基于“以不變應(yīng)萬變”的策略研發(fā)泛β 屬冠狀病毒疫苗

江含筱

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海市重大傳染病和生物安全研究院

王欣玲

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海市重大傳染病和生物安全研究院

陸路

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海市重大傳染病和生物安全研究院

姜世勃*

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海市重大傳染病和生物安全研究院

2019年12月，一場(chǎng)由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒感染（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情暴發(fā)并迅速蔓延，成為全球公共衛(wèi)生緊急事件[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）公布的數(shù)據(jù)，截至2023年11月4日，全球新冠確診病例已超過7.7 億例，其中近700 萬例死亡，且病例數(shù)仍持續(xù)增加[2]。在21 世紀(jì)前20年中，我們還經(jīng)歷過2003年由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）引起的傳染性非典型肺炎疫情[3]，以及2012年由中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome，MERS-CoV）引起的中東呼吸綜合征疫情[4]。這3 種病毒均為β屬冠狀病毒（β-CoV），對(duì)全球公共衛(wèi)生及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，SARS-CoV-2的病死率約為0.9%，明顯低于SARS-CoV（9.6%）和MERS-CoV（34.4%）[5-6]。由于SARS-CoV-2 感染者中無癥狀或輕癥感染比例較高，該病毒的變異率更高、傳播速度更快、傳播范圍更廣[7]。此外，MERS-CoV 自2012年 流行至今仍未消失，如果MERSCoV 與SARS-CoV-2 重組形成MERS-CoV-2 或SARSCoV-3，有可能兼具M(jìn)ERSCoV 的高致死性和SARSCoV-2 的高傳播性，會(huì)給人類帶來更大的危害[8]。也有研究表明，SARS 相關(guān)的蝙蝠病毒（SARSrelated coronavirus，SARSr-CoV）對(duì)人類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（human angiotensinconverting enzyme 2，hACE2）有很高的親和力，提示其具有跨物種傳播的可能性[9]。在此背景下，為有效防控SARS-CoV-2及其變異株，以及未來新發(fā)與再現(xiàn)的β屬冠狀病毒疫情，研發(fā)泛β-CoV 疫苗具有重要意義。

近20年來，筆者團(tuán)隊(duì)致力于研發(fā)抗冠狀病毒疫苗，先后報(bào)道多種抗SARS 和MERS 的候選疫苗。在新冠疫情暴發(fā)之后，團(tuán)隊(duì)基于已有經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，采用“以不變應(yīng)萬變”的策略（選用原始毒株蛋白中保守的抗原位點(diǎn)設(shè)計(jì)疫苗），進(jìn)一步聚焦于保守抗原位點(diǎn)和新型高效佐劑的研究，開發(fā)出首個(gè)基于新型佐劑的中廣譜（pan-sarbecovirus）疫苗和大廣譜（pan-β-CoV）疫苗候選。本文將對(duì)近年來廣譜冠狀病毒疫苗的研發(fā)策略及成果進(jìn)行總結(jié)，期望為進(jìn)一步研發(fā)大廣譜或超廣譜（pan-CoV）冠狀病毒疫苗提供參考。

1 概述

1.1 冠狀病毒的分類

冠狀病毒屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae），是單股正鏈RNA 病毒。其包膜上有形似皇冠的棘狀突起，由此得名[10]。根據(jù)基因組和血清學(xué)特點(diǎn)，冠狀病毒可分為α、β、γ、δ四大屬，已知可以感染人類的冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）有α和β屬，而γ和δ屬主要感染禽類[11]。α屬冠狀病毒包括HCoV-229E 和HCoVNL63 等，可引起普通感冒癥狀[12]。β屬冠狀病毒可再分為A、B、C、D 四個(gè)譜系。其中，A 譜系包 括HCoV-OC43 和HCoVHKU1，致病力較弱；B 譜系也稱沙貝冠狀病毒（sarbecovirus），包括SARS-CoV、SARSCoV-2 以 及SARSr-CoV，前兩者感染可造成嚴(yán)重急性呼吸綜合征；C 譜系又稱瑪貝冠狀病毒（merbecovirus），包括MERS-CoV 和MERS 相關(guān)的蝙蝠病毒（MERSr-CoV）等，也具有較強(qiáng)的致病性[13]。

