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    復(fù)合保鮮劑對冷凍牛蛙保鮮效果的影響

    2023-04-19 13:28:32任中陽黃香蘭崔雅清石林凡郝更新邱緒建陳玉峰趙永強(qiáng)翁武銀
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2023年5期
    關(guān)鍵詞:鹽溶牛蛙冰點

    任中陽,黃香蘭,崔雅清,焦 敏,石林凡,2,楊 燊,2,郝更新,2,邱緒建,2,陳玉峰,趙永強(qiáng),翁武銀,2

    (1. 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院,福建廈門 361021;2. 廈門市海洋功能食品重點實驗室,福建廈門 361021;3. 浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點實驗室,浙江杭州 310014;4. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東廣州 510300)

    0 引言

    牛蛙屬于兩棲綱、無尾目蛙科,是一種大型食用蛙。牛蛙生長速度快,味鮮肉嫩、營養(yǎng)豐富,具有一定的藥用價值,由于其具有高蛋白、低脂肪的特點而深受消費者喜愛。除了牛蛙肉外,牛蛙皮、牛蛙油也能被充分利用,可產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益,因而牛蛙也逐漸成為我國重要水產(chǎn)品之一。牛蛙表面的活性肽在抑菌方面具有一定作用[1]。牛蛙富含蛋白質(zhì),死后會出現(xiàn)僵直、解僵、自溶和腐敗的現(xiàn)象,肌肉中的ATP 會分解釋放能量,使蛙體體溫上升,其新鮮度也會受到影響,還會造成營養(yǎng)物質(zhì)損失、品質(zhì)下降、貨架期縮短等問題[2]。牛蛙保藏不當(dāng),難以保證其品質(zhì),因此研究牛蛙保鮮技術(shù)具有重要意義。

    目前,有關(guān)水產(chǎn)品保鮮的方法有物理方法、化學(xué)方法和生物方法,化學(xué)方法是通過加入食品保鮮劑以延長食品保質(zhì)期,常用化學(xué)保鮮劑有磷酸鹽、檸檬酸、苯甲酸等,雖然單一保鮮劑的種類比較繁多,但單一保鮮技術(shù)與保鮮劑在食品保鮮中不具有優(yōu)勢,只針對某一特定的腐敗菌發(fā)揮作用,促使復(fù)合保鮮技術(shù)的研究開發(fā)[3]。水產(chǎn)品在凍藏過程中,若形成大且不均勻的冰晶會對水產(chǎn)品品質(zhì)造成不良影響[4]。選擇合適的凍藏方式或保鮮劑可減少對品質(zhì)的損害。水產(chǎn)品在凍藏過程中蛋白質(zhì)會發(fā)生變性和品質(zhì)下降,酶活性下降,黏度變低,蛋白質(zhì)分子凝集,空間立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。蛋白質(zhì)變性后,凍結(jié)水產(chǎn)品的組織質(zhì)地變干變硬,加工適宜性下降,產(chǎn)品缺乏彈性。而采用保鮮劑可有效改善凍藏品在凍結(jié)過程中發(fā)生的品質(zhì)問題。

