MicroRNAs在胰腺炎發(fā)病和治療中的研究進展

劉濤濤 綜述 張爭運 審校

MicroRNAs(miRNAs) 是基因表達的重要調節(jié)因子,屬于小的非編碼RNA(small non-coding RNA)。諸多miRNAs參與調節(jié)胰腺細胞之間的信號轉導,在胰腺腺泡細胞、胰腺星狀細胞(PSCs)和免疫細胞之間構成一個復雜的分子調控互作網絡。研究表明,miRNAs有助于胰腺炎診斷和治療[1]。急性胰腺炎和慢性胰腺炎是一類發(fā)病率、住院率和病死率較高的炎癥性疾病。與正常胰腺組織比,急性胰腺炎、慢性胰腺炎患者胰腺組織中miRNAs的表達異常[2]。miRNAs通過調節(jié)細胞因子和趨化因子的表達及細胞增殖、遷移、組織重塑從而影響胰腺纖維化(pancreatic fibrosis,PF)的發(fā)展[3]。單個miRNA可調節(jié)多個靶基因的表達,為有效治療胰腺炎提供了可能。胰腺炎相關miRNAs調控網絡分析表明:潛在的治療靶點有hsa-miR-15a(CCND1)、hsa-miR-16(CCND1)、hsa-miR-155(CCND1/SMAD2)、hsa-miR-375(AKT2/CDK6)和hsa-miR-429(CCND1)[3, 4]。一些miRNAs可調控胰腺細胞內的信號通路,另一些則通過外泌體在胰腺腺泡細胞、胰腺星狀細胞、PSCs、胰腺免疫細胞之間傳遞的信號分子。因此,研究胰腺炎病理生理學過程中的miRNAs表達,了解其與胰腺炎發(fā)生發(fā)展的相關性,有助于開發(fā)有治療價值的anti-miRNA及miRNAs模擬物用于胰腺炎的治療。本文對miRNAs在胰腺炎發(fā)病和進展中的作用及分子機制進行綜述。

1 miRNAs在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用

1.1 miRNAs調節(jié)急性胰腺損傷時的炎癥反應 胰腺消化酶過早激活會導致胰腺腺泡細胞損傷和炎癥反應[5]。miRNAs對于維持胰腺細胞的完整性至關重要,參與調節(jié)急性胰腺炎炎癥反應進展的多個環(huán)節(jié)[6]。miR-21在急性胰腺炎炎癥、細胞凋亡和壞死中的作用已得到充分證實[6]。急性胰腺炎患者和健康受試者的血液樣本對比研究表明,miR-21和miR-155在急性胰腺炎患者中的表達水平顯著上調。小鼠模型也有助于闡明miR-21在急性胰腺炎相關肺損傷中的作用[7]。與對照組相比,雨蛙素急性胰腺炎模型小鼠的miR-21水平增加,miR-21KO組小鼠的淀粉酶水平較低[8]。與用雨蛙素處理的對照小鼠相比,雨蛙素處理的miR-21KO小鼠的Hnrnph1,Sgk3,Set,Pdcd10Pten和Pias3水平升高,Kpna2,Hmgb1,Cxcl13,Erbb4,Xiap,Gata3,Thbs1,Atg5,Atg7和Atg16的水平降低,Pias3上調與STAT3激活的抑制相關,Pias3為STAT3的負調節(jié)劑[9]。HMGB1協(xié)調炎癥、免疫和細胞死亡的過程[10, 11]。重組Hmgb1(rHMGB1)處理外周血單核細胞(PBMC),miR-21表達增加。此外,雨蛙素處理miR-21KO小鼠,重組rHMGB1顯著增加了小鼠肺損傷。以上表明HMGB 1和miR-21均參與調節(jié)急性胰腺炎期間炎癥反應。另外,雨蛙素、L-精氨酸L-arginine和脂多糖(LPS)等多種急性胰腺炎動物模型中,證實了miR-21的表達上調,miR-21與急性胰腺炎中細胞壞死密切相關,miR-21通過調節(jié)胰腺腺泡細胞在急性胰腺炎過程中的內在反應來發(fā)揮其功能[6,12]。

