葡萄附生菌群中致腐菌拮抗酵母的篩選及初步鑒定

程雅芳，楊夢(mèng)昕，朱秋雨，覃興熹，檀倩影

（廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530023）

葡萄是廣西重要的經(jīng)濟(jì)型水果，2021 年廣西壯族自治區(qū)葡萄的栽種面積已經(jīng)超過313 km2，產(chǎn)值超84 億元。用于鮮食葡萄的產(chǎn)量占到總產(chǎn)量的80%以上，鮮食葡萄本身含糖含水量就高，極易感染病原微生物造成果梗干硬而脫粒，果實(shí)腐爛變質(zhì)，給果農(nóng)造成超過20%的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。一年兩熟的葡萄想要貯藏2 個(gè)月左右到春節(jié)前上市，貯藏保鮮的技術(shù)是目前關(guān)注的主要問題。雖然在貯藏和網(wǎng)絡(luò)銷售的過程中都應(yīng)用了低溫保藏技術(shù)，但仍有耐低溫的病原菌繁殖影響葡萄的食用價(jià)值。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，廣西葡萄貯藏中的主要致病菌為導(dǎo)致灰霉病的灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）和導(dǎo)致白腐病的白腐墊殼孢（Coniella diplodiella）。在傳統(tǒng)的保藏方法中常采用化學(xué)防腐的方法，加入化學(xué)防腐劑，如二氧化氯、硫化物[3]、二氧化硫[4]和1-甲基環(huán)丙烯[5]等化學(xué)保鮮劑。病原微生物容易對(duì)化學(xué)保鮮劑產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)也存在化學(xué)試劑殘留、環(huán)境污染和果實(shí)品質(zhì)下降等危害，對(duì)人身體健康造成潛在影響。酵母具有遺傳背景清晰、自身安全水平高、無污染、對(duì)化學(xué)抑菌劑抗性強(qiáng)、對(duì)低溫和貧養(yǎng)環(huán)境耐受性強(qiáng)、易在果蔬表面定植和適合生物保鮮等優(yōu)點(diǎn)。研究者陸續(xù)對(duì)隱球酵母、漢遜德巴利酵母、紅酵母等多種具有保鮮效果的酵母菌種進(jìn)行了研究[6-7]，證明了酵母在水果保鮮中具有顯著的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

陽光玫瑰葡萄，采購于自廣西武鳴東盟開發(fā)區(qū)基地，選用成熟度基本一致且無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)[5]，用無菌帶密封，用微生物采樣箱（0 ～4 ）帶回實(shí)驗(yàn)室4 保藏?；移咸焰呙梗˙otrytis cinerea）和白腐墊殼孢（Coniella diplodiella），廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（Potato Dextrose Broth，PDB）、YPDA 霉菌酵母計(jì)數(shù)增菌培養(yǎng)瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基，北京陸橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。樣品洗脫液的配制：0.9%氯化鈉、0.1%蛋白胨、0.01%吐溫80。

GI54DP 立式壓力蒸汽滅菌器，廈門致微；BCC-1000IIA2 生物安全柜，上海申安醫(yī)療器械廠；E100 顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；LRH-150-B 生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 拮抗酵母菌的篩選

1.2.1 樣品的采集

選擇廣西武鳴東盟開發(fā)區(qū)基地3 種葡萄品種（陽光玫瑰、巨峰玫瑰、維多利亞）葡萄種植區(qū)，分別對(duì)果實(shí)、葉片、土壤隨機(jī)取3 個(gè)樣，然后進(jìn)行密封包裝，并標(biāo)記時(shí)間、地點(diǎn)、種類[8]。

（1）梯度稀釋法[9-10]。土壤取樣除去葡萄根際表層3 ～4 cm 的浮土，取4 ～10 cm 處的土壤裝于無菌取樣袋中，風(fēng)干后過篩，混勻后取15 g，溶于100 mL樣品洗脫液中，加入玻璃珠在180 r·min-1的搖床上28 振蕩90 min。將洗脫液用無菌生理鹽水稀釋3 個(gè)梯度10-1、10-2、10-3，分別吸取稀釋液100 μL涂布到葡萄汁平板（1 ∶10 陽光玫瑰葡萄原汁），4 培養(yǎng)12 d，選取形態(tài)不同但類似酵母形態(tài)的單菌落，在YPDA 培養(yǎng)基上劃線純化，顯微鏡鏡檢后，留存類似酵母的真菌。

（2）表面提取法。選擇3 個(gè)品種，每個(gè)品種的果實(shí)在不同區(qū)域采樣，選取無病傷且果粉保持較好的果實(shí)15 個(gè)，放入三角瓶，樣品提取液沒過果實(shí)。將其放入28 搖床180 r·min-1振蕩洗脫60 min。采用（1）同樣方法做3 個(gè)稀釋度，在葡萄汁平板4 培養(yǎng)12 d，YPDA 培養(yǎng)基純化、鏡檢留存類似酵母的真菌。