    目前,常用的保鮮劑主要有4 類,分別是復(fù)合磷酸鹽、糖類、蛋白水解產(chǎn)物、抗凍蛋白[6]。有關(guān)牛蛙保鮮劑的研究與技術(shù)開發(fā)還不完善[7]。當(dāng)前,有關(guān)牛蛙的研究主要包括其基本營養(yǎng)成分分析、營養(yǎng)學(xué)、組織學(xué)、藥用價值和生理學(xué)和養(yǎng)殖等方面[8]。牛蛙作為一種低脂肪、高營養(yǎng)的食品,應(yīng)用范圍廣且具有一定的發(fā)展前景,目前有很多有關(guān)于水產(chǎn)保鮮的研究,但對牛蛙保鮮有待深入探究。因此通過研究復(fù)合磷酸鹽類保鮮劑,分析焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉及六偏磷酸這3 類保鮮抗凍劑復(fù)合對于牛蛙冷凍效果的影響,以此為牛蛙保鮮提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮮活牛蛙,購自廈門市集美區(qū)石鼓路水產(chǎn)市場;氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、氯化鈣、氯化鎂,西隴科學(xué)股份有限公司提供;無水乙醚、氫氧化鈉、ATP、三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)、硝酸、硫酸亞鐵、三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉、焦磷酸鈉、海藻糖、乙酸鎂,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;Tris- 馬來酸、乙二醇雙(2- 氨基乙基醚) 四乙酸(Ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA) 溶液、鉬酸銨、山梨糖醇、甘油,上海麥克林生化科技有限公司提供;Lowry 試劑盒,深圳子科生物科技有限公司提供。所有試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-1750 型紫外熒光分光光度計,日本島津公司產(chǎn)品;Avanti J-26xp 型冷凍離心機(jī),貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品;G:Box 型凝膠電泳成像儀,英國Syngene 公司產(chǎn)品;SX2-10-13 型馬弗爐,上海石研電爐有限公司產(chǎn)品;Avanti J-26xp 型高速分散均質(zhì)機(jī),上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品;Q-2000 型差式掃描量熱儀,美國TA 公司產(chǎn)品;FJ-200 型恒溫水浴鍋,國華電器有限公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 樣品制備

    將牛蛙宰殺清洗干凈后,取牛蛙大腿部位和整只牛蛙,采用一定濃度復(fù)合保鮮劑,優(yōu)化最佳磷酸鹽配比,通過復(fù)合磷酸鹽浸泡處理1 h,放入冰箱凍藏3 個月,用于DSC 測定。

    1.3.2 單因素試驗

    固定處理條件:1%海藻糖,0.5%山梨糖,1%氯化鈉和1%甘油,分別探究3 種保鮮劑即焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對牛蛙的保鮮效果。3 種保鮮劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)為0.1%,0.5%,1%,3%,5%。

    1.3.3 保鮮劑復(fù)合正交試驗

    在單因素試驗基礎(chǔ)上,以冰點和相變焓為指標(biāo),按正交表進(jìn)行復(fù)配。每組重復(fù)2 次,浸泡1 h 后采用DSC 法測定冰點和相變焓的變化確定保鮮劑最佳配比。

    正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

    表1 正交試驗因素與水平設(shè)計/%

    1.3.4 冰點測定

    參考李紅梅等人[9]方法測定,略有改動。稱取4~8 mg 牛蛙肉進(jìn)行測定,空白坩堝為參比,以5 ℃/min降溫至-30 ℃,用1 ℃/min 升溫到3 ℃。利用DSC數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析,獲取牛蛙的冰點和相變焓等熱力學(xué)參數(shù)。

    1.3.5 水分含量測定

    參考宋健[10]的方法,略有改動。事先準(zhǔn)備好干燥皿,取相同質(zhì)量牛蛙肉置于3 個干燥皿中,置于105 ℃烘箱內(nèi),烘制1.5 h 后取出,將蓋子蓋好后于干燥器中回溫,再烘制30 min,降溫后進(jìn)行稱重,至前后2 次相差不大于0.000 5 g。

    1.3.6 蛋白質(zhì)含量測定

    參考黎勇等人[11]的方法略有改動。配制2 mol/L氫氧化鈉溶液50 mL,加入牛蛙肉后攪拌1 h,以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min。取上清稀釋5 倍,利用Lowry 法于波長750 nm 處測定吸光度,用于蛋白質(zhì)的定量。用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零,以水作為對照,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出牛蛙中蛋白質(zhì)含量。

    1.3.7 粗脂肪含量測定

    參考Cunha A F 等人[12]的方法,略有改動。取約4 g 經(jīng)處理的牛蛙肉包好放入抽提筒中,加入無水乙醚至瓶容量2/3 處,在40 ℃水浴抽提6~12 h,直至脂肪完全浸出為止。將收集瓶中乙醚水浴蒸發(fā)至1~2 mL時,于100 ℃下烘干2 h,放入干燥儀器冷卻后稱量,重復(fù)以上步驟至恒質(zhì)量。

