間充質(zhì)干細(xì)胞來源的胞外囊泡在急性肺損傷治療中的研究進(jìn)展

侯勇哲 張琴 趙霄晨 何苗 魚玲玲， 白海 吳濤

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（蘭州730030）；2中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第940 醫(yī)院全軍血液病中心（蘭州730050）；3甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點實驗室（蘭州730050）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由多種因素引起的肺部損傷并伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥、呼吸困難等［1］。近年來，ALI被重新定義為輕度或中度的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），ARDS是由ALI 發(fā)展而來的復(fù)雜的級聯(lián)過程［2］。誤吸、肺挫傷、外傷和急性胰腺炎等多種因素均可引起ALI。發(fā)生ALI 時，患者肺泡毛細(xì)血管屏障遭到破壞，肺屏障通透性增加及肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，最終發(fā)展為ARDS［3］。ALI/ARDS 病死率高達(dá)46%，針對ALI 的臨床治療主要采用機械通氣等支持療法暫時改善通氣、緩解ALI 的相關(guān)癥狀［3-4］，尚無ALI/ARDS 特效治療方案［5］。

干細(xì)胞是未分化的前體細(xì)胞，具有自我更新能力和分化為多譜系細(xì)胞的能力［6］，可以緩解ALI的病理狀態(tài)且能控制ALI 癥狀［7］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一組來自骨髓、脂肪和臍帶等組織，具有自我更新、多向分化和促進(jìn)組織修復(fù)的成體干細(xì)胞［8］。目前，MSCs 在血液疾病、自身免疫性疾病和新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）等疾病的治療方面顯示出一定潛力［9］。而MSCs 來源的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）具有高穩(wěn)定性，比MSCs 細(xì)胞療法更安全且易于儲存，是替代MSCs的無細(xì)胞治療方法［10］?，F(xiàn)對MSC-EVs 的分類和生物學(xué)特性、MSC-EVs 治療ALI 的機制和臨床試驗的最新進(jìn)展以及MSC-EVs 治療ALI 的挑戰(zhàn)作一綜述，以期為MSC-EVs 在ALI 中的治療應(yīng)用提供新的思路。

1 MSC-EVs 的分類和生物學(xué)特性

MSCs 的免疫調(diào)節(jié)和再生作用部分是通過其釋放的EVs 來實現(xiàn)的［11］。EVs 是一組異質(zhì)性膜結(jié)合囊泡，根據(jù)直徑的大小，主要分為三個亞群［12］：（1）直徑在50 nm 到150 nm 的外泌體（exosomes，EXOs）是EVs 中數(shù)量最多的一種亞型，在多泡體（multivesicular body，MVB）與細(xì)胞膜表面融合時，通過胞吐作用釋放到細(xì)胞外；（2）直徑在100 nm到1 000 nm 的微小囊泡（microvesicles，MVs）在不同細(xì)胞類型的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，以質(zhì)膜向外出芽的方式形成；（3）直徑在1 000 nm 到5 000 nm 的凋亡小體（apoptotic bodies，ABs）包含細(xì)胞器和非編碼RNA，可能傳遞某些遺傳信息，是細(xì)胞凋亡時釋放的異質(zhì)性囊泡［13-14］。MSC-EVs 作為一種高效的運輸載體，含有多種蛋白、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)［12］，其主要特征是：（1）不能進(jìn)行細(xì)胞增殖；（2）不表達(dá)HLA-I 和HLA-II 抗原，沒有免疫反應(yīng)風(fēng)險；（3）體積小，可以通過小毛細(xì)血管；（4）可以在負(fù)80 ℃下未使用二甲基亞砜儲存時仍可保持生物活性［15］。目前研究表明，MSC-EVs 具有抗炎抗凋亡、修復(fù)組織細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能，在ALI 的治療中具有良好的應(yīng)用前景［16］。

2 MSC-EVs 治療ALI 的機制

盡管圍繞MSCs 在ALI 中的治療作用已經(jīng)存在較多研究，但關(guān)于MSC-EVs 在ALI 中的作用機制卻未明確［17］。ALI 的發(fā)病機制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為MSC-EVs 通過攜帶的內(nèi)容物發(fā)揮對ALI 的治療作用。MSC-EVs 通過與靶細(xì)胞膜上的受體相互結(jié)合并融入細(xì)胞膜或被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而釋放其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)移生物活性物質(zhì)如RNA 和蛋白質(zhì)等［18］。

