牛乳質(zhì)量檢測方法的研究進展及其對乳品安全的意義

王歆遠，劉 燕，布日額

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

牛乳質(zhì)量檢測與人類健康及疾病防控有著密切的關(guān)系，為了讓民眾喝上“安全奶”“放心奶”，乳品企業(yè)及衛(wèi)生部門要對乳品的新鮮度、營養(yǎng)成分、致病菌污染情況進行全面檢測。感官檢測適合對乳品的新鮮度和被接受度進行初步判斷，后續(xù)可以通過對其理化指標的檢測來分析乳品營養(yǎng)成分的含量是否存在異常，以及通過微生物檢測手段來判斷乳源是否被致病菌感染[1]。

1 感官指標檢測

感官評定是牛乳質(zhì)量評估最簡單的方式，是將乳品通過評價者的視覺、嗅覺和味覺來對乳品的色、香、味、質(zhì)地等指標作出評判并進行分析和解釋[2]。主要通過看、聞、嘗3 個步驟進行感官指標檢測[3]，可以直觀地反映出牛乳的新鮮程度和是否變質(zhì)。

（1） 看。品質(zhì)正常的牛乳顏色呈乳白色或微黃色，牛乳中不應(yīng)出現(xiàn)沉淀物或絮狀物，不應(yīng)有凝塊產(chǎn)生[4]，通過觀察乳品的顏色、流體狀態(tài)可以判斷出乳品是否變質(zhì)。

（2） 聞。由于牛乳中脂肪酸的揮發(fā)，牛乳聞起來會有一種濃郁的奶香氣。如果牛乳中有令人不悅的異味產(chǎn)生，說明其中的脂肪酸發(fā)生氧化，產(chǎn)生過氧化物，則認為牛乳發(fā)生了酸敗現(xiàn)象。

（3） 嘗。牛乳中乳糖的存在會讓人喝起來有淡淡的甜味，牛乳中脂類物質(zhì)可以使牛乳有順滑、濃郁的感覺。如果品嘗出酸或苦等異味，則說明牛乳已經(jīng)變質(zhì)。

2 牛乳理化指標檢測

理化檢驗技術(shù)是牛乳質(zhì)量檢測最常使用的技術(shù)手段。理化指標檢測通過分析乳品的物理特性或化學(xué)成分，能夠得到其中各項營養(yǎng)成分的含量及實時變化情況，具有準確性高、說服力強的優(yōu)點[5]。理化指標檢測可以實現(xiàn)對牛乳新鮮度的檢測，以及其中某一項營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪含量的檢測和牛乳中多種營養(yǎng)指標共同檢測。

2.1 酸度測定

通過酸度的測定可評判出牛乳的新鮮程度。當(dāng)牛乳在貯存和運輸?shù)沫h(huán)節(jié)中受到微生物污染時，其中含有的營養(yǎng)物質(zhì)會被分解，牛乳中的乳糖會分解成乳酸，引起酸度的增高，稱為牛乳的酸敗現(xiàn)象[6]。酸度測定的方法是利用酚酞溶液作為指示劑，用氫氧化鈉標準滴定溶液（0.100 0 mol/L） 來滴定，計算滴定結(jié)束時所用氫氧化鈉溶液的體積。

2.2 相對密度、比重測定

通過對牛乳的相對密度和比重的測定，可以反映出牛乳是否存在衛(wèi)生問題。牛乳的相對密度和比重是通過密度乳稠計和比重乳稠計來測定的，當(dāng)溫度為20 ℃時，單位體積牛乳的質(zhì)量與溫度在4 ℃時單位體積水的質(zhì)量之比則稱為牛乳的相對密度，為1.028～1.032。當(dāng)溫度在15 ℃時，單位體積牛乳質(zhì)量與單位體積水的質(zhì)量之比稱為牛乳的比重，為1.030～1.034[1]。如果牛乳的相對密度或比重值不在正常范圍內(nèi)，則可以推測為牛乳中的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)發(fā)生改變，誘發(fā)牛乳變質(zhì)或者存在不良商家對牛乳摻水作假的嫌疑。