隨著新冠疫情的持續(xù)傳播，SARS-CoV-2 已演化出眾多變異株。WHO 把具有較強(qiáng)傳播與免疫逃逸潛力的毒株歸為值得關(guān)切的變體（variants of concern，VOC），包括Alpha、Beta、Gamma、Delta 和Omicron。其中，Omicron 是目前主要流行的毒株，其傳播復(fù)雜且隱匿，可進(jìn)一步分為BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5 五個(gè)亞譜系[14]。亞譜系根據(jù)基因序列的細(xì)微差異，又衍生出多個(gè)進(jìn)化分支，如XBB.1.5、EG.5、BA.2.86、BQ.1.1、BF.7.14 等。變異株的不斷涌現(xiàn)，使現(xiàn)有疫苗的有效保護(hù)率明顯下降，甚至可能導(dǎo)致注射疫苗者及既往感染者所建立的免疫屏障失效，增加突破性感染和再感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要研發(fā)安全有效的廣譜抗冠狀病毒疫苗，以應(yīng)對(duì)目前流行及未來可能出現(xiàn)的冠狀病毒疫情。

1.2 新冠病毒的結(jié)構(gòu)

新冠病毒由包膜、單鏈RNA及多種蛋白組成。其基因組編碼4 種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，包括病毒表面的刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M），以及在病毒內(nèi)部的核衣殼蛋白（N）[15]。其中，S 蛋白在受體識(shí)別和結(jié)合以及膜融合和病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用，是疫苗研發(fā)的主要靶點(diǎn)[16]。

S 蛋白以同型三聚體的形式存在，每個(gè)單體由S1 和S2亞基組成。S1 亞基包含信號(hào)肽（signal peptide，SP）、N 端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）和C 端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）。CTD 內(nèi)含有受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD），后者是一個(gè)重要的功能域，能夠識(shí)別并結(jié)合hACE2，引起S 蛋白構(gòu)象改變[17]。RBD 是開發(fā)新冠疫苗常用的免疫原，然而RBD 的中和表位易發(fā)生突變，大大削弱了現(xiàn)有疫苗的效果[18]。因此，研究者們積極尋找RBD 的保守區(qū)域，目前已揭示了隱藏在三聚體內(nèi)部的RBD高度保守表位，在新冠病毒高頻突變株中均無突變，這對(duì)于廣譜疫苗的開發(fā)具有很好的借鑒意義[19]。

S2 亞基由融合肽（fusion peptide，F(xiàn)P）、七肽重復(fù)序列（heptad repeat，HR）1 區(qū)（HR1）和2 區(qū)（HR2）、中心螺旋區(qū)（central helix，CH）、連接域（connection domain，CD）、莖螺旋區(qū)（stem helix，SH）、跨膜區(qū)（transmembrane region，TM）、細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（cytoplasmic domain，CP）組成。其中，HR1 和HR2 相互作用形成六螺旋束（6-HB），是介導(dǎo)病毒膜融合的關(guān)鍵步驟[20]。也有一些研究發(fā)現(xiàn)，靶向SH 區(qū)的中和抗體對(duì)β屬冠狀病毒有廣譜中和作用[21-23]。此外，F(xiàn)P 區(qū)在所有冠狀病毒中屬中高度保守區(qū)域，目前已發(fā)現(xiàn)靶向該表位的抗體對(duì)α、β屬冠狀病毒均有良好的中和活性[24-26]。在S 蛋白融合前構(gòu)象中，S2 亞基上的中和位點(diǎn)并不充分暴露，其序列比S1 亞基更為保守[27]。因此，S2 亞基上的HR1、HR2、SH、FP 結(jié)構(gòu)域是開發(fā)廣譜冠狀病毒疫苗的重要靶點(diǎn)。

2 已獲批的新冠病毒疫苗

接種疫苗是應(yīng)對(duì)感染性疾病的有效防控手段之一。WHO 公開數(shù)據(jù)顯示，截至2023年11月25日，全球疫苗接種超過136 億劑[2]。新冠疫苗種類繁多，大致可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、重組蛋白亞單位疫苗、核酸疫苗、重組腺病毒載體疫苗、病毒樣顆粒疫苗六大類。