2.1 MSC-EVs 通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞治療ALI 的機制ALI 常伴嚴(yán)重的肺泡毛細(xì)血管損傷，研究證明MSC-EVs 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為抗炎作用較強的M2 樣表型，有助于炎癥消退和組織修復(fù)［19］。

PHINNEY 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 通過轉(zhuǎn)移miRNA 來調(diào)節(jié)Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）的表達(dá)，使巨噬細(xì)胞耐受去極化的線粒體轉(zhuǎn)移，從而起到保護巨噬細(xì)胞作用。MORRISON 等［21］發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 可通過轉(zhuǎn)移線粒體促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1 表型（分泌促炎因子）變?yōu)镸2 表型（分泌抗炎因子），繼而調(diào)節(jié)ARDS 小鼠模型中的巨噬細(xì)胞，且經(jīng)過MSC-EVs 預(yù)處理的肺泡巨噬細(xì)胞可減少小鼠炎癥表現(xiàn)，對肺損傷具有保護作用。VARKOUHI 等［22］發(fā)現(xiàn)，相比初始MSC-EVs，經(jīng)干擾素γ培養(yǎng)的人臍帶來源的MSC-EVs 可以更有效地減輕了大腸桿菌誘導(dǎo)的ALI，該作用可能是通過增強巨噬細(xì)胞吞噬作用和巨噬細(xì)胞對大腸桿菌的殺傷能力來介導(dǎo)的。趙瑞婧等［23］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 對ALI 的抗氧化和抗炎作用是因為MSC 來源的EXOs（MSC-EXOs）可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)變，該作用主要通過其對Nrf2/Keap1/ARE 信號通路及TLR4/NF-κB 信號通路的調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮作用。HUANG 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，年輕個體來源的MSC-EVs在ALI 小鼠模型中表現(xiàn)出保護作用，而老年個體來源的MSC-EVs 沒有表現(xiàn)出保護作用，認(rèn)為年輕和老年個體來源的MSC-EVs 攜帶的與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的幾種miRNA 水平存在差異。此外，老年個體來源的MSC-EVs 不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)變及減少體內(nèi)巨噬細(xì)胞募集。

2.2 MSC-EVs 通過miRNA 治療ALI 的機制在ALI 的肺泡腔中存在大量中性粒細(xì)胞，使肺細(xì)胞受到損害，而MSC-EVs 具有修復(fù)肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的潛力［12］。ALI 可導(dǎo)致肺部過度炎癥和肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cells，AEC）凋亡并最終導(dǎo)致肺纖維化。MSC-EVs 可分泌miRNA，從而達(dá)到對ALI 的治療保護作用。

在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)ALI小鼠模型中，MSC-EVs 將miR-27a-3p 轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞極化，減輕了ALI 的癥狀［25］；YI 等［26］證實MSCs-EXOs 分泌的miR-30b-3p抑制了AEC 中血清淀粉樣蛋白A3 的表達(dá)，促進(jìn)AEC 的增殖并抑制其凋亡，從而對ALI 提供保護作用；XIAO 等［27］發(fā)現(xiàn)MSC-EXOs 可傳遞miRNA（miR-23a-3p 和miR-182-5p）到小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12，進(jìn)而通過抑制Ikbkb 和失活I(lǐng)KKβ 以阻礙NF-κB 和hedgehog 信號通路，從而逆轉(zhuǎn)經(jīng)過LPS 處理的MLE-12 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程；WEI 等［28］發(fā)現(xiàn)MSCs-EXOs 釋放的miR-377-3p 通過靶向mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬以減輕ALI 炎癥反應(yīng)。LIU等［29］研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的MSCs-EVs 將miR-384-5p 轉(zhuǎn)移到肺泡巨噬細(xì)胞中，進(jìn)而下調(diào)Beclin-1 來恢復(fù)肺泡巨噬細(xì)胞的自噬反應(yīng)障礙。此外，CHEN等［30］研究發(fā)現(xiàn)，MSC 來源的MVs（MSC-MVs）含有大量的miR-100，miR-100 可以通過恢復(fù)mTOR 信號增強自噬從而抑制博來霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)的大鼠ALI 模型的細(xì)胞損傷和肺纖維化，改善了ALI 的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。綜上，MSC-EVs可通過攜帶miRNA 參與細(xì)胞內(nèi)通信和物質(zhì)運輸，可能對靶細(xì)胞具有炎癥和免疫調(diào)節(jié)能力，從而為ALI 帶來治療價值。

