中醫(yī)藥治療在4-乙烯基環(huán)己烯二環(huán)氧化物誘導圍絕經期動物模型相關疾病中的應用※

陳穎棋 劉保君 宓軼群 徐世芬 李珊珊△

(1.上海中醫(yī)藥大學針灸推拿學院2021級博士研究生，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，上海 200071)

圍絕經期是每位女性生殖衰老的必經階段，自生育期的規(guī)律月經逐漸過渡到永久性無月經即絕經狀態(tài)[1]。圍絕經期的本質是卵巢功能衰竭，卵巢內儲備的始基卵泡減少到閾值以下，進而生殖激素水平波動變化，并表現(xiàn)為月經紊亂、生育能力下降、潮熱、情緒不穩(wěn)定、睡眠障礙等絕經的一系列臨床癥狀，患各種慢性疾病的風險逐漸升高[2]。圍絕經期綜合征癥狀可遷延數(shù)年，給患者生活和工作造成極大的困擾，嚴重危害女性的身心健康，對圍絕經期相關疾病的研究成為社會發(fā)展的迫切需要[3]。

合適的圍絕經期動物模型是開展圍絕經期綜合征及遠期疾病相關研究的重要前提。根據(jù)不同的動物造模方法可大致分為自然老化的病因模型，摘除或部分摘除卵巢(去勢)和酒精損傷卵巢的病理模型，以及去勢后加以藥物或施以行為致動物出現(xiàn)某種特定的圍絕經期綜合征癥狀的病癥結合模型[4]，其中，4-乙烯基環(huán)己烯二環(huán)氧化物(VCD)誘導的卵巢早衰(POF)動物模型與人類生殖內分泌和組織學變化更為相似。此外，還有射線療法損傷卵巢模型、藥物誘導模型和免疫模型等應用相對較少的圍絕經期動物模型[5]，這些造模方法側重不同的病因學，僅適用于某些實驗研究，具有一定的局限性。VCD給藥模擬卵巢衰竭模型副作用小、給藥方便、經濟高效，保留卵巢組織的完整性，更符合人類從絕經前期到圍絕經期，再到絕經后的過程，因此成為目前較為理想的圍絕經期動物模型[5-8]，并得到了廣泛的應用。本文針對VCD動物模型的構建與應用及對中藥治療VCD圍絕經期動物模型相關疾病的進展進行詳細闡述，以期為圍絕經期動物實驗研究提供理論支持與參考依據(jù)。

1 VCD誘導卵巢衰竭模型的構建

VCD是工業(yè)化合物4-乙烯-1-環(huán)己烯(VCH)的環(huán)氧代謝物，通常作為汽車輪胎、殺蟲劑、增塑劑和阻燃劑等化學合成物的副產物被釋放到環(huán)境中，可對人體造成健康危害[9-11]。VCD最早在1994年被列入第七次致癌物質年度報告名單中，證實其對嚙齒類動物(大鼠和小鼠)有致癌性，可引起雌性小鼠的卵巢腫瘤[12]。VCD是VCH卵毒性的主要活性形式[11,13]，體內和體外實驗表明VCD可能是通過增加凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤-2- 細胞死亡拮抗蛋白(Bad)的表達及Bax/B細胞淋巴瘤-長亞型蛋白(Bcl-xl)在線粒體膜上的比例，誘導細胞色素C(Cyt C)從線粒體向細胞質擴散，放大凋亡信號，激活并增加半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表達和活性，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應，進而加速竇前小卵泡閉鎖(凋亡)[14-16]。

VCD誘導加速卵巢衰竭模型可以選擇成年、青春期或老年雌性小鼠或大鼠作為造模的動物，主要品系有C57BL/6、SD、B6C3F1和Fischer 344[8,17-19]。VCD誘導圍絕經期動物模型的成功構建與給藥途徑、劑量及持續(xù)時間密切相關，通常以玉米油或芝麻油作為VCD的溶劑，采用皮下或腹腔注射中高劑量濃度(80 mg/kg或160 mg/kg)的VCD進行連續(xù)(15天)給藥，給藥結束后30天內是研究卵泡變化及給予干預措施的窗口期，30～60天是研究圍絕經期相關器官疾病的最佳時期[20-22]。