目前，已有12 種新冠疫苗（被稱為“第一代新冠疫苗”）獲WHO 緊急使用授權(quán)，包括4 種病毒載體疫苗、3 種滅活疫苗、3 種重組蛋白亞單位疫苗、2 種mRNA 疫苗[28]。在新冠疫情暴發(fā)后僅一年多的時(shí)間里，新冠疫苗便被陸續(xù)開發(fā)并投入使用，顯著降低了原始毒株感染者的重癥和死亡發(fā)生率，挽救了成千上萬條生命。然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，第一代新冠疫苗存在低效、短效、窄譜的缺陷，不能有效地預(yù)防新冠病毒及其變異株的感染和傳播[29]。其主要原因在于，第一代新冠疫苗通常使用中和免疫原性較差的疫苗抗原，如S 蛋白或滅活病毒顆粒[30]。雖然這些抗原中也含有RBD，但其中的中和位點(diǎn)未能充分暴露并保持適當(dāng)?shù)目臻g構(gòu)型。這些抗原中還含有多個(gè)非中和抗體免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)，其誘導(dǎo)的大量非中和抗體或有害的抗體反應(yīng)可干涉或壓抑中和抗體反應(yīng)[31]。

不斷出現(xiàn)的新冠病毒變異株產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫逃逸，對(duì)于使用原始毒株蛋白抗原開發(fā)的第一代新冠疫苗和抗體藥物幾乎完全不敏感。很多研究團(tuán)隊(duì)或疫苗開發(fā)商采用“以變應(yīng)變”（根據(jù)變異株蛋白序列重新設(shè)計(jì)疫苗）的策略開發(fā)新一代的疫苗，但其開發(fā)速度總是趕不上新冠病毒變異的速度，導(dǎo)致最新變異株迅速向全球蔓延。因此，為更好地對(duì)抗病毒持續(xù)變異造成的威脅，扭轉(zhuǎn)“以變應(yīng)變”的被動(dòng)局面，應(yīng)當(dāng)采取“以不變應(yīng)萬變”（選用原始毒株蛋白中保守的抗原位點(diǎn)設(shè)計(jì)疫苗）的策略，研發(fā)高效廣譜的泛沙貝冠狀病毒或泛β屬冠狀病毒疫苗，從而有效地預(yù)防新冠病毒及其變異株和其他β屬冠狀病毒的感染、傳播與流行。

3 廣譜抗冠狀病毒疫苗研究策略

新冠疫情暴發(fā)之初，筆者團(tuán)隊(duì)就呼吁研發(fā)高效、廣譜的抗冠狀病毒疫苗，來應(yīng)對(duì)新冠病毒可能出現(xiàn)的變異[32]。根據(jù)效用范圍，抗冠狀病毒疫苗可分為小廣譜、中廣譜、大廣譜、超廣譜這四類。小廣譜疫苗，即泛新冠病 毒（pan-SARS-CoV-2）疫苗，對(duì)新冠病毒及其變異株有效，如將Omicron 變異株的S蛋白添加至針對(duì)原始毒株的疫苗中制得的多價(jià)疫苗[33]。中廣譜疫苗，即泛沙貝冠狀病毒（pansarbecoviruses）疫苗，在小廣譜的基礎(chǔ)上還需對(duì)SARS-CoV和SARSr-CoV 有 效。WHO 在2022年召開緊急會(huì)議，向全世界呼吁要盡快開發(fā)泛沙貝冠狀病毒疫苗（中廣譜疫苗），以防控新冠疫情及未來可能出現(xiàn)的SARS 樣傳染病。目前，針對(duì)中廣譜疫苗的開發(fā)策略主要包括納米顆?？乖d體、嵌合mRNA 疫苗、增強(qiáng)免疫反應(yīng)的新型佐劑等[34]。大廣譜疫苗，即泛β屬冠狀病毒（pan-β-CoV）疫 苗，對(duì)β屬各譜系冠狀病毒均有效，這是未來疫苗研發(fā)的主攻方向，不僅能夠控制目前流行的新冠病毒及其變異株感染，還可預(yù)防未來可能出現(xiàn)的其他β屬冠狀病毒的流行。超廣譜疫苗，即泛冠狀病毒（pan-CoV）疫苗，能夠抗7 種已知的人冠狀病毒。由于這些病毒的RBD 序列與結(jié)構(gòu)存在較大差異，超廣譜疫苗開發(fā)充滿挑戰(zhàn)。