    1.3.8 牛蛙總灰分測定

    參考Akinyele I O 等人[13]利用馬弗爐灰化法,略有所改動。將坩堝先烘干,稱約0.1 g 樣品放入坩堝燒1 h,冷卻后放入馬弗爐。于550 ℃下灼燒3 h,取出冷卻1 h,重復(fù)上述步驟2 次,取出后冷卻稱重。

    1.3.9 SDS- PAGE 凝膠電泳

    參照夏軒澤等人[14]做法有所改動。先是進(jìn)行牛蛙試驗原液的配制,600 μL 蛋白質(zhì)樣品和400 μL 上樣緩沖液作為電泳樣品,使樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL,混合反應(yīng)0.5 h。采用6%濃縮膠與8%分離膠,初始電壓為8 V,當(dāng)進(jìn)入分離膠后,將電壓提高到12 V,電泳1 h。用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色10 min,用體積比1∶1 醋酸乙醇混合脫色液脫色,用凝膠電泳成像儀拍照分析。

    1.3.10 ATP 酶活性測定

    參照許萍等人[15]做法并有所改動。用0.6 mol/L KCl(pH 值7) 提取牛蛙蛋白,取4 個平行樣品分別加入10 mmol/LCa2+溶液、2 mmol/LMg2+溶液、2 mmol/L Mg2+溶液和0.1 mmol/L Ca2+溶液、2 mmol/L Mg2+溶液和0.5 mmol/L EGTA 溶液各7.9 mL,各添加20 mmol/L ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL,反應(yīng)8 min 后,添加15%TCA 溶液5 mL,反應(yīng)結(jié)束后在常溫下放置15 min,取3 mL 反應(yīng)液,以轉(zhuǎn)速7 060 r/min 離心5 min。取1 mL 離心后的上清液,加入硫酸亞鐵鉬酸銨溶液2 mL,顯色1 min 后,于波長660 nm 處測吸光度。

    1.3.11 牛蛙鹽溶蛋白含量測定

    參考Han Z Y 等人[16]的方法有所改動。取1 g 牛蛙大腿組織至濃度為0.6 mol/L 的KCl 溶液50 mL中,在冰水浴中使用均質(zhì)儀器以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速處理,攪拌浸提1 h,混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min,用Lowry 法測蛋白含量。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)使用Origin 2019 軟件作圖,用SPSS 和Excel 軟件進(jìn)行方差和顯著性分析,顯著性水平為p<0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牛蛙冰點的影響見圖1。

    圖1 磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牛蛙冰點的影響

    焦磷酸鈉、三聚酸鈉、六偏磷酸鈉不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牛蛙冰點的影響結(jié)果。由圖1 可知,3 種保鮮劑在合適的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)均可在一定程度上降低牛蛙冰點。新鮮牛蛙的冰點和相變焓分別為-0.8 ℃和231.7 J/g。牛蛙肉的冰點和相變焓均隨磷酸鹽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而下降。在同質(zhì)量分?jǐn)?shù)情況下,焦酸鈉復(fù)合抗凍劑浸泡的魚肉冰點和相變焓下降最明顯。當(dāng)復(fù)合抗凍劑中焦磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3%時,牛蛙的冰點和相變焓不再發(fā)生明顯的變化。其原因可能是牛蛙在凍藏中,肌肉細(xì)胞與組織細(xì)胞中冰晶會不斷形成變大,使肌肉蛋白變形,隨著焦磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,冰點降低,冰晶逐漸變小,從而減少牛蛙蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞[17]。而當(dāng)三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%時,牛蛙肉冰點與相變焓變化較小,可能是由于牛蛙在凍藏時,肌肉中的結(jié)合水脫離,導(dǎo)致分子內(nèi)形成二硫鍵,使蛋白質(zhì)凝聚發(fā)生變性[18]。六偏磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%時,牛蛙肉冰點與相變焓變化差異不顯著,由此可見,在焦磷酸鈉、三聚酸鈉、六偏磷酸鈉3 種保鮮劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%~3%,有利于冰點降低,綜合考慮3 種保鮮劑均選取1%~3%用于后續(xù)的優(yōu)化試驗。