2.3 蛋白質(zhì)檢測方法

蛋白質(zhì)是牛乳中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，通常情況下牛乳的蛋白質(zhì)含量越多，代表著牛乳品質(zhì)越好[7]，在牛乳的生產(chǎn)貯存過程中，蛋白質(zhì)含量的變化情況也可以反映出牛乳質(zhì)量的變化，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量降低時則可能牛乳發(fā)生變質(zhì)[8]。現(xiàn)階段，主要通過凱氏定氮法、考馬斯亮藍法和紫外分光光度法來檢測牛乳中的蛋白質(zhì)含量[9]。凱氏定氮法是目前應(yīng)用最廣泛的一種檢測方法，該方法發(fā)展完善，有著成熟的檢測體系和極高的準確度，不足之處是凱氏定氮法的試驗周期相對較長，對試驗環(huán)境要求較高。將經(jīng)典的凱氏定氮法改良后，通過模塊式消化來進行試驗，是將牛乳進行微波消解技術(shù)處理后再測定蛋白質(zhì)含量，這種改良方案提高了試驗分析效率，減少了試劑用量，且對環(huán)境較為友好[10]。紫外分光光度法也在生產(chǎn)實踐中廣泛應(yīng)用于牛乳蛋白質(zhì)含量的測定，其利用牛乳中的蛋白質(zhì)與紫外光的吸收程度存在著線性關(guān)系，通過測定樣品的吸光度可以測定出蛋白質(zhì)在乳品中的含量[11]。

2.4 乳脂檢測方法

如果新鮮牛乳發(fā)生變質(zhì)，則乳品總脂肪的含量會呈下降趨勢[12]。在乳脂檢測方法中，羅茲- 哥特里法被廣泛應(yīng)用，該方法有著技術(shù)成熟、發(fā)展完善、準確度高的優(yōu)點，缺點是試驗操作時間長且復(fù)雜，易產(chǎn)生污染[13]。相對于傳統(tǒng)方法，伊尼霍夫堿法來檢測牛乳中的脂肪含量可以實現(xiàn)試驗周期大幅縮短、操作更為簡便等優(yōu)點，也被逐漸推廣[14]。除以上2 種方法外，對牛乳中脂肪含量的檢測還會使用核磁共振定量氫譜技術(shù)、巴勃科克氏法、蓋勃氏法等[15]。

2.5 乳糖檢測方法

乳糖含量在牛乳儲存周期中的變化規(guī)律與牛乳變質(zhì)不存在特定性的關(guān)系[8]。但在乳品質(zhì)量檢測時也應(yīng)作為必不可少的一項營養(yǎng)指標。乳糖可以長時間滯留在人的腸道內(nèi)，需要自身產(chǎn)生的乳糖酶分解，乳糖酶缺乏的人群會產(chǎn)生乳糖不耐受癥，消費者可以從此項指標對牛乳進行甄別。對于牛乳中乳糖含量的測定，目前普遍采用蒽酮比色法和萊茵- 埃農(nóng)氏法[16]。

2.6 低場核磁共振技術(shù)

低場核磁共振（NMR） 是一種對乳品質(zhì)量檢測的新興技術(shù)手段，適用于對牛乳的多項營養(yǎng)物質(zhì)含量進行檢測，原理是通過牛乳在恒定磁場強度小于0.5 T 時所產(chǎn)生的核磁共振現(xiàn)象對其營養(yǎng)成分進行分析。低場核磁共振技術(shù)一般用來檢測乳制品中蛋白質(zhì)和脂肪的含量、水分子的遷移率及乳制品的保水能力等理化指標。在測定牛乳中蛋白質(zhì)含量時，該方法有著極高的準確度，現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用于乳蛋白的快速檢測[17]。利用雙高斯公式擬合低場核磁共振測定得到的乳脂肪液相信號，也可以得出乳品中脂類物質(zhì)的含量評判牛乳的品質(zhì)[18]。