3.1 RBD-Fc 二聚體

受體結(jié)合域（RBD）位于S1 亞基上，能夠與人呼吸道上皮細(xì)胞表面ACE2 受體特異性結(jié)合，促進(jìn)病毒入侵宿主細(xì)胞。在SARS 流行期間，筆者團(tuán)隊(duì)在國際上首次報(bào)道SARS-CoV 的S 蛋白中的主要中和抗體表位位于RBD[35]。使用RBD-Fc 二聚體（將人的IgG Fc 片段連接到RBD 所形成的重組蛋白）免疫小鼠和兔子，其血清的中和抗體滴度高達(dá)10 000 以上[36]。使用RBD-Fc 二聚體免疫小鼠的淋巴細(xì)胞制備出25 株高中和效價(jià)的單克隆抗體，用這些單抗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RBD 上存在6 種不同構(gòu)象的中和表位[37]。從SARS-CoV 滅活疫苗免疫的動(dòng)物血清和SARSCoV 感染者血清中分離的中和抗體，主要作用于RBD[38]。因此研究者認(rèn)為，RBD 是研發(fā)SARSCoV 疫苗和抗體藥物的最重要的靶點(diǎn)，并在此后研發(fā)出一系列靶 向RBD 的 抗SARS-CoV、MERS-CoV 和新冠病毒的候選疫苗及中和抗體[39-42]。

截至目前，多個(gè)研發(fā)團(tuán)隊(duì)基于RBD 的疫苗研發(fā)已取得積極進(jìn)展。例如，智飛生物與中國科學(xué)院微生物研究所聯(lián)合開發(fā)的RBD 二聚體疫苗（ZF2001），成為國際上首個(gè)注冊(cè)上市的重組亞單位新冠疫苗[43]。麗珠醫(yī)藥與中國科學(xué)院生物物理研究所合作研發(fā)IFN-Pan-RBD-Fc 融合蛋白疫苗（V-01），Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果證明其可有效預(yù)防Omicron變異株[44]。四川大學(xué)華西醫(yī)院魏于全院士團(tuán)隊(duì)研發(fā)的新冠病毒RBD 疫苗（威克欣）是全球首款使用昆蟲（Sf9）細(xì)胞生產(chǎn)的重組亞單位新冠疫苗[45]。他們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)成功的重組三價(jià)新冠病毒（XBB+BA.5+Delta 變異株）RBD 三聚體蛋白疫苗現(xiàn)已納入緊急使用，可在我國多個(gè)大城市對(duì)于重點(diǎn)人群進(jìn)行加強(qiáng)免疫接種。這些成果再次證明了RBD是研發(fā)冠狀病毒疫苗和抗體的最佳靶點(diǎn)之一。

天然RBD 以三聚體形式存在，為何將Fc 連接到RBD 所形成的RBD-Fc 二聚體能夠比RBD 單體或三聚體誘導(dǎo)出更高效、更廣譜的中和抗體反應(yīng)？研究表明，RBD-Fc 二聚體可以通過Fc 結(jié)合到抗原提呈細(xì)胞（APC）上的Fc 受體，促進(jìn)RBD 抗原的捕獲和提呈，從而發(fā)揮分子內(nèi)佐劑效應(yīng)；能夠提高抗原的分子量、半衰期和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)產(chǎn)生更高效的中和抗體反應(yīng)[46-48]。RBDFc 自動(dòng)形成的二聚體結(jié)構(gòu)能夠充分暴露隱藏在RBD 三聚體中的保守中和表位，從而誘導(dǎo)更廣譜的中和抗體反應(yīng)[19]。

3.2 加帽法或脫帽法

RBD 含有能誘導(dǎo)強(qiáng)烈中和免疫反應(yīng)的表位，因而被作為病毒亞單位疫苗的重要靶點(diǎn)。但其中也含有一些可誘導(dǎo)非中和抗體的免疫顯性區(qū)域，而病毒就能夠利用這些非中和表位來轉(zhuǎn)移宿主的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫逃逸[49-50]。

筆者團(tuán)隊(duì)通過兩種方式對(duì)重組RBD 疫苗進(jìn)行優(yōu)化。一種是“加帽法”，即添加糖基化氨基酸遮蓋RBD 中的免疫優(yōu)勢(shì)非中和表位。通過引入中和免疫原性指數(shù)（neutralizing immunogenicity index，NII）和廣譜中和免疫原性指數(shù)（broad neutralizing immunogenicity index，BNII）的概念來評(píng)估單個(gè)表位的免疫原性，篩選出MERS-CoV RBD中一個(gè)免疫顯性非中和表位Thr579，引入聚糖探針掩蓋這一表位（T579N），可以增強(qiáng)RBD的中和活性及其對(duì)免疫小鼠的保護(hù)效力[40]。另一種是“脫帽法”，即去除糖基化氨基酸來暴露RBD中的保守中和抗體表位。團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一系列脫糖基化的SARSCoV RBD 蛋白抗原，并發(fā)現(xiàn)了其中一種脫糖基化RBD 蛋白（RBD219-N1）在免疫小鼠中誘導(dǎo)更強(qiáng)的RBD 特異性抗體反應(yīng)和更高的中和抗體水平[51]。這些結(jié)果表明，通過引入或去除糖基化氨基酸，掩蓋免疫優(yōu)勢(shì)非中和性表位或暴露中和表位，將宿主的免疫反應(yīng)集中到保守的中和表位上，為設(shè)計(jì)更高效而廣譜的抗病毒亞單位疫苗提供了思路。