2 VCD誘導圍絕經期相關疾病動物模型的應用

2.1 心血管疾病 雌激素有助于調節(jié)脂質代謝，降低血液黏稠度，保護血管內皮細胞，抑制炎癥因子的釋放，在預防心血管疾病中發(fā)揮重要作用[23]。圍絕經期女性體內雌激素水平降低，增加了患心血管疾病的風險。

VCD誘導卵巢衰竭模型能模擬從圍絕經期逐漸過渡到絕經期體內性激素的生理變化，同時把生殖衰老和年齡因素獨立開來，可以在任何起點對老鼠進行VCD干預，是研究圍絕經期心血管疾病易感性合適的臨床前嚙齒動物模型[24]。Fernandes R[25]發(fā)現(xiàn)給雌性小鼠注射VCD后，小鼠在第60天和第120天時表現(xiàn)出發(fā)情周期中斷和無發(fā)情周期，這種逐漸過渡到圍絕經期狀態(tài)模擬了體內激素環(huán)境的生理變化，避免了使用去勢模型出現(xiàn)的雌激素突然喪失對研究圍絕經期過渡到絕經期階段心臟功能變化的影響，包括心肌細胞分子和雌激素受體調節(jié)的變化。

2.2 絕經后骨質疏松 雌激素參與人體的骨代謝，調節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活動，絕經后雌激素缺乏會抑制骨的形成，造成骨丟失與骨強度降低[26]，進而演變成骨質疏松。與其他絕經后骨質疏松模型相比，VCD誘導的卵巢衰竭模型更符合人類自然絕經后骨質疏松情況。

Wright L E等[27]將小鼠去勢模型與VCD誘導模型對骨骼的影響進行比較發(fā)現(xiàn)，雖然兩種造模方法均可導致骨質疏松，但VCD模型組較去勢模型組骨丟失緩慢，且血漿中的雄烯二酮水平明顯高于去勢模型小鼠，因此，他們認為雄烯二酮是骨質丟失較慢的主要原因。Lukefahr A L等[28]在保留完整下丘腦-垂體-卵巢軸的前提下，利用VCD誘導SD雌性大鼠，觀察圍絕經期激素變化與骨密度之間的關系，結果顯示卵泡刺激素(FSH)、抑制素A的水平與骨密度損失關系密切，其中抑制素A最可能是介導骨丟失過程的關鍵激素。Kalam A等[29]通過VCD誘導瑞士品系白化雌性小鼠絕經的模型證明，抗骨質疏松藥物雷洛昔芬可以預防和減輕絕經后乳腺癌治療藥物來曲唑引起的骨質流失。

2.3 圍絕經期動脈粥樣硬化 研究表明，雌激素-去乙?；?SIRT1)-內皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路在卵巢衰竭引起的動脈老化與動脈粥樣硬化方面發(fā)揮關鍵作用[30-31]。圍絕經期女性體內雌激素水平降低，可導致血管舒縮功能失調和血脂調節(jié)作用下降，以及脂質在大中血管內膜沉積，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。VCD誘導的卵泡耗竭模型與卵巢切除模型(OVX)聯(lián)合用于低密度脂蛋白受體缺陷(LDLR-/-)小鼠的動脈粥樣硬化研究發(fā)現(xiàn)，在給予高膽固醇飲食120天后再給予外源性雌二醇(E2)處理，結果顯示VCD+E2組無名動脈和主動脈動脈的粥樣硬化病變區(qū)面積均小于OVX+E2組，說明在動脈粥樣硬化病變發(fā)展過程中，卵巢的內分泌狀態(tài)會影響外源性E2的效應[32]，而VCD模型給研究圍絕經期卵巢功能狀態(tài)與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展這兩者之間的關系提供了機會。