胰腺腺泡細胞與免疫細胞之間的信號轉導在急性胰腺炎疾病進展中的起關鍵作用。來源于雨蛙素處理的胰腺腺泡細胞外泌體EV可誘導巨噬細胞浸潤,加重急性胰腺炎大鼠模型的損傷[13]。損傷胰腺腺泡細胞來源的外泌體EV載有miR-183-5p,通過直接抑制Foxo1,誘導M1巨噬細胞極化并刺激淀粉酶和脂肪酶的產生,導致NF-κB通路的激活和IL-6和TNFα水平升高[13]。與健康人相比,來源于急性胰腺炎患者血液樣本外泌體EV中miR-183-5p水平升高[13]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)與miRNAs之間的相互作用可以介導急性胰腺炎期間胰腺的反應。一項關于大鼠急性胰腺炎模型結果表明,miR-365a-3p的水平被下調,而lncRNA NEAT1在發(fā)生急性胰腺炎時上調[14]。雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞AR42J,miR-365a-3p的表達上調,TNFα、IL-1β和IL-6等炎癥標志物表達降低。lncRNA NEAT1-siRNA可降低lncRNA NEAT1的表達水平,增強miR-365a-3p表達并降低炎性細胞因子水平[14]。Song等[15]研究表明,在急性胰腺炎的小鼠模型中,miR-361-5p和IL-17的水平在血清和損傷胰腺組織中顯著增加。miR-361-5p在Th17細胞中的過表達,導致miR-9、146-3p、365-3p 和 183-5p表達增加。

研究表明,雨蛙素作用于過表達miR-9和miR-146b-3p大鼠胰腺腺泡細胞,炎癥反應減輕,Il-1β,IL-6,TNF-α表達和凋亡水平的降低[16, 17],證明miR-9和miR-146b-3p在急性胰腺炎中有保護作用。Fgf 10在急性胰腺炎損傷中的表達上調可導致IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α表達增加而誘導凋亡,凋亡相關蛋白bax、caspase 3和9表達上調,抗凋亡作用bcl-2蛋白質表達下調。miR-9直接靶向Fgf 10,從而阻止NF-κB信號的激活和減少炎癥反應[16]。生物信息學分析確定了Annexin A2 mRNA 3 UTR區(qū)miR-146 b-3p的結合位點,體外實驗表明Annexin A2是miR-146b-3p的下游靶基因[17]。急性胰腺炎患者血清Annexin A2水平與miR-146b-3p呈負相關。過表達miR-146b-3p的大鼠胰腺腺泡細胞經雨蛙素誘導后,AnnexinA2的表達水平降低;Annexin A2過表達抑制miR-146 b-3p的功能。并導致IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高[17]。

1.2 在細胞自噬和線粒體自噬調節(jié)中的作用 細胞自噬是一個分解代謝過程,細胞自噬可去除和回收自身受損細胞器,自噬的過程可分為選擇性和非選擇性。線粒體自噬屬選擇性自噬,可以清除受損的線粒體[18]。離體胰腺腺泡細胞株AR42J細胞模型證實,?；悄懰?3-硫酸鹽(taurolithocholic acid-3-sulfate,TLCs)可誘導炎癥、自噬受阻[19],證明miRNAs靶基因參與急性胰腺炎相關的細胞自噬和線粒體自噬。此外,TLCs誘導的細胞,炎性細胞因子TNFα、IL-6 mRNA和蛋白表達水平及自噬標志物LC3-II/I增加,而P62表達下調[19]。相反,過表達的miRNA-146a-5p逆轉了TLCs的影響。同樣,下調Irak1或Traf6表現(xiàn)出與miR-146a-5p過表達相似的效果,表明miR-146a-5p的過度表達抑制TLCs誘導的炎癥和自噬是通過抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB 信號通路來實現(xiàn)的。

在雨蛙素誘導的AR42J細胞中過表達miR-92b-3p,可抑制炎癥和自噬[20]。過表達miR-92b-3p可下調TNFα和IL-6、Traf 3的表達。熒光素酶活性測定結果表明,IL-6是miR-148A的直接靶基因,IL-6的表達可被miR-148A過表達抑制[21]。miR-92b-3p和miR-148 A的過表達可下調Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達水平[20, 21]。然而,在體內小鼠模型中,miR-155的表達下調后,Beclin 1的表達降低,Tab2表達上調,使急性胰腺炎進展期炎癥及自噬受損減輕起保護作用[22]。

Ji等[23]發(fā)現(xiàn),Atg7過表達通過抑制miR-30b-5p促進CAMKII的激活。ATG7過表達增強自噬、促進壞死,是由miR-30b-5p/CAMKII信號通路介導的[23]。CAMKII可以作為一種治療靶標用于急性胰腺炎治療,利用miRNA的生物信息學和組織微芯片分析證實,miR-30b-5p是急性胰腺炎相關CAMKII的一種負調控因子[23]。用急性胰腺炎患者和體內小鼠雨蛙素模型進行的研究表明:在急性胰腺炎患者和小鼠血清中miR-325-3p水平顯著降低[24]。TargetScan在線數(shù)據(jù)庫分析及實驗證實,RIPK 3 3’UTR區(qū)有miR-325-3p的結合位點。此外,miR-325-3p過表達,導致另一種壞死性調節(jié)因子MLKL的磷酸化降低?？傊?MiR-325-3p可抑制腺泡細胞中的RIPK 3/MLKL信號通路。