2.3 MSC-EVs 通過細(xì)胞因子治療ALI 的機制ALI 中的促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平升高，MSCEVs 可降低促炎細(xì)胞因子水平并對肺細(xì)胞具有保護作用［31］。

CHEN 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-MVs 可通過肝細(xì)胞生長因子的遞送激活PI3K/AKT/mTOR 通路，逆轉(zhuǎn)肺組織的細(xì)胞凋亡和纖維化，繼而對BLM 誘導(dǎo)的小鼠ALI 發(fā)揮治療作用。TANG 等［33］發(fā)現(xiàn)，MSC-MVs 含有大量的血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）mRNA，在LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠模型氣管中給予MSC-MVs 后，肺泡中Ang-1 蛋白的表達(dá)上調(diào)，使促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌被抑制而抗炎細(xì)胞因子白介素10（interleukin-2，IL-10）的分泌增多，進(jìn)而改善了肺部炎癥并恢復(fù)了肺毛細(xì)血管通透性；然而給予缺乏Ang-1 mRNA 的MSC-EVs卻導(dǎo)致支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞流入量和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2 水平分別增加了136%和105%，肺部炎癥惡化及肺毛細(xì)血管通透性恢復(fù)失敗，提示MSC-EVs可以通過Ang-1 mRNA 對ALI 產(chǎn)生治療作用。此外，MORRISON 等［34］也發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 顯著降低了促炎細(xì)胞因子TNF-a 和IL-8 的產(chǎn)生。由此可見，MSC-EVs 對ALI 的治療具有一定的潛力，但EVs 的載物和功效具有多樣性，需要進(jìn)一步研究EVs 的哪些組成部分發(fā)揮了治療作用，以更好地利用EVs。

2.4 MSC-EVs通過線粒體轉(zhuǎn)移治療ALI的機制ALI 涉及線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡機制，MSC-EVs中攜帶的線粒體可以轉(zhuǎn)移到AEC，從而減輕氧化應(yīng)激損傷和減少肺上皮細(xì)胞損傷［35］。

PHINNEY 等研究發(fā)現(xiàn)，MSC-MVs 中的線粒體轉(zhuǎn)移到ALI 肺組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞，增強了巨噬細(xì)胞的吞噬功能［20］。此外，在LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI 模型中，ISLAM 等［36］首次發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 來源的線粒體轉(zhuǎn)移到AEC 后，可為受損細(xì)胞“提供”新鮮的線粒體，從而增強細(xì)胞生物能量學(xué)并介導(dǎo)AEC 的ATP 生成；MORRISON 等［21］也發(fā)現(xiàn)，EVs 轉(zhuǎn)移的功能性線粒體可引起小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化水平增高，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的抗炎和吞噬作用增強并減輕ALI 損傷；SILVA 等［37］最新研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 通過將線粒體嵌入內(nèi)源性線粒體網(wǎng)絡(luò)來恢復(fù)線粒體功能和線粒體呼吸，從而改善肺泡-毛細(xì)血管屏障功能并減輕肺損傷。目前針對MSCEVs 來源線粒體的研究較少，MSCs-EVs 來源線粒體對肺細(xì)胞功能和線粒體依賴性抗氧化代謝反應(yīng)的影響值得進(jìn)一步研究。