2.7 近紅外光譜分析法

近紅外光譜分析法（NIR） 是近年來新興的綠色檢測技術(shù)，可以實現(xiàn)對乳品中的脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖三大營養(yǎng)成分的共同檢測分析。在現(xiàn)階段牛乳質(zhì)量檢測技術(shù)中具有十足的發(fā)展?jié)摿19]。其原理是通過乳品中不同營養(yǎng)物質(zhì)的含氫基團對不同頻率的紅外光進行選擇性吸收來進行不同營養(yǎng)物質(zhì)的動態(tài)監(jiān)測。運用近紅外光譜系統(tǒng)在線監(jiān)控乳品中脂類含量的變化的技術(shù)已經(jīng)被廣泛使用[20]。也可以將近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合偏最小二乘方法分析后形成的光譜數(shù)據(jù)信息，能夠構(gòu)建出牛乳中脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖含量之間的校正模型[21]，該模型可以分析出3 類營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化趨勢。另外，近紅外分析技術(shù)還可以對牛乳中的體細胞數(shù)進行檢測[22]，當(dāng)牛乳的體細胞過高時可能會引起風(fēng)味欠佳、品質(zhì)下降，乳品被污染等。

3 牛乳微生物指標檢測

由于奶源致病菌防控關(guān)系到公共衛(wèi)生安全，近年來各項技術(shù)速發(fā)展，檢測技術(shù)可分為常規(guī)細菌鑒定技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)、基因檢測技術(shù)和全基因組測序技術(shù)[23]。對一些致病菌的檢出結(jié)果和檢出率，各國衛(wèi)生部門都已做出了明確規(guī)定。大部分國家的法規(guī)中，乳制品不得檢測出彎曲桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌及產(chǎn)氣夾膜梭菌，對于乳品中存在少量的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌，衛(wèi)生部門對其檢出率也有著明確的限量標準[24-25]。

3.1 常規(guī)細菌鑒定技術(shù)

常規(guī)細菌鑒定技術(shù)是檢測細菌最基本的技術(shù)，其包括細菌分離培養(yǎng)、菌落特征觀察、顯微鏡下觀察及生化試驗等。該方法優(yōu)點是結(jié)果客觀、準確，其不足是耗時、費力，至少48 h 才能獲得結(jié)果，不適合對乳品的快速檢測[23]。

3.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫檢測的基本原理就是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后會產(chǎn)生免疫現(xiàn)象。在牛乳制品的免疫學(xué)檢測中，可以利用牛乳中含有的已知抗原來檢測未知的抗體，也可使用制備好的抗體來檢測未知的抗原。對使用的抗原或抗體進行檢測都可以確認乳品是否被致病菌感染[26-27]。免疫學(xué)檢測技術(shù)在乳品中的應(yīng)用主要有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、免疫磁性分離技術(shù)、酶聯(lián)熒光免疫吸附技術(shù)（VIDAS） 等[28]。

3.2.1 血清學(xué)反應(yīng)

血清學(xué)反應(yīng)是最常規(guī)的免疫學(xué)技術(shù)，反應(yīng)中所用抗體是血清，主要包括凝集試驗和沉淀試驗等。血清學(xué)反應(yīng)可以檢測出引起牛乳腺炎疾病的主要幾種致病菌菌株[29]。凝集試驗使用的抗原為顆粒性抗原，與抗體結(jié)合后會出現(xiàn)顆粒性凝集現(xiàn)象，主要用于布魯氏桿菌和沙門氏菌等的檢驗。沉淀試驗使用的抗原是可溶性抗原，抗原與抗體結(jié)合后會產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，在牛乳源致病菌檢測中應(yīng)用較少。

血清學(xué)反應(yīng)的優(yōu)勢是其操作簡便，可以直觀觀察到試驗結(jié)果；其不足之處是試驗人為影響因素較多而導(dǎo)致靈敏度較低，因此不適合進行大批量檢測和現(xiàn)場快檢。

