硫紅霉素菌渣有機(jī)肥對(duì)大豆土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因的影響

易鴛鴦,謝 芳,田世英,張志東,顧美英,彭小武

(1.新疆環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院,烏魯木齊 830011;2.新疆環(huán)境污染監(jiān)控與風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆清潔生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心/國(guó)家環(huán)境保護(hù)準(zhǔn)噶爾荒漠綠洲交錯(cuò)區(qū)科學(xué)觀測(cè)研究站,烏魯木齊 830011;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】抗生素抗性基因作為一種新型環(huán)境污染物,其可通過(guò)移動(dòng)基因元件在環(huán)境中遷移、轉(zhuǎn)化[1-3]。菌渣廢棄物因含有抗生素殘留會(huì)造成生態(tài)環(huán)境污染[4]。加大抗生素菌渣的無(wú)害化處理,對(duì)其后續(xù)處置的監(jiān)測(cè)和評(píng)估有重要意義。【前人研究進(jìn)展】抗生素菌渣除含有少量殘留的抗生素外,其粗脂肪含量占比為10%～20%,粗蛋白含量占比為30%～40%,可通過(guò)水熱處理、電子束處理、菌渣熱解、厭氧消化、好氧堆肥等技術(shù)實(shí)現(xiàn)菌渣資源化利用,其中,菌渣肥料化是一種重要的無(wú)害化處理途徑[5-6]?？股鼐诎l(fā)酵肥料化過(guò)程中,能有效降低其抗生素含量,施用后能有效提高土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量,但對(duì)菌渣有機(jī)肥施用帶來(lái)的抗生素抗性基因擴(kuò)散的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)不一[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】施用硫紅雷素菌渣制備的有機(jī)肥,大豆土壤真菌豐富度和優(yōu)勢(shì)度顯著降低,潛在致病菌數(shù)量下降[10],但對(duì)大豆土壤耐藥菌及其抗性基因的影響,尚不清楚。需研究硫紅霉素菌渣有機(jī)肥對(duì)大豆土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以大豆為供試作物,設(shè)置藥渣有機(jī)肥不同施用量處理,分別檢測(cè)大豆苗期、結(jié)果期中的抗生素抗性菌數(shù)量和種類,分析不同抗生素抗性基因的豐度變化,為硫紅霉素菌渣有機(jī)肥施用后對(duì)農(nóng)作物土壤的生物安全性評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以黃豆綏農(nóng)14號(hào)大豆為供試作物,以某生物制藥企業(yè)硫紅霉素菌渣無(wú)害化處理后制得的有機(jī)肥為施用肥料。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)地點(diǎn)為新疆某制藥企業(yè)試驗(yàn)基地,試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理,分別為對(duì)照組CK(不施藥渣有機(jī)肥)、A1(施用硫紅霉素菌渣有機(jī)肥500 kg/667 m2)、A2(施用硫紅霉素菌渣有機(jī)肥1 000 kg/667 m2),每個(gè)處理為1個(gè)試驗(yàn)小區(qū),各小區(qū)面積約為1 334 m2。播種前,將菌渣有機(jī)肥為底肥施入大豆土壤,取樣測(cè)定土壤樣品硫紅霉素殘留及理化性質(zhì),并按照常規(guī)進(jìn)行田間管理。表1

表1 土壤中硫紅霉素殘留與土壤理化性質(zhì)Table 1 Residue thioerythromycin and physical-chemical properties of different treatments soil

1.2.2 樣品采集

在大豆出苗期和結(jié)果期每個(gè)小區(qū)選取5個(gè)典型樣方,每個(gè)樣方按照“梅花五點(diǎn)”法布設(shè)5個(gè)分點(diǎn),采集表層(0～20 cm)土壤,剔除雜質(zhì)后,將土樣充分混勻后用四分法保留2 kg,采集的土樣放入裝有冰袋的采樣箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,在24 h內(nèi)進(jìn)行抗生素耐藥菌計(jì)數(shù),剩余土壤樣品-80℃保存,備用。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

采用稀釋平板涂布計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),其中未加抗生素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板用于總菌數(shù)計(jì)數(shù)使用,分別以50 μg/mL的硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定的抗性營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,進(jìn)行硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定抗性菌的計(jì)數(shù)。