3 MSC-EVs 治療ALI 的臨床試驗

基于MSC-EVs 在各種ALI 動物模型中療效的有力證明，現(xiàn)有研究者進(jìn)行了MSC-EVs 臨床轉(zhuǎn)化的臨床試驗。COVID-19 會導(dǎo)致嚴(yán)重的ARDS，ZHU等［38］開展了一項針對MSC-EXOs吸入治療重癥COVID-19 的臨床試驗研究（NCT04276987），結(jié)果發(fā)現(xiàn)重癥COVID-19患者吸入MSC-EXOs是安全的，且耐受性良好。另一項對照試驗（NCT04798716）中，研究者通過靜脈注射MSC-EXOs 來評估其在重癥ARDS 患者中的安全性和有效性，截至目前試驗正在進(jìn)行［39］。此外，一項隨機雙盲臨床試驗（NCT04602104）旨在探討霧化的MSC-EXOs 治療ARDS 的治療效果，截至目前試驗結(jié)果尚未公布。SHI 等［40］開展了一項關(guān)于健康志愿者氣溶膠吸入MSC-EXOs的耐受性臨床試驗研究（NCT04313647），評估了MSC-EXOs 的安全性和耐受性，結(jié)果表明志愿者對MSC-EXOs 耐受性較好且未表出現(xiàn)不良反應(yīng)，為促進(jìn)霧化MSC-EVs 在肺部疾病中的臨床應(yīng)用提供了初步證據(jù)。以上的臨床試驗展現(xiàn)出了MSC-EVs 在ALI/ARDS 的臨床應(yīng)用中具有良好的前景，然而，MSC-EVs的臨床應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)。

4 MSC-EVs 治療ALI 面臨的挑戰(zhàn)

目前在臨床中使用MSC-EVs 作為治療ALI 方法仍存在挑戰(zhàn)：（1）目前結(jié)論多來自人為制造的動物ALI 模型（主要是嚙齒動物），在將研究成功應(yīng)用到人類之前，必須考慮人類ALI 患者與動物ALI模型以及基因調(diào)控、表達(dá)和發(fā)育及表觀遺傳因素之間的差異［40］；（2）目前已有多種提取EVs 的技術(shù)，但不同的技術(shù)可能會對EVs 的功能產(chǎn)生影響，且EVs 的給藥數(shù)量影響ALI 治療效果［41］，因此未來需要標(biāo)準(zhǔn)化的EVs 采集和純化方法以及開發(fā)更多用于大規(guī)模EVs 生產(chǎn)的技術(shù)；（3）MSC-EVs 攜帶的miRNA、mRNA 和蛋白質(zhì)等物質(zhì)和MSCs 攜帶的物質(zhì)存在不同，可能會在ALI 治療中產(chǎn)生差異［42］，故精確測定可對ALI 發(fā)揮治療作用的EVs 內(nèi)容物有助于增強基于MSC-EVs 的療效；（4）關(guān)于MSC-EVs用于治療ALI 的研究大多是短期的，因此其長期治療效果尚不清楚，對人體的安全劑量也是未知的［12］，所以在ALI 中可實現(xiàn)最佳治療反應(yīng)的MSCEVs 的給藥劑量和給藥途徑也有待確定［43］。

5 總結(jié)與展望

綜上，ALI 是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，可發(fā)展為死亡率較高的ARDS，目前尚無有效的治療方法。MSCs 對ALI 具有一定的治療潛力，但其治療作用主要基于EVs 的轉(zhuǎn)移。MSC-EVs 可以轉(zhuǎn)移miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)和線粒體等多種物質(zhì)，從而改善ALI 的癥狀。此外，MSC-EVs 與MSCs 相比具有體積更小、安全性較高、易于儲存等特點，有望成為ALI 的無細(xì)胞治療策略。但是，目前MSC-EVs相關(guān)的研究尚處于起步階段，對MSC-EVs 及其亞型的釋放、轉(zhuǎn)運和發(fā)揮效應(yīng)的機制仍不完全清楚，且大規(guī)模應(yīng)用MSC-EVs 也存在挑戰(zhàn)。因此，未來應(yīng)進(jìn)一步研究MSC-EVs 的功能及其機制，以期為臨床治療和防治ALI 提供理論依據(jù)。

【Author contributions】HOU Yongzhe and ZHANG Qin were responsible for the conception and wrote the article.ZHAO Xiaochen，HE Miao，and YU Lingling critically revised the manuscript.BAI Hai and WU Tao carefully polished the manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.