3.3 含有能充分暴露新冠病毒RBD 的class 3 和（或）class 4 中和表位的疫苗

新冠病毒S 蛋白三聚體由3個(gè)相同單體組成，RBD 位于每個(gè)單體的尖端。RBD 從“向下（down）”狀態(tài)翻轉(zhuǎn)為“向上（up）”狀態(tài)，在此處暴露出一段受體結(jié)合基序（receptor-binding motif，RBM）。RBM 是RBD的主要功能區(qū)域，能夠直接識(shí)別并結(jié)合ACE2，介導(dǎo)病毒入侵。在S 蛋白融合前構(gòu)象中，RBM已經(jīng)暴露在外，因而具有較高的突變率[52]。

根據(jù)抗體與RBD 的結(jié)合模式，抗RBD 抗體可分為4 類（class 1～4）[53]。class 1 靶 向RBM，只能結(jié)合處于“up”狀態(tài)的RBD，代表性抗體包括REGN10933、CB6 等；class 2 也靶向RBM，可結(jié)合處于“up”或“down”狀態(tài)的RBD，如CT-P59、LY-CoV555 ；class 3 的表位位于RBM 之外，屬于非ACE2 競(jìng)爭(zhēng)性抗體，如DH1047、S2X259 ；class 4針對(duì)RBM 遠(yuǎn)端的保守表位，對(duì)多種冠狀病毒具有交叉反應(yīng)性，代表性抗體有LY-CoV1404、S309。相比于高度可變的class 1 和class 2 的中和表位，class 3 和class 4 的中和表位更加保守。特別是class 4 的中和表位，在自然狀態(tài)下存在于RBD 三聚體中心部位，不能充分顯露[54]。因此，研究人員用RBD 序列隨機(jī)排列的方式暴露保守表位，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生廣譜的交叉中和抗體反應(yīng)[55]。也有研究者設(shè)計(jì)構(gòu)建了靶向class 3 和class 4 的中和表位小分子全人源納米抗體，能夠鉆入三聚體內(nèi)部并與隱藏的保守表位相結(jié)合，強(qiáng)效中和新冠病毒所有流行突變株[19]。這些方法為開發(fā)更為廣譜的新冠病毒疫苗與療法提供了新的思路。

3.4 高變異抗原的趨同突變和保守表位的S 蛋白

新冠病毒作為RNA 病毒，在復(fù)制過程中往往容易發(fā)生基因的隨機(jī)突變。這些突變不斷累積以逃避免疫，導(dǎo)致人群在接種疫苗后出現(xiàn)突破性感染[56]。若能在新冠病毒龐大的進(jìn)化圖譜中找尋出規(guī)律，預(yù)測(cè)病毒的演變方向，則有助于設(shè)計(jì)和構(gòu)建廣譜抗冠狀病毒疫苗。

研究人員對(duì)超過1000 萬個(gè)新冠病毒序列進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)新冠病毒S 蛋白的突變并非完全隨機(jī)，而是遵循3 條路徑定向分化：一是高感染性和低免疫逃逸能力（如Delta 變異株）；二是低感染性和高免疫逃逸能力（如Gamma 變異株）；三是高感染性和高免疫逃逸能力（這一路徑比較少見，如Beta 變異株）。在此基礎(chǔ)上，研究人員對(duì)NCBI 數(shù)據(jù)庫中2675 個(gè)新冠病毒S 蛋白作進(jìn)化聚類和結(jié)構(gòu)掃描，得到高變異S 蛋白的共性突變以及保守表位，據(jù)此設(shè)計(jì)出一種泛新冠病毒S 抗 原（Span）。Span 疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高效廣譜的中和抗體，甚至能有效降低后來出現(xiàn)的Omicron 變異株感染者的病死率[57]。這一結(jié)果表明，病毒進(jìn)化分析可以為新冠病毒通用疫苗設(shè)計(jì)提供可靠依據(jù)，對(duì)抗現(xiàn)有及未來可能出現(xiàn)的流行變異株。