1.3 參與胰腺炎發(fā)病過程中活性氧ROS及腸黏膜屏障通透性的調節(jié) 細胞內的ROS可以增加細胞的氧化應激,導致細胞和組織中氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡[25]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種重要的抗氧化酶,能減少細胞及體內多余的活性氧。SOD能保護組織免受超氧陰離子的損傷。黃芩苷具有抗氧化和抗凋亡的影響,可能有預防急性胰腺炎的保護作用。研究表明,黃芩苷對AR42J細胞氧化應激、活力、凋亡和死亡率無實質性影響[25]。但是,低濃度的黃芩苷可下調miR-136-5p的表達、上調SOD1 mRNA和蛋白表達,使急性胰腺炎時胰腺腺泡細胞活性氧ROS減少,凋亡增加,腺泡細胞數(shù)量死亡減少。黃芩苷使促凋亡的蛋白質表達上調,抗凋亡的蛋白質表達減少。黃芩苷也能減少雨蛙素誘導的AR42J細胞凋亡,而miR-136-5p抑制劑則作用相反。黃芩苷治療使淀粉酶水平的下降,胰腺細胞損傷,且胰腺腺泡細胞死亡減少。所以,黃芩苷對胰腺腺泡細胞有保護作用機制有必要進行更深入地研究。

腸黏膜屏障主要結構是緊密連接,主要由 occludin,Claudin和連接粘附分子組成[26]. 研究表明,上調miR-122、occludin下調,急性胰腺炎大鼠模型腸通透性增加[26]。急性胰腺炎大鼠血清中IL-1β、TNFα、IL-6及內毒素水平均升高。抑制miR-122表達,導致occludin閉塞蛋白表達水平增加。miR-122可直接與occludin3’UTR結合。通過抑制miR-122表達,上調表達閉塞蛋白,可降低急性胰腺炎患者腸黏膜屏障通透性。

2 miRNAs在慢性胰腺炎中的作用

受損胰腺腺泡細胞、免疫細胞和PSCs之間的信號轉導與慢性胰腺炎的進展密切相關。受損的胰腺腺泡與免疫細胞之間的交互作用可增加炎癥反應,導致PSCs的活化和纖維化的發(fā)展和進展[27]。新近研究表明,miRNAs在調節(jié)參與PSCs損傷的基因轉錄中起著重要作用。miRNAs通過外泌體的細胞外信號轉導允許胰腺腺泡細胞影響PSCs活性。miRNAs通過纖維化、凋亡和自噬等方式調節(jié)PSCs激活。研究表明,miR-15b/miR-16水平在慢性胰腺炎發(fā)展和進展時降低,并與α-SMA和BCL-2水平負相關[28]。有研究表明,大鼠采用HDAC抑制劑(伏立諾他和曲古抑菌素A)治療,可減輕慢性胰腺炎的纖維炎癥,降低血清IL-6和TNFα水平及降低活化的PSCs標記物(如GFAP和α-SMA)水平[29]。同時,Vorinostat治療增加了miR-15/miR-16并誘導PSCs凋亡。miR-15/miR-16的過度表達降低了SMAD5、TGFβ通路效應子和BCL-2的表達[28,29]。

TGFβ信號通過誘導幾種基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑的表達,在慢性胰腺炎期間激活PSCs中發(fā)揮作用,導致細胞外基質重塑、膠原纖維沉積和組織硬度增加。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn),TGFβ增加lnc-PFAR水平,然后與未成熟的miR-141-5p結合,阻斷其成熟,并激活PSCs中的纖維化和自噬。此外,miR-141-5p通過與視網膜母細胞瘤卷曲螺旋蛋白1的3’UTR結合,抑制ULK1去磷酸化并減少自噬來防止自噬。然而,在慢性胰腺炎中,miR-141-5p的水平下調,因此,PSCs的纖維化和自噬增加。MicroRNA-30b-5p 可能通過抑TLR4/NF-κB 通路的表達,從而減弱 LTC-14 細胞炎癥反應、改善纖維化。OM 對 LTC-14 細胞炎癥反應、纖維化的調節(jié)可能是通過影響 microRNA-30b-5p 而實現(xiàn)的[31]。