取10 g土壤樣品,置于100 mL無(wú)菌生理鹽水中,120 r /min 條件下振蕩10 min,靜止5 min,取1 mL土壤懸液按10倍系列稀釋后,取適宜稀釋度土壤懸液100 μL,涂布于對(duì)應(yīng)平板上,作3次平行,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.4 耐藥細(xì)菌鑒定

觀察不同抗性平板,挑選顏色、形態(tài)特異的菌落,于相對(duì)應(yīng)抗性平板上劃線純化,30℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),定期觀察,并連續(xù)純化培養(yǎng),直至獲得單菌落。

采用菌落PCR方法,選用細(xì)菌16S rDNA序列通用引物27F和1 492R進(jìn)行耐藥菌16S rDNA序列PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)天根膠回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)切膠純化后,送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序,測(cè)序所得菌株序列到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),確定與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的屬種。

1.2.5 ARGs篩選與擴(kuò)增

選取典型耐藥基因,2種紅霉素類ARGs(ermB、ermF)、1種β-內(nèi)酰胺類ARGs(blaTEM)、2種磺胺類ARGs(sul1、sul2)進(jìn)行檢測(cè),引物序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。

土壤總DNA提取采用快速提取試劑盒(Fast DNA Spin Kit for Soil),并以此DNA為模板,以ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2為目的基因,參照王佳佳[11]、朱玥晗[12]方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),判斷引物適用性及土壤有無(wú)相關(guān)抗性基因。表2

1.2.6 不同ARGs的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

選擇1.2.5所述抗性基因序列大小正確,且特異性好的PCR條帶進(jìn)行回收純化,純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落接種于含50 μg/mL氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)12 h后,采用天根質(zhì)粒小提試劑盒(TIAN Pure Midi Plasmid Kit)提取質(zhì)粒,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表 2 ARGs引物序列Table 2 Primer sequences of antibiotic resitance genes

對(duì)鑒定正確的抗性基因質(zhì)粒,采用Biotek Epoch微孔板分光光度計(jì)(美國(guó))進(jìn)行濃度以及純度檢測(cè),根據(jù)測(cè)定濃度值計(jì)算基因拷貝數(shù)[13]。質(zhì)粒DNA按10倍梯度稀釋作為定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)模版,參照qPCR試劑盒(Quanti Nova SYBR Green PCR Kit)條件進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,Forward Primers 0.25 μL,Reverse Primers 0.25 μL,QN ROX Reference Dye 2 μL,模板1 μL,ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min,94℃,30 s;54℃,30 s;72℃,30 s;30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min。分析各基因序列在不同濃度PCR擴(kuò)增的Ct值,并以拷貝數(shù)的log值為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 土壤ARGs的定量分析

分別以各土壤DNA為模版,開(kāi)展不同基因的qPCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.5。待qPCR擴(kuò)增結(jié)束后,明確各土壤樣品qPCR擴(kuò)增的Ct值,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到土壤樣品中目的基因的絕對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對(duì)常規(guī)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、匯總,采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,選用GraphPad Prism 8.0.1進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

研究表明,大豆不同生育期可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)及抗生素耐藥菌菌落數(shù)之間存在一定差異,大豆苗期土壤中各類細(xì)菌數(shù)量大于結(jié)果期菌落數(shù)。各細(xì)菌數(shù)在數(shù)量上排序?yàn)槊缙贏1>結(jié)果期A1,苗期A2>結(jié)果期A2。在苗期樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機(jī)肥的土壤細(xì)菌總數(shù)、硫紅霉素抗性菌數(shù)顯著高于對(duì)照組,土壤細(xì)菌總數(shù)為A2>A1>CK,分別為2.52×107>2.43×107>1.87×107;硫紅霉素抗性菌數(shù)為A2>A1>CK,分別為5.50×103>4.9×103>4.33×103。而青霉素、頭孢拉定抗性菌株數(shù)與對(duì)照組差異不顯著。在結(jié)果期樣品中,施加了硫紅霉素藥渣有機(jī)肥的土壤中各類菌落總數(shù)與對(duì)照組差異不顯著。表3