2.4 圍絕經期阿爾茲海默病(AD) 內源性雌激素受體α(ERα)和受體β(ERβ)分布在下丘腦、杏仁核及腦海馬、皮層和嗅葉中，均與認知功能相關[33]。研究表明，E2水平缺乏會導致淀粉樣蛋白β(Aβ)和大腦皮質中淀粉樣前體蛋白(APP)的升高，繼而失去神經保護作用，圍絕經期雌激素與雌激素受體反應網(wǎng)絡的廣泛波動變化是增加女性大腦對AD易感性的基礎。有學者認為，低劑量VCD誘導的加速卵巢功能衰竭(AOF)模型不會對除了卵巢以外的器官及組織產生影響，也不會透過血腦屏障[34]。因此，利用該模型驗證圍絕經期對AD影響的關鍵分子機制、激素替代療法的臨床療效以及前期從OVX模型得出的結果具有重要意義[35]。Golub M S等[36]首次成功使用VCD在APPswe2576轉基因小鼠中誘導卵巢萎縮，并用野生型(WT)鼠作為對照縱向研究AD認知功能，由于這些小鼠的存活率低(30%)，因此無法有效評估雌激素對水迷宮結果的影響，也未發(fā)現(xiàn)有卵巢萎縮或雌激素治療的影響。

2.5 其他圍絕經期繼發(fā)疾病 國內學者主要把VCD模型用于研究早發(fā)性卵巢功能不全，國外學者還將VCD模型運用到腫瘤[37-38]、糖尿病腎病[39]、絕經后癲癇[40]等研究中，都顯示VCD模型造模成功。

3 VCD誘導圍絕經期動物模型在中醫(yī)藥治療的應用

3.1 中藥治療VCD誘導的圍絕經期動物模型相關疾病 Zhao F等[41]利用不同濃度更年春方(GNC)湯劑給VCD雌性SD大鼠灌胃30天后發(fā)現(xiàn)，高劑量GNC組顯著增加了VCD大鼠的卵巢指數(shù)，并維持原始卵泡和初級卵泡的數(shù)量，顯著增加卵巢蛋白激酶B(Akt)磷酸化和下游FOXO3a的表達，促凋亡蛋白表達顯著降低，說明GNC可以通過激活Akt信號通路和減少細胞凋亡來保護卵巢儲備而免受VCD誘導產生的卵毒性。Li M等[42]證明了護陽養(yǎng)坤方(HYYKF)聯(lián)合胚胎干細胞移植的方法可通過抑制轉化生子因子β1(TGF-β1)/TGF-β活化激酶1(TAK1)通路的表達促進卵泡發(fā)育，進而改善VCD誘導的POF小鼠的卵巢功能，療效優(yōu)于單獨使用HYYKF或胚胎干細胞移植。Nam E Y等[43]采用VCD體外誘導中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)和人類卵巢顆粒腫瘤細胞(COV434)制備細胞毒性模型，證實了吳茱萸提取物可通過激活Akt相關通路拮抗VCD的卵毒性，有助于預防POF或環(huán)境因素引起的原因不明的不孕癥。Kim D等[44]研究顯示，包含菟絲子、續(xù)斷和吳茱萸的湯藥(STH-KP17001)STH-KP17001可改善VCD誘導AOF模型引起的抑郁和焦慮行為，穩(wěn)定小鼠的皮質醇水平，并恢復小鼠額葉皮層中腦源性神經營養(yǎng)因子的表達。Wang Y等[45]通過12周齡ICR雌性小鼠VCD模型證實，杏仁核基底外側復合體(BLA)中5-羥色胺受體1A(5-HT1Ar)等下調導致5-HT缺乏是焦慮行為形成的原因，而E2改善圍絕經期和絕經后焦慮可能是通過促進5-HT實現(xiàn)的。VCD對卵巢高度的選擇性則有利于圍絕經期焦慮、抑郁相關研究中中樞及外周機制相關指標的觀察，進而得出更可靠的結果。

