血清外泌體microRNAs單一及組合panel對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值

郝劍 韓磊

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2胃腸外科（河北張家口075000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國(guó)第三常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］。早期CRC 患者經(jīng)有效治療后5年生存率可以超過(guò)90%，但約1/4 的患者在初診時(shí)已發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率僅為約12%［2］。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是目前公認(rèn)的能夠有效提高CRC 治療療效的策略，目前臨床常用的實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)主要有糞便潛血檢測(cè)和血液標(biāo)志物檢測(cè)，但二者敏感性和特異性不足［3］；影像學(xué)檢查可以有效評(píng)估病變范圍和腫瘤分期，但對(duì)早期病變的診斷價(jià)值有限［4］；內(nèi)鏡聯(lián)合組織活檢是目前早期診斷CRC 的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在操作繁瑣、患者依從性差、侵入性強(qiáng)等缺點(diǎn)［5］。因此，臨床實(shí)踐中迫切需要一種微創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)、靈敏且準(zhǔn)確的早期診斷方法。液體活檢技術(shù)因其無(wú)創(chuàng)、全面、實(shí)時(shí)、可重復(fù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)而備受推崇。外泌體miRNA 是目前液體活檢的主要項(xiàng)目之一，其在腫瘤的早期診斷、療效評(píng)估和預(yù)后評(píng)估方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［6］。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性早期CRC 患者血清中多個(gè)miRNAs 的含量明顯高于健康組，提示其可作為潛在的CRC 早期診斷標(biāo)志物［7］。既往研究報(bào)道m(xù)iR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 與CRC 的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［8-11］，但關(guān)于4 種miRNA 的表達(dá)水平及其對(duì)CRC 患者的診斷價(jià)值的研究相對(duì)較少。因此，本項(xiàng)研究旨在評(píng)估上述4 種外泌體miRNA 在CRC 患者外周血中的表達(dá)情況，并評(píng)估其對(duì)CRC 的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年3月至2022年5月本院收治的123 例結(jié)直腸癌患者（結(jié)直腸癌組）及117 例結(jié)直腸腺瘤患者（結(jié)直腸腺瘤組）作為研究對(duì)象，并納入150例健康對(duì)照者作為對(duì)照（健康對(duì)照組）。受試者入組后收集其年齡、性別、吸煙、腫瘤部位、腫瘤大小等相關(guān)信息。結(jié)直腸癌組納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）手術(shù)病理確診；（2）未接受放療、化療或其他腫瘤相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：肝、腎和其他器官功能障礙的患者。結(jié)直腸腺瘤（colorectal adenoma，CA）患者納入標(biāo)準(zhǔn)包括：通過(guò)腸鏡病理學(xué)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：無(wú)腫瘤病史，無(wú)其他腸道疾病，無(wú)肝、腎或其他器官功能障礙。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：腸鏡檢查腸道內(nèi)未發(fā)現(xiàn)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：腫瘤病史和心臟、肝臟、腎臟或其他器官功能障礙。本研究經(jīng)患者之情同意并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：HBBFYXY202203024。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑ABI7900 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Thermo-Fisher 公司，GH8935K Nano sight 納米粒度儀購(gòu)自英國(guó)Nano-sight 公司，外泌體提取試劑盒Exo-Quick-TM（貨號(hào)：ND25792-6）、SYBR Premix ExTaq 試劑盒（貨號(hào)：N5643MJ）購(gòu)自美國(guó)CST 公司，Prime-Script RT reagent 試劑盒（貨號(hào)：ND6527J）購(gòu)自購(gòu)自北京百奧生物科技公司，CD9 抗體（貨號(hào)：75882）、CD63 抗體（貨號(hào)：45368）、Calnexin 抗體（貨號(hào)：6387941）均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2.2 血清外泌體提取與鑒定收集受試者5 mL外周靜脈血置于不含抗凝劑的試管中，室溫下3 000g離心15 min，根據(jù)ExoQuickTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)操作，渦旋后的血清和外泌體試劑混合物在4 ℃下沉淀30 min，1 500g離心30 min，棄上清液，再次1 500g離心5 min 得到沉淀，重懸于200 μL 磷酸鹽緩沖液中，使用0.22 μm 無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，制備所需大小和濃度的外泌體。利用納米粒子追蹤分析技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD63、TSG101、Calnexin 的表達(dá)，對(duì)血清外泌體進(jìn)行鑒定。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè)血清外泌體miRNA采用TRizol 法從血清外泌體中提取總RNA。Nano Drop用于檢測(cè)RNA 的濃度。逆轉(zhuǎn)錄體系包括：總RNA 12 μL、2.5 U/μL PolyA 聚合酶1 μL、Mix 1 μL、5×Reaction Buffer 5 μL 和ddH2O 6 μL。以U6 為內(nèi)參，檢測(cè)miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；然后是95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，共40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt方法用于計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合整正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。采用受試者工作特征曲線（ROC）預(yù)測(cè)診斷價(jià)值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征本研究新診斷結(jié)直腸癌患者123例，其中男59 例，女64 例，年齡（51.60 ± 11.41）歲，見(jiàn)表2。同期共入組117 例經(jīng)視頻結(jié)腸鏡檢查確診為結(jié)直腸腺瘤的患者，其中男59 例，女58 例，年齡（51.55 ± 10.17）歲。納入我院健康對(duì)照者150 例為健康對(duì)照組，其中男76 例，女74 例，年齡（52.30 ±11.25）歲。