在苗期的土壤中,盡管硫紅霉素抗性菌總數(shù)相較于對(duì)照組顯著增加A2>A1>CK,但其相對(duì)豐度卻明顯下降A(chǔ)1

2.2 土壤中抗生素耐藥菌的種屬構(gòu)成

研究表明,共獲得各類菌株51株,其中,硫紅霉素耐藥菌14株,青霉素耐藥菌25株,頭孢拉定耐藥菌12株。經(jīng)16S rDNA序列分子鑒定,所得硫紅霉素耐藥菌株分布于11個(gè)菌屬,其中,假節(jié)桿菌屬、芽胞桿菌屬、類谷氨酸桿菌屬菌種數(shù)均為2個(gè),其余菌屬菌種數(shù)均為1個(gè)。25株青霉素耐藥菌分布于7個(gè)菌屬,其中鏈霉菌屬菌種數(shù)最多,達(dá)到18株,占總菌株數(shù)比例高達(dá)72.00%。12株頭孢拉定耐藥菌分布于5個(gè)菌屬,其中,假單胞菌屬菌株數(shù)最多,占比達(dá)到50.00%,其次為鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬菌。表4

表 3 不同處理下大豆不同生長(zhǎng)期土壤中耐藥菌數(shù)量Table 3 Drug resistant bacteria in soil at different treatments and growth stages of soybean

圖1 出苗期硫紅霉素耐藥菌數(shù)相對(duì)豐度

表 4 大豆土壤中篩選獲得耐藥菌菌屬分布Table 4 Genus distribution of drug resistant bacteria isolated from soybean soil

2.3 施用有機(jī)肥后作物土壤中ARGs的水平

2.3.1 不同ARGs及16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

研究表明,分別以ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2為目的ARGs基因進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,各擴(kuò)增基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均高于0.99,各基因濃度與qPCR的Ct值線性相關(guān)性較好。表5

2.3.2 土壤中ARGs絕對(duì)豐度分析

研究表明,β-內(nèi)酰胺類ARGs(blaTEM)拷貝數(shù)高于紅霉素類ARGs(ermB、ermF)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)。大豆苗期土壤中ARGs絕對(duì)含量均大于結(jié)果期。在苗期樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機(jī)肥的土壤其中紅霉素類ARGs(ermB、ermF)和16SrDNA拷貝數(shù)均高于對(duì)照組,但差異不顯著;β-內(nèi)酰胺類ARGs(blaTEM)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)絕對(duì)含量與對(duì)照組差異也不顯著。在結(jié)果期樣品中,硫紅霉素菌渣有機(jī)肥處理對(duì)土壤各類ARGs絕對(duì)含量影響不大,且差異不顯著。表6

表 5 抗性基因和16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 5 Standard curve equation of ARGs and 16S rDNA

2.3.3 施用有機(jī)肥后土壤中ARGs的相對(duì)豐度

研究表明,在大豆苗期不同處理方式下土壤中ermB、ermF相對(duì)豐度存在差異,在大豆出苗期,A1和A2的ermB和ermF平均相對(duì)豐度均高于CK對(duì)照組,但三者間差異不顯著。在大豆結(jié)果期不同處理方式下土壤中ermB與ermF平均相對(duì)豐度也均高于對(duì)照組,但差異不顯著。圖2

大豆苗期土壤中β-內(nèi)酰胺類blaTEM相對(duì)豐度明顯高于sul1和sul2,在不同生育期的樣品中,blaTEM、sul1和sul2相對(duì)豐度與對(duì)照組均表顯差異不顯著。圖3

表6 施用硫紅霉素菌渣大豆土壤中ARGs的拷貝數(shù)變化Table 6 Copy number of ARGs in soybean soil with thioerythromycin residue