雌激素作為女性體內一種重要的激素，參與了全身的糖脂代謝，在預防心血管疾病、糖尿病及高血壓等方面發(fā)揮重要作用。Xing X等[46]利用高脂飲食喂養(yǎng)VCD給藥的Wistar大鼠誘導圍絕經期高血脂癥，研究中藥復方丹知青娥方(DZQE)對圍絕經期脂質代謝的影響，經過給大鼠不同濃度的DZQE灌胃給藥8周后發(fā)現(xiàn)，DZQE組血清E2、睪酮(T)濃度升高，F(xiàn)SH、黃體生成激素(LH)濃度降低；血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度降低，表明DZQE可以改善圍絕經期的卵巢功能和脂質代謝。相比于高脂飲食大鼠，單純VCD注射大鼠體內的游離脂肪酸和TC明顯增加[47]，證明卵巢功能減退加速了代謝綜合征的發(fā)生和發(fā)展，可見VCD模型是研究圍絕經期繼發(fā)代謝綜合征的理想動物模型。

中藥本身不是激素，但是具有類激素的作用。中藥與激素替代療法聯(lián)合治療POF不僅可以提高臨床有效率，還可以降低激素治療引起的各種不良反應的發(fā)生率，長期療效明顯，具有較高的臨床應用價值[48]。

3.2 針灸治療VCD誘導的圍絕經期動物模型相關疾病 針灸治療VCD誘導的POF研究報道較少，有效證據(jù)不足。有學者對電針治療POF進行病例序列研究給出初步探索性結果，認為電針療法在恢復POF患者的月經周期、調整和改善患者激素水平方面具有較大的潛力[49]。王偉明等[50]采用VCD誘導POF大鼠模型，采用低頻電針刺激中髎穴和天樞穴，結果顯示可以抑制卵巢組織胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)mRNA的表達，進而改善卵巢功能。其他利用穴位埋線或手針的方法治療雷公藤多苷和環(huán)磷酰胺誘導的POF模型研究結果顯示，對改善POF鼠的激素水平和發(fā)情周期效果良好[51-52]。

4 結語

VCD是一種具有卵毒性的工業(yè)化合物，體外細胞培養(yǎng)試驗或實驗鼠體內實驗均已證明VCD可以特異性殺死原始卵泡和初級卵泡，破壞卵巢儲備并導致POF。VCD存在顯著的劑量依賴性，大劑量連續(xù)給藥對卵巢的破壞程度嚴重，給關于圍絕經期綜合征癥狀表現(xiàn)、激素水平變化與卵巢衰竭程度關系的研究提供良好條件。VCD模型雌激素水平有明顯的劑量和時間效應，故此模型的另一個優(yōu)點是允許縱向研究激素水平與衰老之間的關系而不受動物年齡的影響。此外，VCD不會對除了卵巢以外的器官和組織產生明顯的毒性作用，同時該模型還保存完整的卵巢組織，高度模擬了人類圍絕經期階段激素水平的變化情況及圍絕經期綜合征癥狀如焦慮、抑郁、潮熱等，是探索圍絕經期繼發(fā)的慢性疾病如冠心病、高血壓和糖尿病腎病等發(fā)病機制的優(yōu)勢模型。

VCD模型可變的窗口期和VCD效應的劑量依賴性表明，這種造模方法相比其他獲得性POF鼠的模型更具優(yōu)勢。現(xiàn)代技術可以跟蹤卵巢和激素水平的逐漸變化，并將卵巢的變化與其他組織器官聯(lián)系起來。故VCD誘導的模型不僅可以研究POF的疾病狀態(tài)，還可以研究圍絕經期生理變化及相關并發(fā)癥。雖然造模周期相對較長，但眾多文獻實踐證明VCD誘導POF模型具有穩(wěn)定性好、成功率高、安全有效的優(yōu)點，可以作為探索一系列中醫(yī)藥治療臨床前生殖疾病的手段而被廣泛應用。