1.2.2 致病真菌的純化培養(yǎng)

對(duì)-80 低溫保藏的灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）和白腐墊殼孢（Coniella diplodiella）進(jìn)行活化，在100 mL 的PDB 培養(yǎng)液中28 培養(yǎng)72 h，涂布在PDA 平板，28 培養(yǎng)7 d，刮取適量孢子，放入含250 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，加玻璃珠振蕩搖勻、濾紙過濾，除去菌絲后得到孢子懸浮液，在4 冰箱保存、待用。使用時(shí)涂布到PDA 平板。

1.2.3 PDA 平板初篩及對(duì)峙法復(fù)篩

通過模擬葡萄貯藏條件，初步得到在低溫、低營(yíng)養(yǎng)的平皿上仍能繁殖的菌株，通過初步形態(tài)和顯微鏡觀察為酵母菌的菌株，分別接種于含有灰葡萄孢霉和白腐墊殼孢的PDA 平板上，通過平板透明圈法選出具有抑制效果拮抗酵母12 株。采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)具有初步耐低溫且有抑菌作用的12 株酵母菌進(jìn)行復(fù)篩，觀察并測(cè)定酵母菌株的拮抗系數(shù)。用YPD培養(yǎng)基28 培養(yǎng)拮抗酵母，用血球計(jì)數(shù)法測(cè)酵母菌濃度，取濃度為1.3×108CFU·mL-1的酵母菌懸液均勻地涂布在9 cm 的PDA 培養(yǎng)基上，中心放置直徑為3 mm 的培養(yǎng)第5 d 的病原菌菌餅，每個(gè)酵母菌做3 個(gè)重復(fù)，無菌水處理作為對(duì)照[11]。28 恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌絲擴(kuò)展速度。第5 天測(cè)量病原菌的菌落直徑。根據(jù)公式（1）分別計(jì)算對(duì)灰霉病致病菌和白腐病致病菌的抑菌率，篩選出對(duì)兩種致病真菌均有拮抗作用的菌株1 株。

1.3 果實(shí)體內(nèi)拮抗實(shí)驗(yàn)

選擇新鮮飽滿、無機(jī)械損傷和病蟲害的陽光玫瑰果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，用75%酒精消毒，無菌水沖洗后風(fēng)干[12]。每粒葡萄果實(shí)用滅菌后的接種針刺5 個(gè)孔（2 mm 深），將針刺過的葡萄放入1.3×108CFU·mL-1的酵母菌懸液浸泡1 min 后取出風(fēng)干，再將果粒浸泡到灰葡萄孢霉的孢子懸液中1 min，撈出風(fēng)干。同樣處理方式，用無菌果實(shí)，先針刺再浸泡于1.3×108CFU·mL-1酵母菌懸液1 min，再將果實(shí)泡在白腐墊殼孢的孢子懸濁液中1 min，撈出自然風(fēng)干[12]。模擬售賣葡萄的兩種貯藏條件做果實(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：①在4 冷藏20 d 后25 貯藏5 d，計(jì)算葡萄的腐爛率（果粒表面病原菌導(dǎo)致出現(xiàn)斑塊時(shí)即認(rèn)定為腐爛）；②在室溫（25 ）貯藏15 d 后計(jì)算葡萄的腐爛率。兩種貯藏方式同時(shí)做空白對(duì)照（未浸泡拮抗酵母）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次[13]。根據(jù)公式（2）計(jì)算葡萄果實(shí)的腐敗率。

1.4 拮抗酵母菌的鑒定

對(duì)篩選出拮抗效果最明顯的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，將其菌株接種于PDA 平板上，在28 條件下培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)。同時(shí)進(jìn)行碳源同化、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。采用26S rDNA 序列分析法，對(duì)拮抗效果明顯的酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，采用D1/D2 區(qū)域通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，利用MEGA5.05 構(gòu)建系統(tǒng)選擇相似度最高的酵母菌株序列建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹鑒別[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母菌的分離純化結(jié)果

葡萄一般貯藏在4 下，且葡萄表面營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并不豐富，因此選用低溫、低養(yǎng)分條件，用稀釋葡萄汁為培養(yǎng)基篩選拮抗酵母菌，篩選出在此條件下，仍能生長(zhǎng)良好的酵母菌32 株，其中根系土壤樣本收集到拮抗酵母菌21 株，果實(shí)樣本收集到拮抗酵母菌8 株，葉片樣本收集到拮抗酵母菌3 株。