(a)大豆出苗期土壤中ARGs相對(duì)豐度 (b)大豆結(jié)果期土壤中ARGs相對(duì)豐度

(a)大豆苗期土壤中ARGs相對(duì)豐度 (b)大豆結(jié)果期土壤中ARGs相對(duì)豐度

3 討 論

在有機(jī)肥的發(fā)酵過(guò)程中,菌渣中抗生素及相關(guān)代謝物殘留物或相關(guān)抗性基因的降解和轉(zhuǎn)化不徹底,在施用后可能會(huì)增加作物土壤中抗生素耐藥菌的數(shù)量和ARGs的含量,具有潛在的環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)[14-17]。周睫雅[18]發(fā)現(xiàn)頭孢菌素菌渣有機(jī)肥施用對(duì)大豆土壤中的細(xì)菌豐度影響較小,且對(duì)土壤中抗性基因總相對(duì)豐度和主要抗性基因的類型影響較小。平然等[19]研究發(fā)現(xiàn),硫酸新霉素菌渣有機(jī)肥施用后土壤中硫酸新霉素抗性基因acc(6′)ib相對(duì)豐度增加,但顯著低于商品有機(jī)肥。肖祖飛[20]研究發(fā)現(xiàn),施用制藥污泥肥料會(huì)增加非根際土、根際土、根和青菜(蘇州青)葉際的ARGs豐度和多樣性,并推測(cè)污泥肥料施用后的土壤是葉際的ARGs的一個(gè)主要來(lái)源,施用制藥污泥肥料會(huì)增加ARGs擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)每年產(chǎn)生約200多萬(wàn)噸硫紅霉素菌渣[21],但硫紅霉素菌渣有機(jī)肥堆肥處理或處理后應(yīng)用對(duì)土壤中ARGs污染水平研究未見(jiàn)報(bào)道。研究通過(guò)分析硫紅霉素菌渣無(wú)害化處理制得的有機(jī)肥施用大豆農(nóng)田其土壤中常見(jiàn)ARGs的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度變化,結(jié)果表明影響不顯著。

研究結(jié)果表明,在苗期土壤樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機(jī)肥的土壤細(xì)菌總數(shù)、硫紅霉素抗性菌數(shù)顯著高于對(duì)照組,而青霉素、頭孢拉定抗性菌株數(shù)與對(duì)照組差異不顯著;在結(jié)果期樣品中,施加了硫紅霉素藥渣有機(jī)肥的土壤中各類菌落總數(shù)與對(duì)照組差異不顯著,與Wang等[22]在對(duì)青霉素藥渣有機(jī)肥施用后相關(guān)結(jié)果一致。

在有機(jī)肥如糞肥或者堆肥施用到土壤后,因打破了原有土壤中營(yíng)養(yǎng)組成會(huì)出現(xiàn)微生物菌群快速響應(yīng),此時(shí)的ARGs的豐度會(huì)明顯提高,當(dāng)不再繼續(xù)施肥時(shí),ARGs的豐度會(huì)逐漸減少[23-24]。研究發(fā)現(xiàn),在大豆苗期土壤中紅霉素類ARGs(ermB、ermF)、β-內(nèi)酰胺類ARGs(blaTEM)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)的絕對(duì)含量均大于結(jié)果期,也可能與此過(guò)程相關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)在施加有機(jī)肥不同生育期土壤樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機(jī)肥的土壤中紅霉素類ARGs(ermB、ermF)平均含量高于對(duì)照組,但差異不顯著,且β-內(nèi)酰胺類ARGs(blaTEM)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)含量與對(duì)照組差異也不明顯。施加硫紅霉素菌渣有機(jī)肥對(duì)土壤中常見(jiàn)ARGs的影響不大,但后續(xù)影響還有待進(jìn)一步跟蹤開(kāi)展。

4 結(jié) 論

施用不同濃度的硫紅霉素菌渣有機(jī)肥后,高濃度菌渣有機(jī)肥處理土壤中抗性菌數(shù)量高于低度濃度菌渣有機(jī)肥處理,且苗期抗性菌數(shù)量均大于結(jié)果期,但隨著大豆的生長(zhǎng)抗性菌數(shù)量均明顯下降,并且與CK相比,硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定的數(shù)量在大豆苗期、結(jié)果期均未明顯增加。獲得14株硫紅霉素耐藥菌菌株分布于11個(gè)菌屬,其中假節(jié)桿菌屬、芽胞桿菌屬、類谷氨酸桿菌屬菌株數(shù)占總菌株數(shù)的比例最高;25株青霉素耐藥菌菌株分布于7個(gè)菌屬,其中鏈霉菌屬菌株數(shù)最高;12株頭孢拉定耐藥菌分布于5個(gè)菌屬,其中假單胞菌屬菌株數(shù)最高占總菌株數(shù)的比例達(dá)到50.00%。施用硫紅霉素菌渣有機(jī)肥土壤中常見(jiàn)ARGs的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度有一定的影響,但影響不顯著。