3.2.2 抗體標記技術(shù)

抗體標記技術(shù)是將標記物與抗體分子共價結(jié)合后和所檢測的致病菌特異性結(jié)合，形成抗原抗體結(jié)合物，再利用熒光顯微鏡、酶標儀及發(fā)光免疫檢測儀對其進行定性和定量。

（1） 酶聯(lián)免疫吸附試驗。目前，應(yīng)用最為廣泛的方法是間接ELISA。ELISA 法通過底物呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)來達到檢測目的，對于同種動物多種不同病原的檢測只需要標記一種二抗，該方法適合批量檢測。對牛乳中的沙門氏菌和黃曲霉素M1的定量檢測有著極高的靈敏度[30]。全自動酶標檢測儀和全自動洗板機在應(yīng)用中的廣泛普及，ELISA 操作的標準化程度明顯提升[31]，該方法主要應(yīng)用于我國內(nèi)蒙古地區(qū)對奶牛乳腺炎的致病菌檢測。

（2） 膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)。膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)是一種新興的標記抗體快速檢測技術(shù)，因為該技術(shù)所利用的抗體為單克隆抗體，其具有高特異性，試驗結(jié)果的準確性和檢測的靈敏度也得到保障，該方法的最大優(yōu)勢是操作簡便，可以在10 min 內(nèi)獲得試驗結(jié)果，結(jié)果易觀察判別等，因而得到廣泛應(yīng)用。在檢測時，不依賴試驗環(huán)境和試驗設(shè)備，使用組裝好的成品試劑盒就可以隨時在牧場中現(xiàn)場應(yīng)用，對操作人員的專業(yè)性要求較低，適合于基層檢測站和養(yǎng)牛戶使用。我國相關(guān)研究機構(gòu)已研發(fā)出“快速檢測牛乳源無乳鏈球菌的膠體金免疫層析試劑盒”“快速檢測牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析”“快速檢測牛乳中牛結(jié)核分枝桿菌感染早期標識物的膠體金免疫層析試劑盒”等保障牛乳源安全的快檢產(chǎn)品[32-33]。

3.3 基因檢測技術(shù)

3.3.1 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR） 技術(shù)

乳樣中含有多種類的微生物，通過對細菌的特異性研究進行相應(yīng)的PCR 試驗，可檢測出不同菌株，PCR 技術(shù)的廣泛應(yīng)用改變了在傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)中面對細菌多樣性一直存在著試驗準確度不高的問題。因為PCR 技術(shù)對單一細菌檢測的高特異性，該技術(shù)在實際應(yīng)用中得到普遍認可[34]，我國《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》中，明確要求對于乳制品中的阪崎腸桿菌的含量測定要采用PCR 技術(shù)手段來進行，目前普遍應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測[35]。對于其他不同致病菌，在檢測方法和檢出率上也各不相同。對于牛乳中志賀氏菌的檢測，最優(yōu)方案是采用快速常規(guī)PCR 與實時定量PCR 相結(jié)合的方法[36]。乳品中的蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌也可以通過采用過濾富集菌體后PCR 技術(shù)來檢測出[37-38]。

通過PCR 技術(shù)，也可反映出乳品中細菌群落結(jié)構(gòu)及體細胞總數(shù)的動態(tài)變化。對于牛乳中的金黃色葡萄球菌可以通過免疫磁球捕獲- 實時熒光PCR 法來檢測，利用該技術(shù)可以快速檢測出其含量，該方法的檢測下限為104CFU/mL[39]。后通過對16S rRNA的V3 區(qū)進行擴增，并結(jié)合實時PCR，能夠?qū)崿F(xiàn)對牛乳中的總細菌數(shù)和特定細菌的種類進行動態(tài)監(jiān)控[40]。總體來說，PCR 檢測方法最大的優(yōu)勢就是特異性強、準確度高且試驗操作較為簡便，有很高的實用價值和推廣價值[41]。

3.3.2 全基因組測序技術(shù)