    2.2 復(fù)合保鮮對牛蛙冰點的影響

    保鮮劑復(fù)合正交試驗結(jié)果見表2。

    由表2 可知,根據(jù)極差R分析,各因素對牛蛙冰點的變化影響順序為A>B>C,即焦磷酸鈉>三聚磷酸鈉>六偏磷酸鈉。最優(yōu)條件為A3B2C2,即3%焦磷酸鈉,2%三聚磷酸鈉和2%六偏磷酸鈉。將此復(fù)合保鮮劑應(yīng)用于牛蛙的貯藏保鮮上,能有效抑制大冰晶的形成。抑制冰晶的生長,有利于食品在低溫條件下的貯藏[19]。若不加控制,隨貯存時間延長,冰晶增大不利于肉制品的保藏[20]。

    表2 保鮮劑復(fù)合正交試驗結(jié)果

    2.3 牛蛙成分分析

    試驗測得牛蛙水分含量達(dá)80.57%,粗脂肪含量僅為0.40%,蛋白含量為4.60%。

    牛蛙基本成分見表3。

    表3 牛蛙基本成分

    試驗所用的牛蛙蛋白質(zhì)含量明顯高于其魚肉、牛肉、雞肉和豬肉[21-23]。牛蛙屬于高蛋白低脂肪且營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質(zhì)肉類[24]。灰分是樣品經(jīng)高溫灼燒后殘留下來的無機(jī)物,屬于營養(yǎng)的參考指標(biāo)之一,研究測定的牛蛙肉灰分含量明顯高于其他動物肉[25]。

    2.4 牛蛙蛋白質(zhì)的凝膠電泳結(jié)果分析

    牛蛙蛋白質(zhì)電泳結(jié)果圖見圖2。

    圖2 牛蛙蛋白質(zhì)電泳結(jié)果圖

    由圖2 可知,蛋白質(zhì)分子量在32~44 kDa 的條帶清晰。72 kDa 左右的蛋白,包括分子量在98~100,135,170 kDa 等處的條帶也能看到。最明顯看到的是分子量在200 kDa 左右的蛋白質(zhì)條帶顏色深且清晰。分子量40 kDa 處為輔肌動蛋白,分子量在32 kDa 左右為前Ⅰ型膠原α1鏈,分子量35 kDa 是角蛋白13,分子量72 kDa 為信號識別例子亞基和分子量135 kDa 的膠原蛋白α1鏈,與樊雨梅等人[26]的分析結(jié)果相一致。100 kDa 是副肌球蛋白,200 kDa處為肌球蛋白重鏈,200 kDa 以上條帶密集且顏色最深,可能是堿溶性蛋白和膠原蛋白的特征條帶,這與楊慧等人[27]研究大鯢肌肉分離蛋白特性結(jié)果相似。綜上所述,試驗所用的牛蛙,其蛋白主要是肌球蛋白和肌動蛋白。