表2 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征Tab.2 Clinicopathological features of patients with colorectal cancer 例

2.2 各組中miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 相對(duì)表達(dá)水平與健康對(duì)照組相比，結(jié)直腸癌組miR-15b、miR-21、miR-16 及miR-31 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與結(jié)直腸腺瘤組比較，結(jié)直腸癌組miR-15b、miR-21、miR-31 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s

表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與結(jié)直腸腺瘤組比較，#P ＜0.05

組別結(jié)直腸癌組（n= 123）腸腺瘤組（n= 117）健康對(duì)照組（n= 150）F 值P 值miR-15b 11.94± 3.81*#2.45± 0.02 1.21± 0.08 40.16 0.009 miR-16 2.83± 0.33*1.27± 0.12 0.79± 0.33 36.54 0.015 miR-21 8.59± 1.61*#2.14± 0.22 1.27± 0.07 18.36＜0.001 miR-31 7.16± 1.17*#1.68± 0.37 1.22± 0.15 39.12＜0.001

2.3 miR-15b、miR-21、miR-31 水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理相關(guān)性Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.778），見(jiàn)表4。結(jié)直腸癌伴淋巴結(jié)浸潤(rùn)患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31水平高于結(jié)直腸癌不伴淋巴結(jié)浸潤(rùn)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.06），見(jiàn)表5。結(jié)直腸癌低分化腺癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于結(jié)直腸癌中-高分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.12），見(jiàn)表6。

表4 不同分期結(jié)直腸癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s

表4 不同分期結(jié)直腸癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s

組別Ⅲ-Ⅳ期（n=78）Ⅰ-Ⅱ期（n=45）t值P值miR-15b 14.54±0.68 9.04±0.72 12.31 0.006 miR-16 2.26±0.08 1.90±0.12 18.35 0.778 miR-21 10.78±0.09 7.94±0.44 22.11 0.026 miR-31 7.56±0.87 6.16±1.22 13.54＜0.001

表5 結(jié)直腸癌伴或不伴淋巴結(jié)浸潤(rùn)患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s

表5 結(jié)直腸癌伴或不伴淋巴結(jié)浸潤(rùn)患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s

組別淋巴結(jié)浸潤(rùn)（n = 83）無(wú)淋巴結(jié)浸潤(rùn)（n = 44）t 值P 值miR-15b 13.69 ± 1.22 7.28 ± 1.32 22.78＜0.001 miR-16 3.06 ± 0.15 2.99 ± 0.22 19.35 0.06 miR-21 11.01 ± 0.02 8.22 ± 0.29 10.25＜0.001 miR-31 8.18 ± 0.37 5.98 ± 1.32 8.91＜0.001

表6 結(jié)直腸癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s

表6 結(jié)直腸癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s

組別中-高分化腺癌（n = 49）低分化腺癌（n = 78）t 值P 值miR-15b 14.09 ± 0.88 6.12 ± 2.19 12.18＜0.001 miR-16 2.66 ± 1.18 2.12 ± 1.56 6.22 0.12 miR-21 10.89 ± 0.17 7.99 ± 0.83 19.51＜0.001 miR-31 9.01 ± 0.13 6.10 ± 1.66 18.22 0.029

2.4 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 對(duì)結(jié)直腸癌患者的診斷價(jià)值采用ROC 曲線評(píng)估m(xù)iR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 在結(jié)直腸癌中的診斷價(jià)值。miR-15b 的AUC 為0.86（0.82～0.91），miR-16、miR-21、miR-31 的AUC 分別為0.58（0.51～0.65）、0.75（0.69～0.81）、0.75（0.68～0.82），4 種miRNA 中評(píng)價(jià)效力最高的指標(biāo)是miR-15b，敏感度和特異度分別為81.33%和91.80%，（P＜0.05）；評(píng)價(jià)效力最差指標(biāo)為miR-16，敏感度和特異度分別為42.68%和52.33%（P＜0.05）。進(jìn)一步采用logistic 分析對(duì)miR-15b、miR-21和miR-31組合panel診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示三者組合panel 具有更好的敏感度和特異度：91.95%和97.62%（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 及組合panel 對(duì)結(jié)直腸癌患者的診斷價(jià)值Fig.1 Diagnostic value of miR-15b，miR-16，miR-21，miR-31 and combined panel in patients with colorectal cancer

