D?半乳糖誘導(dǎo)小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞衰老模型的建立*

張 鑫，黎 靜，魯 晴，黃華生，林毓君，唐春女，潘璐璐，莫書榮（廣西醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣西南寧 530021）

隨著我國人口數(shù)量的不斷增加，人口老齡化問題逐漸突出，因此衰老性疾病和亞健康的衰老性疾病等隨之而來?？顾ダ涎芯考叭绾晤A(yù)防和延緩年齡相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展將有利于提高人們的生活質(zhì)量，減少其家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已逐漸成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。衰老最先表現(xiàn)為皮膚衰老，皮膚是人體最大的器官，由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，其中真皮為皮膚提供各種營養(yǎng)物質(zhì)，成纖維細(xì)胞是真皮的主要細(xì)胞組成，維系著皮膚正常的生理結(jié)構(gòu)和功能[1]。衰老的皮膚在結(jié)構(gòu)和功能上將發(fā)生改變[2-3]。因此，皮膚成纖維細(xì)胞衰老模型在研究衰老機(jī)制、表現(xiàn)及篩選延緩衰老藥物起著重要作用。本研究旨在建立成纖維細(xì)胞（MSF）衰老模型，為開展皮膚衰老及老年相關(guān)疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取5～7 d昆明乳鼠，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、Ⅰ型膠原酶（美國Invitrogen公司）、β-半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色試劑盒（上海碧云天公司）、鼠抗Vimentin單克隆抗體（武漢博士德公司）、鼠抗Sirt1單克隆抗體（SANTA CRUZ公司）、逆轉(zhuǎn)試劑盒（Thermo公司）、液體DAB酶底物顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。4，6-二脒基-苯基吲哚（DAPI）（Solarbio公司）

1.2 方法

1.2.1 MSF的培養(yǎng) 取5～7 d的昆明乳鼠，用75%乙醇浸泡消毒30 min，用消毒過的手術(shù)剪分離乳鼠的背部皮膚5 cm×3 cm，將分離下來的皮膚置于10 cm的培養(yǎng)皿中，用含1%青霉素-鏈霉素的去離水磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗 2次，吸凈DPBS，去除血管脂肪，用手術(shù)剪將皮膚組織剪碎并將組織碎塊轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi)，然后加入10 mL的0.1%Ⅰ型膠原酶（無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基），并吹打使得皮膚組織碎塊分散，將離心管放入到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化90 min，并且每隔30 min振蕩搖晃離心管1 min。消化完后離心機(jī)以1 500 r∕min速率離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM清洗2次，以1 000 r∕min離心速率離心3 min，棄上清，再用含15%胎牛血清的高糖DMEM重懸組織塊并用70 μm的濾篩過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，并放入二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2 MSF的鑒定 采用形態(tài)學(xué)觀察法觀察MSF的形態(tài)特征；Vimentin蛋白采用細(xì)胞免疫組化法分析MSF，具體方法如下，將培養(yǎng)板中長好MSF的玻片用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS清洗3次；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；加滴一抗波形蛋白抗體。用PBS清洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗，PBS沖洗。滴加鏈親和素-過氧化酶溶液孵育。DAB顯色，用蘇木素復(fù)染，用中性樹膠封固，在顯微鏡下采集圖像。

1.2.3 D-半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老 將生長狀態(tài)良好的MSF接種于6孔板，用高糖DMEM培養(yǎng)基、37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合70%～80%，給予含有不同濃度 D-半乳糖（10、20、30 g∕L）的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、24、48 h。

1.2.4 β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn) 按照β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，具體方法如下：吸棄舊的培養(yǎng)基，用DPBS清洗1次，加入1 mL染色固定液，室溫固定15 min；吸棄固定液，用DPBS清洗3次，每次3 min；吸棄DPBS，每孔加入1 mL染色工作液，用保鮮膜蓋住6孔板，然后放置于37℃恒溫箱中孵育過夜。甘油封閉鏡下觀察，各組隨機(jī)計數(shù)400個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞率（%）。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測p53基因表達(dá) D-半乳糖（20 g∕L）分別誘導(dǎo) MSF 0、24、48 h，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行RT-PCR，采用熒光定量染料法檢測p53 mRNA表達(dá)水平（上游引物：AGTCCTTTGCCCTGAACTGC，下游引物：GCGGATCTT GAGGGTGAAAT），每個樣本重復(fù)測量3次，以GAPDH（上游引物：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，下游引物：AGCCTTCTCCA TGGTGGTGAAGAC）為內(nèi)參參照標(biāo)準(zhǔn)，按照2－△△Ct計算p53基因相對表達(dá)量。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光觀察Sirt1基因在MSF中的表達(dá) D-半乳糖（20 g∕L）分別誘導(dǎo) MSF 0、48 h，將培養(yǎng)板中爬好MSF的玻片用PBS清洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定爬片15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；用PBS清洗3次，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，并滴入足量稀釋好的一抗小鼠單克隆抗體Sirt1，放入濕盒，在4℃孵育過夜；用PBST浸洗爬片3次，并吸干液體，滴入稀釋好的熒光二抗，黑暗條件下20～37℃濕盒孵育1 h，PBST洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBST清洗；用含抗熒光淬滅劑的封片液封閉，在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計量資料以表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察MSF形態(tài)學(xué)變化 光鏡下可見細(xì)胞胞體較大，胞核較大呈橢圓形，染色質(zhì)疏松著色淺，核仁明顯，為多突的梭形或星形的扁平細(xì)胞，具有突起，符合皮膚MSF的形態(tài)學(xué)特征。見圖1。