    2.5 酶活性對比

    復(fù)合保鮮劑處理對牛蛙ATP 酶活性的影響見圖3。

    圖3 復(fù)合保鮮劑處理對牛蛙ATP 酶活性的影響

    凍藏過程中所形成的冰晶和升高的離子濃度會使蛋白質(zhì)發(fā)生改變,導(dǎo)致肌球蛋白球狀頭部的Ca2+-ATPase 酶活下降,因此在凍藏過程中Ca2+-ATPase 酶活的變化情況可以作為肉冷凍保護(hù)效果的指標(biāo)[28]。由圖3 可知,新鮮牛蛙Ca2+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Mg2+-EGTA 酶活性分別為0.31,0.35,0.45,0.35 μmol/mg·min,未經(jīng)保鮮劑浸泡處理凍藏3 個月后酶活性分別為0.09,0.16,0.10,0.08 μmol/mg·min,經(jīng)保鮮劑處理后酶活性分別是0.22,0.25,0.29,0.13 μmol/mg·min。由此可見,經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理后的牛蛙酶活性都有明顯升高趨勢,其中未經(jīng)處理的Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力和使用復(fù)合保鮮劑處理的試驗組未經(jīng)處理而凍藏3 個月的對照組酶活性顯著性降低,這也間接說明,復(fù)合保鮮劑的浸泡前處理在減緩牛蛙品質(zhì)下降中起到了顯著的效果[29]。參考李志鵬等人[30]的試驗發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致Ca2+-ATP酶活性下降的原因是因為在凍藏過程中,肌球蛋白球狀頭部構(gòu)象發(fā)生改變或者相互聚集,與所研究結(jié)果一致。結(jié)果表明,在試驗條件下的復(fù)合保鮮劑即2%六偏磷酸鈉,2%三聚磷酸鈉和3%焦磷酸鈉,同未經(jīng)處理的牛蛙相比,可使牛蛙的酶活提高至1.5 倍以上。這表明復(fù)合保鮮劑對冷凍牛蛙的ATP 酶活性有明顯的保護(hù)作用。2.6 鹽溶性含量對比牛蛙肉中肌肉蛋白的功能性質(zhì)主要由鹽溶性蛋白肌原纖維蛋白體現(xiàn),測定鹽溶性蛋白的含量可以反映凍藏過程中牛蛙功能特性的變化。

    牛蛙鹽溶蛋白質(zhì)量濃度對比見圖4。

    由圖4 可知,新鮮牛蛙鹽溶蛋白質(zhì)量濃度2.83 mg/mL,未經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理是1.86 mg/mL,經(jīng)保鮮劑處理是2.33 mg/mL。試驗表明,2%六偏磷酸鈉、3%焦磷酸鈉、2%三聚磷酸鈉的保鮮劑復(fù)合的處理,有效抑制了鹽溶性蛋白質(zhì)量濃度的下降。復(fù)合磷酸鹽中的磷酸根離子可以增強(qiáng)魚肉離子強(qiáng)度,提高pH 值,增強(qiáng)肌動球蛋白的親水性,延緩蛋白質(zhì)的冷凍變性[31]。

    3 結(jié)論

    試驗通過對牛蛙進(jìn)行基本成分的測定,對比新鮮牛蛙加保鮮劑冷凍前后ATP 酶活性和鹽溶蛋白含量,探究了復(fù)合保鮮劑對于牛蛙冷凍效果的影響。試驗結(jié)果表明,牛蛙的水分含量為80.57%,粗脂肪含量為0.41%,粗灰分含量為1.10%,蛋白含量為4.6 mg/mL。通過電泳分析蛋白質(zhì)分子量表明大多集中在40 kDa 和200 kDa 左右。3 種保鮮劑對牛蛙冰點影響的優(yōu)化結(jié)果為3%焦磷酸鈉,2%三聚磷酸鈉和2%六偏磷酸鈉的復(fù)合保鮮劑。經(jīng)牛蛙肌肉ATP 酶活性和鹽溶蛋白含量的對比,表明經(jīng)此復(fù)合保鮮劑浸泡1 h 后冷凍牛蛙ATP 酶活性比未處理組牛蛙的酶活性提高至1.5 倍以上。新鮮牛蛙的鹽溶蛋白含量是2.83 mg/mL。未經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理而冷凍后的是1.86 mg/mL,但經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理冷凍后為2.33 mg/mL。試驗表明,3 種保鮮劑復(fù)合能有效降低冷凍對牛蛙的傷害,提高其新鮮度,為牛蛙保鮮提供了理論基礎(chǔ)。

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