2.2 拮抗酵母篩選結(jié)果

PDA 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從武鳴果園采集的樣本中分離出的32 株酵母菌，其中W1-8、W2-19、H1-5、H2-23、Y3-1、Z2-12、Z2-3 對(duì)引起葡萄灰霉病的灰葡萄孢霉拮抗效果較好；W2-3、H1-11、H2-3、Y3-7、Y1-18、Z2-12 對(duì)引起葡萄白腐病的白腐墊殼孢拮抗效果較好（表1）。其中在32 個(gè)酵母菌株中只有代號(hào)Z2-12 對(duì)灰葡萄孢霉和白腐墊殼孢都具有明顯的拮抗效果（圖1）。對(duì)于病原菌具有較好抑制效果的菌株，分別將其用于后續(xù)的活體防病實(shí)驗(yàn)。

圖1 Z2-12 對(duì)葡萄灰霉病菌和白腐病菌的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

表1 不同初篩酵母對(duì)兩種病原真菌的抑菌率

2.3 果實(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖2 中可以看出，Z2-12 對(duì)兩種真菌引起的陽光玫瑰葡萄腐爛抑制效果明顯。使用Z2-12 酵母懸液處理葡萄果實(shí)，在第一種貯藏條件下（4 冷藏20 d、25 貯藏5 d），對(duì)照組白腐病腐爛率為54.2%，拮抗組為12.1%；在第二種貯藏條件下（室溫25 貯藏15 d）對(duì)照組白腐病的腐爛率為72.4%，拮抗組的腐爛率為28.9%，兩種條件下，拮抗組的腐爛率均明顯低于對(duì)照組。同樣的方法，在第一種貯藏條件下，對(duì)照組灰霉病腐爛率57.3%，拮抗組為19.7%；在第二種貯藏條件下，對(duì)照組灰霉病腐爛率為80.2%，拮抗組為30.7%，同樣說明兩種條件下拮抗組的灰霉病腐爛率明顯低于對(duì)照組。

圖2 Z2-12 對(duì)致病真菌導(dǎo)致的腐爛的控制效果

2.4 拮抗菌株Z2-12 的鑒定

如圖3 所示，拮抗酵母Z2-12 的菌落形態(tài)為中間隆起的圓形、乳白色且不透明，無色素，表面光滑濕潤(rùn)無褶皺，邊緣完整光滑。菌體在光學(xué)顯微鏡下成橢圓透明狀，在液體培養(yǎng)基中沉淀生長(zhǎng)且產(chǎn)氣。從表2 可以看出，待測(cè)酵母Z2-12 對(duì)葡萄糖、蔗糖、海藻糖等能進(jìn)行發(fā)酵且可以進(jìn)行同化，對(duì)乳糖、麥芽糖、淀粉不能進(jìn)行發(fā)酵和同化。經(jīng)26S rDNA 序列分析鑒定，該菌與GenBank 中為Saccharomyces cerevisiaeAY939814.1（釀酒酵母）相似性達(dá)99%。初步判斷Z2-12 菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖3 Z2-12 菌落形態(tài)

表2 Z2-12 菌株對(duì)相關(guān)糖的利用情況

3 結(jié)論

在植物生長(zhǎng)的環(huán)境中，存在豐富的生防微生物。尋找在低溫、限制營(yíng)養(yǎng)的條件下同樣能起到生防效果的微生物，對(duì)葡萄貯藏保鮮的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值更大。本文利用1 ∶10 葡萄汁培養(yǎng)基，在4 下篩選出生長(zhǎng)狀態(tài)良好Z2-12 菌株，在PDA 培養(yǎng)基上顯示出對(duì)灰葡萄孢霉和白腐墊殼孢都具有良好的拮抗效果，對(duì)這兩種致病菌的抑制率分別是53.07%和68.28%。同時(shí)用在陽光玫瑰表面做果實(shí)體內(nèi)測(cè)試，結(jié)果表明在兩種貯藏條件下，Z2-12 酵母懸液處理過的果實(shí)都表現(xiàn)出明顯的拮抗效果，白腐病的腐爛率比對(duì)照組的分別減少了42.1%和43.5%；灰霉病的腐爛率比對(duì)照組的分別減少了37.6%和49.5%。在兩種貯藏條件下，Z2-12 對(duì)兩種腐爛病都有明顯的抑制效果。結(jié)合拮抗菌株Z2-12 的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，判斷該菌為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。此菌株在低溫貯藏和常溫銷售的過程中都可以表現(xiàn)良好保鮮效果，此菌株的拮抗機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。在后續(xù)的研究中可分析Z2-12 菌株酵母發(fā)酵液的濃度、pH 值等發(fā)酵條件對(duì)保鮮作用的影響，進(jìn)一步結(jié)合物理保鮮方法，提高陽光玫瑰葡萄的儲(chǔ)藏期和貨架期，可以實(shí)現(xiàn)鮮食葡萄的產(chǎn)期調(diào)節(jié)和一年兩收葡萄在中國(guó)主要節(jié)慶消費(fèi)高峰時(shí)段的鮮果供應(yīng)，提高果農(nóng)經(jīng)濟(jì)收益。