3.5 含有HR1 和HR2區(qū)段的廣譜新冠病毒疫苗

HR1 和HR2位于S2 亞基，兩者形成的六螺旋體結(jié)構(gòu)促進(jìn)膜融合。在20 世紀(jì)90年代初，筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)衍生于HIV-1 gp41的HR2 區(qū)的多肽SJ-2176 能高效抑制HIV-1 的融合和入侵[58]。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，HR2 多肽能夠結(jié)合HIV-1 gp41 的HR1 區(qū)，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制病毒的HR2 與HR1結(jié)合形成6-HB，從而阻止HIV的融合與入侵。這一發(fā)明專利轉(zhuǎn)讓給美國Trimeris 公司，開發(fā)出全球首個(gè)基于病毒融合抑制劑的抗HIV 多肽藥物——恩夫韋肽（Enfuvirtide，又 稱T20）。由重組蛋白N36Fd[59]和HR1-HR2-HR1 串聯(lián)蛋白（HR121）[60]所形成的三聚體能夠模擬gp41融合中間體的HR1 三聚體，與HIV-1 gp41 的HR2 結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制病毒的HR1 與HR2 結(jié)合形成6-HB，從而阻止HIV 的融合與入侵。

在新冠疫情出現(xiàn)后，研究人員借鑒抗HIV 藥物開發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)新冠病毒S 蛋白S2 亞基的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了重組蛋白HR121。研究證明，HR121 可抑制新冠病毒膜融合，且能夠在免疫動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)生成針對(duì)新冠病毒及其變異株（尤其是Omicron）的廣譜中和抗體[61]，表明HR121 重組蛋白有潛力被開發(fā)為靶向新冠病毒S2 亞基HR1 區(qū)中保守中和表位的抗新冠病毒及其變異株的廣譜疫苗，有很好的開發(fā)前景。

3.6 含有SH 區(qū)段的廣譜疫苗

莖螺旋區(qū)（SH）位于S2 亞基上，深藏于S 蛋白三聚體內(nèi)部。美國斯克利普斯（Scripps）研究所的研究團(tuán)隊(duì)從新冠康復(fù)者血清中分離出一系列交叉反應(yīng)抗體，發(fā)現(xiàn)這些抗體與多種β屬冠狀病毒有不同程度的交叉反應(yīng)[62]。其中，CC40.8 抗體能同時(shí)中 和SARS-CoV 和SARSCoV-2，結(jié)構(gòu)分析得知CC40.8主要結(jié)合S 蛋白的SH 區(qū)段[21]。后續(xù)進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)了一些靶向SH 區(qū)段的人源抗體（如S2P6、CV3-25），表現(xiàn)出對(duì)β屬冠狀病毒的廣泛中和活性[22-23]。SH 區(qū)不僅在BQ.1.1、XBB 等Omicron 變異株上高度保守，還在數(shù)十個(gè)新冠高頻突變株上未發(fā)生突變[63]。因此，SH 區(qū)段是設(shè)計(jì)泛β屬冠狀病毒疫苗的關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)廣譜疫苗的開發(fā)具有很好的借鑒意義。

3.7 含有FP 區(qū)段的廣譜疫苗

融合肽（FP）位于S2 亞基N 端。只有當(dāng)S 蛋白與受體結(jié)合時(shí)，F(xiàn)P 區(qū)段才能夠暴露出來，因此這一區(qū)段具有較高的保守性。研究者采用經(jīng)典的單個(gè)B 細(xì)胞技術(shù)，從新冠康復(fù)患者外周血中分離出S 蛋白特異性記憶B 細(xì)胞，獲得其抗體序列，由此制備出一系列人源抗體，再通過表位篩選，得到一株廣譜抗體（76E1）。研究表明，76E1 可以廣譜中和7種人類冠狀病毒（HCoV），且對(duì)部分γ和δ屬冠狀病毒也表現(xiàn)出一定的中和活性[24]。隨后發(fā)現(xiàn)的COV44-62、COV44-79、VN01H1、C77G12 等抗體也靶向FP 區(qū)段，對(duì)多種β屬冠狀病毒有中和作用[25-26]。該系列研究表明，融合中間構(gòu)象暴露的FP區(qū)段在冠狀病毒中高度保守，這使超廣譜疫苗的研發(fā)成為可能。

