、XVII（v1，v2，v5）、XXIV（v2，v4，v5）、XXXV（v2，v4，v5，v7，v9）和 XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）［13］。表明云南咖啡主產(chǎn)區(qū)銹菌小種類型呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，對(duì)抗銹育種提出了新的挑戰(zhàn)。

3 討論

咖啡銹?。℉. vastatrixBerkeley & Broome）對(duì)咖啡野生種和栽培種均有危害，對(duì)小粒種咖啡（Coffea arabica）的危害最為嚴(yán)重。1861年該病害被英國探險(xiǎn)隊(duì)首次在東非維多利亞湖畔發(fā)現(xiàn)，1868 年在斯里蘭卡首次流行，目前已在全世界咖啡產(chǎn)區(qū)流行。種植抗銹品種是控制咖啡銹病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。1875 年起，咖啡研究者在田間尋找抗銹病植株，1927 年在Timor島發(fā)現(xiàn) HDT（C. canphora和C. arabica天然雜交），上世紀(jì)50 年代CIFC（葡萄牙咖啡銹病研究中心）以HDT 作為主要抗源與世界各主產(chǎn)國聯(lián)合開展了抗銹咖啡品種的選育［22］。但是，在選育具有抗病性品種的同時(shí)，隨之出現(xiàn)的銹菌新型小種逐漸克服了抗病咖啡品種的抗性，使其抗性僅在一定時(shí)間及空間內(nèi)有效。如，‘S. 288’主要對(duì)II 型小種有抗性，引入云南種植14 年后抗性逐漸喪失?！ǖ倌稢IFC7963’引入云南從推廣到失去抗性僅 9 年時(shí)間［23］。Várzea 等［24］2005 年報(bào)道咖啡銹菌新小種產(chǎn)生的機(jī)制可能源自銹菌變異，Robinson［25］、Vanderplank［26］、Eskes［27］1983 年報(bào)道病原菌小種的形成、分布與該地區(qū)栽培品種的抗病基因相關(guān)，新小種是以克服品種抗病性為目的而形成的。本研究鑒定的 I（v2，v5）、II（v5）和 XXIV（v2，v4，v5）生理小種寄主均為鐵皮卡（Typica）、波邦（Bourbon）、卡杜拉（Caturra）等感病品種（無抗源介入），XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，v5，7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXV（v2，v4，v5，v7，v9）、XXXVII（v2，v5，v6，v7，v9）、XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）、XLI（v2，v5，v8）和 XLII（v2，v5，v7，v8 或 v2，v5，v7，v8，v9）等生理小種寄主均為卡蒂姆系列（Catimor）品種（有HDT 抗源介入），表明咖啡銹菌生理小種的形成、分布與栽培品種的抗病基因相關(guān)。

本次研究共鑒定出12 個(gè)生理小種，和陳振佳等［11］1998 年、白學(xué)慧等［12］2018 年的報(bào)道相比，云南咖啡植區(qū)新增4 個(gè)生理小種，分別為XVII、XXIV、XXXV 和XXXIX。本研究中銹菌包含的毒力基因?yàn)?v1～v9，與陳振佳等［11］1998 年的報(bào)道相比，增加毒力基因 v1、v3、v6、v8；與白學(xué)慧等［12］2018年的報(bào)道相比，增加毒力基因v4。綜上，云南咖啡銹菌生理小種的類型處于動(dòng)態(tài)變化中，銹菌的種類和毒力基因也在不斷增加。這與Van der Vossen 等［14］2005 年報(bào)道世界不同咖啡種植區(qū)新型銹菌生理小種不斷出現(xiàn)，咖啡抗銹基因SH1～SH9 已經(jīng)被陸續(xù)攻克的研究也吻合。

我國目前選育和推廣的咖啡抗銹品種的抗源基本都來自HDT。銹病抗源單一，亟待創(chuàng)新、引進(jìn)新的銹病抗源，并在選育推廣咖啡抗銹品種的過程中拓寬手段和策略。