3 討論

在我國(guó)CRC 發(fā)病率和病死率一直居高不下，且由于早期診斷方法缺乏敏感性和特異性，其總體趨勢(shì)依然呈上升趨勢(shì)［12］。miRNA 是由19～24 個(gè)核苷酸組成的小型非編碼RNA 分子，其通過(guò)與靶基因mRNA 的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合來(lái)觸發(fā)mRNA 的降解，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，miRNAs的異常表達(dá)與許多腫瘤等疾病密切相關(guān)，已證實(shí)miRNAs 具有致癌或抑癌活性［13］。外泌體miRNA作為腫瘤基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞之間信號(hào)交流的重要媒介，幾乎參與了腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的所有生物學(xué)過(guò)程［14］。與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物相比，外泌體來(lái)源的miRNA 具有較高的敏感性和特異性，檢測(cè)腫瘤來(lái)源外泌體中miRNA 的類(lèi)型和含量，對(duì)腫瘤臨床診斷和治療具有重要意義。一項(xiàng)研究分析了746 例CRC 患者和476 例健康受試者，結(jié)果顯示miR-21 診斷CRC 的敏感度和特異度分別為72%和85%，證實(shí)其具有作為CRC 診斷標(biāo)志物的良好潛力［15］。

本研究結(jié)果顯示，miR-15b 是CRC 診斷的潛在生物標(biāo)志物，且miR-15b、miR-21 和miR-31 組合panel 具有更好的診斷價(jià)值，這與之前的研究結(jié)果相符。miR-15b 屬于miR-15 家族，其位于3q25.33 染色體區(qū)域。研究表明，miR-15b 在許多腫瘤中異常表達(dá)，例如miR-15b 在舌癌、宮頸癌和胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)，并充當(dāng)癌基因［16］。miR-15b 的異常表達(dá)可用于各種腫瘤的診斷，也可作為復(fù)發(fā)檢測(cè)的重要生物標(biāo)志物。一項(xiàng)研究表明，miR-15b在肝癌復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)顯著增加，miR-15b 可能與MTSS1 結(jié)合以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，而MTSS1 是一種多功能蛋白，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，MTSS1 的下調(diào)可作為肺鱗狀細(xì)胞癌早期輔助治療階段進(jìn)展的標(biāo)志物［17］。miR-15b 通過(guò)靶向下調(diào)MTSS1 表達(dá)促進(jìn)CRC 細(xì)胞增殖，抑制miR-15b 可上調(diào)MTSS1 表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞增殖［18］。一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，血液中的miR-21 水平可用于檢測(cè)CRC，其具有良好的敏感性和特異性：血液miR-21的診斷效率高于糞便miR-21，血清標(biāo)本中miR-21的檢測(cè)優(yōu)于血漿標(biāo)本［19］。許多研究表明，miR-31作為一種致癌物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)、凋亡、轉(zhuǎn)移和化療耐藥，miR-31 的表達(dá)增加與CRC 腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，提示血清miR-31 可用于CRC 的診斷［20］。此外miRNA panel 作為不同miRNA 的組合，可以提高其檢測(cè)效率。一項(xiàng)包括1 558 例CRC患者和1 085 例健康受試者的薈萃分析結(jié)果顯示，循環(huán)外泌體的miR-1246 和miR-23a 組合panel 診斷CRC 的敏感度和特異度分別高達(dá)95%和92%［21］。

總之，本研究評(píng)估了4 種血清外泌體miRNA：miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 的臨床價(jià)值，并且我們發(fā)現(xiàn)4 種miRNA 在結(jié)直腸癌患者外周血中異常表達(dá)，且其中的miR-15b、miR-21 和miR-31 表達(dá)水平與臨床TNM 分期、淋巴結(jié)浸潤(rùn)呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)；此外相較于單一miRNAs 檢測(cè)，miR-15b、miR-21 和miR-31 的組合panel 可以更好地區(qū)分健康對(duì)照組和結(jié)腸癌患者，其敏感度和特異度分別為95.06%和94.44%，這對(duì)于提高結(jié)直腸癌臨床診斷效率具有潛在的參考價(jià)值。但本研究仍然存在局限性，相對(duì)較小的單中心樣本量限制了該研究的應(yīng)用價(jià)值，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行完善。

【Author contributions】HAN Lei designed the study,HAO Jian conducted experiments and wrote the manuscript,and HAN Lei revised the manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.