3.8 含 有HR1、CH、SH 區(qū)段的廣譜冠狀病毒疫苗

S2 亞基的相對(duì)保守性使其成為廣譜疫苗的重要靶點(diǎn)。HR1、CH、SH 均位于S2 亞基。在S蛋白與宿主細(xì)胞融合后構(gòu)象中，HR1 與CH 形成三螺旋體，SH位于CH 附近。筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)這3個(gè)區(qū)域進(jìn)行保守序列分析，設(shè)計(jì)合成了3 種重組蛋白——HR1、HR1S 和HR1LS。它們都可以形成穩(wěn)定的α螺旋三聚體，能與病毒的S2 亞基HR2 區(qū)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止病毒6-HB 的形成，從而抑制新冠病毒及其變異株以及其他β屬冠狀病毒的融合及入侵。其中，HR1LS 效果最優(yōu)。使用HR1LS 免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高滴度的中和抗體，可有效中和SARS-CoV-2 及其變異株（如Delta 和Omicron）和其他β屬冠狀病毒（如SARS-CoV、MERS-CoV 及相關(guān)蝙蝠病毒MjHKU4r-CoV-1），以 及α屬冠狀病毒（如HCoV-229E、HCoV-NL63）感染[64]。因此，HR1LS 三聚體具有開發(fā)成超廣譜冠狀病毒疫苗的潛力。

3.9 安全高效的佐劑

非特異性免疫增強(qiáng)劑簡(jiǎn)稱佐劑（adjuvant），是亞單位疫苗的重要組成部分[65]。佐劑與抗原共同或預(yù)先被注入體內(nèi)，能夠促進(jìn)強(qiáng)效而持久的免疫應(yīng)答。常見的佐劑有鋁佐劑、MF59、AS04、AS03、AS01、CpG1018 等。其中，鋁佐劑是世界上最早也是最廣泛使用的佐劑。其雖具有較高的安全性，但不易激活細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此在應(yīng)用上有局限性[66]。為提高亞單位疫苗效力，需要尋找能夠安全、有效促進(jìn)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的新型佐劑。

干擾素基因刺激因子（STING）通路激動(dòng)劑能夠激活STING，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（IFN-Ⅰ）反應(yīng)和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[67]。cGAMP是天然的STING 激動(dòng)劑[68]。2020年，筆者團(tuán)隊(duì)與哈佛醫(yī)學(xué)院Wu 教授團(tuán)隊(duì)合作，設(shè)計(jì)出一種基于cGAMP 的肺部仿生納米顆粒佐劑（PS-GAMP），它可有效促進(jìn)疫苗產(chǎn)生高效的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而保護(hù)免疫動(dòng)物抵抗多種異型流感病毒的攻擊[69]。2022年，團(tuán)隊(duì)篩選出新的小分子STING 激動(dòng)劑CF501，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于RBD-Fc 亞單位疫苗具有超強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效應(yīng)[70]。研究者將RBD-Fc/CF501 疫苗注射入小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其誘生的中和抗體滴度比RBD-Fc/鋁佐劑疫苗誘生的中和抗體滴度高出近20 倍。用RBD-Fc/CF501疫苗免疫猴子半年后，其抗血清對(duì)21 個(gè)SARS-CoV-2 變異株（包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron）、41 個(gè)天然變異株、SARS-CoV 及其變異株，以及多個(gè)蝙蝠SARSr-CoV（如WIV1、Rs3367、RsSHC014）都表現(xiàn)出強(qiáng)大的中和抗體反應(yīng)。同時(shí)，RBD-Fc/CF501 疫苗也能誘導(dǎo)高效的特異性T 細(xì)胞反應(yīng)，還能有效保護(hù)恒河猴免受新冠病毒的攻擊。這表明RBDFc/CF501 可被進(jìn)一步開發(fā)為泛沙貝冠狀病毒疫苗，用于防控新冠病毒變異株及將來新發(fā)與再現(xiàn)的SARS 相關(guān)傳染病的流行，這也驗(yàn)證了基于“以不變應(yīng)萬變”策略研發(fā)廣譜冠狀病毒疫苗的可行性。此后，團(tuán)隊(duì)又用重組蛋白HR1LS 與CF501 佐劑共同免疫小鼠，血清抗體滴度比HR1LS/鋁佐劑組高4 倍左右，進(jìn)一步證實(shí)了CF501 的強(qiáng)效佐劑效應(yīng)[64]。在基于病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)和優(yōu)化免疫原的同時(shí)，對(duì)佐劑進(jìn)行升級(jí)，探索“抗原+佐劑”的最佳組合，或許能夠起到“1+1＞2”的效果，提高“以不變應(yīng)萬變”策略研發(fā)廣譜疫苗的成功率。