通過對細菌全基因組DNA 測序、拼接、組裝，可獲取全部的基因組信息[42]，從而實現(xiàn)了功能基因注釋及個性化分析。對分離菌株的基因功能研究、致病機制及免疫機制研究該技術(shù)的發(fā)展有著重要意義，對各地區(qū)不同情況的乳源安全問題可開展針對性研究，通過細菌生態(tài)學(xué)獲取的信息，可深入掌握所在地區(qū)致病菌種的獨立強弱及優(yōu)勢基因，提出相應(yīng)的應(yīng)對防控措施。

4 發(fā)展牛乳質(zhì)量檢測技術(shù)對乳品安全和公共衛(wèi)生的意義

在我國的內(nèi)蒙古地區(qū)，乳品質(zhì)量檢測技術(shù)的不斷發(fā)展對當(dāng)?shù)啬膛I(yè)健康發(fā)展、保障乳品安全起到了巨大作用。有關(guān)科研機構(gòu)調(diào)查結(jié)果表明，內(nèi)蒙古地區(qū)牛乳安全問題主要由奶?；加腥榉垦琢餍胁∫穑渲薪瘘S色葡萄球菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌和大腸埃希菌是使奶牛感染乳房炎的主要致病菌[43]。對于以上致病菌的檢測，利用生物學(xué)技術(shù)使致病菌抗原基因特異性表達，結(jié)合間接ELISA 方法可準確地在病源乳中篩查出無乳鏈球菌及金黃色葡萄球菌[44]。在基層牛乳檢測應(yīng)用中，現(xiàn)階段研發(fā)出的快速檢測牛乳源致病菌的膠體金免疫層析試劑盒有著極高的準確度[45]。內(nèi)蒙古地區(qū)的乳源檢測技術(shù)不斷發(fā)展，使我國乳品質(zhì)量安全得到保障。

德國有著嚴格的乳品檢測制度，每個州都會設(shè)立一個獨立的第三方檢測機構(gòu)來負責(zé)該州的乳品質(zhì)量檢測工作，檢測站會定期對牧場收到的奶源進行批量檢驗，進行定級，對該牧場乳源的安全等級進行評定[46]。其工作內(nèi)容主要是對牛乳的各項理化指標進行檢測，對牛奶的脂肪、蛋白質(zhì)含量和菌群數(shù)量等都進行詳細的分析和監(jiān)控。檢測站得出的最終數(shù)據(jù)被法律認可，具有權(quán)威性，乳品加工廠會憑借該數(shù)據(jù)選擇性地向奶農(nóng)收購奶源。這樣在源頭上很大程度避免了乳品質(zhì)量的安全隱患。

新西蘭的乳品產(chǎn)業(yè)在國民經(jīng)濟中占有重要的地位，現(xiàn)階段該國主流的檢測手段是利用光譜儀對牛奶進行檢測分析，牛乳樣本被光譜儀射出的光掃過后，牛奶的不同成分會吸收不同波長的光，就可直觀地得到牛乳樣本的光譜信息[47]，然后由檢測人員分析牛奶的成分是否存在著營養(yǎng)素的缺失、致病微生物的產(chǎn)生及質(zhì)量變化的發(fā)生等。該檢測方式一般都是在新西蘭全境的牧場中進行抽樣檢測，既可在同一標準下評估乳品質(zhì)量水平，又可有效減少檢測時間和成本。

由于檢測方法眾多，在實際生產(chǎn)中應(yīng)充分結(jié)合實際情況，選擇最適宜的檢測方法。傳統(tǒng)檢測方法不斷改良研究并且與新興技術(shù)結(jié)合，充分利用多元信息，將多種檢測手段聯(lián)合應(yīng)用，開發(fā)出快速準確綠色的檢測技術(shù)來有效保障牛乳制品的安全將是未來研究的一個趨勢。牛乳品質(zhì)檢測技術(shù)的研究發(fā)展既促進了我國乳品行業(yè)的蓬勃發(fā)展，又為公共衛(wèi)生安全提供了絕對保障。