一項研究結果顯示,結締組織生長因子2 (CTGF/CCN2)和慢性胰腺炎中miR-21之間的正反饋環(huán)[32]。另有研究表明,CTGF是由乙醇、腫瘤壞死因子α、轉化生長因子β、PDGF和激活素信號誘導[33],證明CTGF水平的增加與miR-21和纖維形成的增加呈正相關。值得注意的是,miR-21正調節(jié)CTGF轉錄,并提供自我調節(jié)的自分泌模式。從PSCs收集的外泌體包含CTGF和miR-21,CTGF和miR-21的過度表達明顯增加這兩種因子在外泌體中的水平。還有研究發(fā)現(xiàn),活性氧 /miR-21軸促進PSCs活化和糖酵解[34],表明過氧化氫誘導miR-21表達,而用白藜蘆醇(RSV)或N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)治療則抵消了其在PSCs中的誘導作用。miR-21的下調抑制了活性氧誘導的PSCs活化、遷移和侵襲。此外,它還減少糖酵解酶,如葡萄糖轉運蛋白1、己糖激酶2、丙酮酸激酶M2和乳酸脫氫酶A[35]。這些研究表明,通過直接抑制miR-21或用RSV治療PSCs來減少乳酸分泌。

3 miRNAs作為胰腺炎的生物標記物及治療中的作用

近十年的廣泛研究證實,miRNA參與胰腺炎的發(fā)生發(fā)展。各種動物體內外模型及胰腺炎患者臨床研究證實miR在急性胰腺炎和慢性胰腺炎中的功能意義[35]。miR-21和miR-155在急性胰腺炎的發(fā)病中至關重要,并可能作為胰腺炎的生物標志物[7]。在雨蛙素處理大鼠胰腺損傷后,血清中檢測到miR-216a/b和miR-217表達上調[36, 37]。此外,雨蛙素誘導大鼠和犬引起急性胰腺損傷,miR-216a和miR-375 在表達升高[38, 39]?；诖笫蠛腿囊认贀p傷研究表明,miR-216a、miR-217和miR-375是胰腺損傷和胰腺炎最有希望的候選生物標志物。

從血清中鑒定miRNAs,可作為慢性胰腺炎的鑒別診斷生物標志物[40-44]。有學者對77例患者血清標本進行研究發(fā)現(xiàn),miR-210-3p的表達是一種非侵入性的生物標志物,可區(qū)分PDAC和慢性胰腺炎[40]。另一項研究報告發(fā)現(xiàn),患者血清樣本中的miR-221(AUC=100%)和miR-130 a(AUC=87.5%)可用于慢性胰腺炎的早期診斷[41]。一項對15例慢性胰腺炎患者血漿源性外泌體EV miRNAs的水平調查發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,慢性胰腺炎患者miR-579-3p的表達水平明顯減少[42]。另外,一項對90例PDAC及慢性胰腺炎患者的EV樣本的研究表明,miR-95-3p與PDAC、miR-26b-5p與胰腺炎有關,miR-95-3p/miR-26b-5p及CA-19-9可以用于慢性胰腺炎與PDAC患者的鑒別診斷,miR-335-5p/miR-340-5p與PDAC轉移和預后不良有關[43]。還有研究發(fā)現(xiàn),與健康對照者、慢性胰腺炎患者比較,1型自身免疫性胰腺炎患者(AIP)的miR-21-5p表達水平明顯增加[44]。

目前,對于血漿或血清中循環(huán)miR作為胰腺炎的生物標志物的研究已廣泛開展。Hamada等[45]使用miRNA寡核苷酸芯片陣列技術研究了AIP患者血清樣品中miR的表達,發(fā)現(xiàn)miR-150-5p表達顯著升高,輕中度急性胰腺炎患者miR-216a水平均顯著升高。Blenkiron等[46]報告了12例不同嚴重程度(輕度和重度)的急性胰腺炎患者血清中miR-92b、miR-10a和miR-7表達下調,此外,miR-551 b-5p和miR-126a-5p表達水平可區(qū)分重度急性胰腺炎和輕度急性胰腺炎 。輕中度和重度急性胰腺炎人群大型隊列研究表明。與輕中度急性胰腺炎患者比,miR-7表達水平在重癥胰腺炎中明顯升高 。

綜上,胰腺炎發(fā)生發(fā)展進程中,miRNAs可影響炎癥反應及PSCs激活、遷移和侵襲。此外,miRNAs可影響胰腺腺泡細胞的增殖、凋亡和壞死;誘導或抑制胰腺炎病生理學進程。根據(jù)目前的研究資料及數(shù)據(jù),miRNAs作為診斷生物標志物中具有應用價值,也可能成為治療胰腺炎的關鍵候選靶分子。