4 總結(jié)與展望

21 世紀(jì)以來，全球共發(fā)生3次高致病性冠狀病毒疫情，分別由SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2 引起，它們均為β屬冠狀病毒。冠狀病毒傳染途徑多、傳播速度快、影響范圍廣，在短期內(nèi)即造成大規(guī)模流行，導(dǎo)致感染者出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀及全身癥狀，嚴(yán)重者發(fā)生呼吸困難、休克、甚至死亡。2019年年底暴發(fā)的新冠疫情，至今仍在全球范圍內(nèi)流行，截至2023年11月4日，感染病例數(shù)高達(dá)7.7 億，對(duì)人類健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定造成巨大威脅。冠狀病毒變異速度快、進(jìn)化分支龐大，疫苗開發(fā)的速度遠(yuǎn)趕不上病毒變異的速度，導(dǎo)致疫情蔓延不止。并且，新發(fā)與再現(xiàn)的冠狀病毒疫情還可能發(fā)生，亟須研發(fā)安全、高效的廣譜抗冠狀病毒疫苗，防“疫”于未然。

目前，已獲批上市或授權(quán)緊急使用的第一代新冠疫苗包括滅活疫苗、重組蛋白亞單位疫苗、病毒載體疫苗、mRNA 疫苗等多種類型，均表現(xiàn)出良好的安全性，在降低感染者重癥率和死亡率方面起到了關(guān)鍵作用。然而，第一代新冠疫苗存在中和免疫原性低、免疫效期短、廣譜性差等缺陷。筆者和其他團(tuán)隊(duì)在研發(fā)廣譜冠狀病毒疫苗的過程中注意到，新冠病毒S1 亞基RBD 功能區(qū)以及S2 亞基HR1、SH、FP 功能區(qū)中保守的抗原位點(diǎn)是重要的疫苗靶點(diǎn)。但同時(shí)，相關(guān)疫苗開發(fā)面臨著“廣譜不高效、高效不廣譜”的困境。如何同時(shí)實(shí)現(xiàn)廣譜和高效，是亟須解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。由此，筆者團(tuán)隊(duì)研發(fā)出了新型佐劑CF501，與先前設(shè)計(jì)合成的RBD-Fc、HR1LS 蛋白抗原聯(lián)用，分別得到RBD-Fc/CF501 和HR1LS/CF501 候 選疫苗。兩者在免疫動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度和T 細(xì)胞免疫強(qiáng)度均明顯高于RBD-Fc/鋁佐劑和HR1LS/鋁佐劑疫苗組，且更長效、更廣譜。其中，RBD-Fc/CF501 疫苗是第一個(gè)基于新型佐劑的高效廣譜泛沙貝冠狀病毒（中廣譜）候選疫苗，HR1LS/CF501 疫苗是第一個(gè)基于新型佐劑的廣譜泛β屬冠狀病毒（大廣譜）候選疫苗。兩款疫苗一旦開發(fā)上市，有望更有效地應(yīng)對(duì)當(dāng)前流行的新冠病毒變異株和未來新發(fā)或再現(xiàn)的冠狀病毒疫情。

新冠病毒變異株及其亞變體層出不窮，使得疫苗開發(fā)商不斷開發(fā)針對(duì)最新變異株的下一代疫苗，但部分人群在接種多劑“新疫苗”后仍頻發(fā)突破性感染。這一現(xiàn)象表明，使用“以變應(yīng)變”的策略開發(fā)疫苗總是處于被動(dòng)狀態(tài)，難以建立起堅(jiān)固、持久的廣譜免疫屏障，這更加凸顯出研發(fā)高效、廣譜抗冠狀病毒疫苗的必要性。筆者團(tuán)隊(duì)始終堅(jiān)持“以不變應(yīng)萬變”的策略，致力于尋找更加保守的抗原表位，通過結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使其充分暴露，并添加新型高效佐劑來提高疫苗的免疫原性及廣譜性。這些高效、長效、廣譜冠狀病毒疫苗如能開發(fā)上市，不僅是遏制當(dāng)前新冠疫情的利器，更將成為預(yù)防未來冠狀病毒感染的堅(jiān)硬盾牌。