圖1 原代成纖維細(xì)胞形態(tài)及鑒定（4×）

2.2 Vimentin蛋白免疫組織化學(xué)分析 Vimentin蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)細(xì)胞中Vimentin蛋白呈陽性表達(dá)。見圖2。

圖2 MSF Vimentin蛋白免疫組化分析（4×）

2.3 β-半乳糖苷酶染色分析 β-半乳糖苷酶染色后，衰老細(xì)胞呈藍(lán)色，陰性細(xì)胞無著色。不同濃度D-半乳糖誘導(dǎo)MSF 0、24、48 h后，陽性細(xì)胞的百分比均顯著高于0 g∕L，并且呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性。見圖3、4。

圖3 不同濃度D-半乳糖誘導(dǎo)MSF后β-半乳糖苷酶染色情況（100×）

圖4 不同濃度D-半乳糖誘導(dǎo)MSF后β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)分析

2.4 p53基因表達(dá)水平檢測 D-半乳糖誘導(dǎo)24、48 h后MSF p53 mRNA表達(dá)較0 h時表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 D-半乳糖誘導(dǎo)衰老后MSF中p53基因表達(dá)變化情況

2.5 Sirt1細(xì)胞免疫熒光檢測 細(xì)胞免疫熒光分析細(xì)胞Sirt1蛋白表達(dá)，Sirt1標(biāo)記為綠色，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，融合后，發(fā)生重疊，Sirt1主要表達(dá)在細(xì)胞核，但是D-半乳糖誘導(dǎo)48 h后Sirt1的表達(dá)明顯降低。見圖6。

圖6 皮膚MSF Sirt1免疫熒光染色結(jié)果（200×）

3 討 論

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞在執(zhí)行生命活動過程中隨著時間的推移，細(xì)胞增殖分化能力和生理功能逐漸發(fā)生衰退的變化過程，是正常細(xì)胞的必然歸宿[4]。衰老細(xì)胞雖然仍保留一些細(xì)胞的基本代謝活性，但在細(xì)胞形態(tài)和功能上都已發(fā)生了很多根本性的改變。例如，細(xì)胞皺縮，膜通透性、脆性增加，核膜內(nèi)折，細(xì)胞器數(shù)量減少，胞內(nèi)出現(xiàn)脂褐素等異常物質(zhì)沉積。衰老細(xì)胞同樣擁有一些共同特點(diǎn)，主要表現(xiàn)在細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯、β-半乳糖苷酶活性增高等細(xì)胞功能的一系列變化[5]。目前，有研究表明，D-半乳糖所致衰老與自然衰老變化相似[6]。D-半乳糖是體內(nèi)正常的營養(yǎng)成分，能夠通過轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵瑓⑴c正常能量的代謝，如果D-半乳糖攝入過量則會導(dǎo)致機(jī)體多器官功能代謝紊亂，甚至產(chǎn)生對基因的表達(dá)和調(diào)控情況[7]。D-半乳糖使機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，抗氧化能力減弱，脂質(zhì)水平增加，從而導(dǎo)致機(jī)體引起亞急性衰老[8]。D-半乳糖衰老模型的涉及領(lǐng)域較廣，不僅涵蓋器官、組織和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，還在信號通路的蛋白基因水平上均有研究[9]，已成為研究衰老的經(jīng)典細(xì)胞模型。

p53基因是一種與細(xì)胞生長、凋亡、衰老和DNA修復(fù)相關(guān)的重要基因。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制p53基因的表達(dá)可以減少皮膚細(xì)胞的凋亡，并且延緩皮膚的衰老[10-12]。Sirt1基因是酵母長壽基因Sirt2的同源基因，參與了基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝及細(xì)胞衰老等生理功能調(diào)節(jié)，Sirt1通過與蛋白的相互作用可抑制p53基因表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，從而發(fā)揮對基因的調(diào)控作用[13]。在衰老過程中，Sirt1表達(dá)水平的降低可以增強(qiáng)p53的表達(dá)，從而加速細(xì)胞的凋亡和衰老[14]。

在衰老過程中，MSF的功能、形態(tài)和增殖潛力等方面發(fā)生了顯著變化，并對皮膚的功能及穩(wěn)態(tài)具有重要影響[15]。本研究采用Ⅰ型膠原酶消化法原代分離獲得MSF，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈紡錘形或星形的扁平細(xì)胞，符合皮膚成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。同時，原代培養(yǎng)細(xì)胞中Vimentin蛋白呈陽性表達(dá)，進(jìn)一步提示原代分離培養(yǎng)的細(xì)胞為MSF。本研究通過D-半乳糖法建立細(xì)胞衰老模型，結(jié)果表明，D-半乳糖作用MSF后，可使MSF β-半乳糖苷酶陽性染色細(xì)胞數(shù)量明顯增多、p53基因表達(dá)增強(qiáng)、Sirt1基因表達(dá)降低等細(xì)胞衰老的相關(guān)表現(xiàn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過Ⅰ型膠原酶消化法建立了MSF培養(yǎng)方法，并通過D-半乳糖誘導(dǎo)法建立了MSF衰老模型，為開展皮膚衰老及老年相關(guān)疾病的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。