基于LC/MS的伊犁馬3 600 m速度賽賽前、賽后血漿代謝組學(xué)差異變化

張仕琦,李曉斌,張文杰,韓 明,王世昌,鄭文祥,歐陽文,祁居中,楊開倫

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052;2.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場,新疆昭蘇 835000)

0 引 言

【研究意義】運(yùn)動馬在不同生理活動(訓(xùn)練、競賽)中,肌肉細(xì)胞收縮、能量消耗以及體內(nèi)代謝產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致力的下降,產(chǎn)生運(yùn)動性疲勞[1],掌握機(jī)體運(yùn)動過程中代謝產(chǎn)物變化情況,對于預(yù)防、恢復(fù)運(yùn)動疲勞和提高運(yùn)動性能有重要作用,能夠?yàn)檫\(yùn)動馬的營養(yǎng)調(diào)控提供思路。代謝組學(xué)可以通過血液或尿液代謝產(chǎn)物的整體模式測定或指紋分析,進(jìn)一步揭示機(jī)體代謝變化[2],對于馬匹運(yùn)動性能的調(diào)控可能發(fā)揮積極作用。【前人研究進(jìn)展】Enea等[3]利用代謝組學(xué)技術(shù)揭示長時間運(yùn)動(75%的VO2max,直至耗竭)和短時間的運(yùn)動(短期、密集性運(yùn)動厭氧試驗(yàn))機(jī)體尿液代謝產(chǎn)物具有差異。Lehmann等[4]利用代謝組學(xué)方法鑒定出人在中等強(qiáng)度運(yùn)動中,中等鏈?；鈮A是具有促進(jìn)脂肪氧化能力的主要生物標(biāo)記物。Lewis等[5]利用質(zhì)譜技術(shù)對運(yùn)動員運(yùn)動前后200多個代謝物進(jìn)行了測定,得到了綜合的血漿代謝物特征?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國內(nèi)運(yùn)動馬產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展,國產(chǎn)運(yùn)動馬運(yùn)動性能上的差距以及運(yùn)動性疲勞現(xiàn)象等問題日益顯現(xiàn)。隨著科技設(shè)備的發(fā)展,馬匹運(yùn)動過程中的生理參數(shù)如心率、呼吸等能夠即時測定,但血液中的代謝物目前仍未能實(shí)現(xiàn)運(yùn)動過程中的即時監(jiān)測,馬匹在運(yùn)動過程中生化狀態(tài)變化的數(shù)據(jù)較難獲取,也未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】試驗(yàn)采用賽后即刻狀態(tài)趨近于運(yùn)動過程中狀態(tài)的方法,應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)檢測分析技術(shù),研究伊犁馬3 600 m速度賽前和賽后即刻血液中主要代謝物的差異變化,為運(yùn)動馬運(yùn)動過程中的代謝調(diào)控提供新的參考和思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 飼糧組成

根據(jù)馬場提供的遺傳系譜,挑選5匹(3♂+2♀)無親緣關(guān)系、體重(384.40±34.18)kg、年齡為2歲的正常速度賽用伊犁馬,試驗(yàn)馬匹每日等強(qiáng)度訓(xùn)練25 d后,于晨飼4 h進(jìn)行3 600 m速度賽,試驗(yàn)馬以(11.75±0.87)m/s的平均速度完成比賽。賽前安穩(wěn)狀態(tài)下和賽后即刻測定心率和呼吸頻率,采集血液、制備血漿樣品,采集血漿的質(zhì)譜,采用非靶向性代謝組學(xué)方法進(jìn)行代謝物的測定。表1

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平表(干物質(zhì)基礎(chǔ),%)Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis,%)

試驗(yàn)馬匹單廄飼養(yǎng),每天按時打掃馬廄。每天每匹試驗(yàn)馬飼喂相同飼糧(8 kg干牧草和4 kg精料補(bǔ)充料)。每天分3次飼喂(07:00,15:00和22:00),先粗后精,自由飲水。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別在試驗(yàn)正試期第25 d進(jìn)行的3 600 m速度賽的賽前安穩(wěn)狀態(tài)下、賽后即刻(即馬匹完成賽程時立即采集血液),測定呼吸頻率和心率,采集頸靜脈血液(肝素鈉抗凝管)。血液以3 500 r/min離心10 min后收集上清血漿,分裝,液氮凍存。

1.2.2 樣品預(yù)處理

試驗(yàn)樣本預(yù)處理:取100 μL血漿加入80%的甲醇水溶液400 μL,渦旋振蕩后在-20℃條件下靜置60 min,于14 000×g、低溫離心20 min,取上清取進(jìn)行真空冷凍干燥,加入100 μL的復(fù)溶劑進(jìn)行溶解殘留物,混勻后,于14 000×g、低溫離心15 min,正離子模式取上清液8 μL、負(fù)離子模式取上清液12 μL進(jìn)行LC-MS分析。

質(zhì)控(QC)樣本預(yù)處理:從每個已處理好的樣本中取等量上清液混勻作為QC樣本。blank樣本為試驗(yàn)樣本的空白基質(zhì),樣本前處理過程與試驗(yàn)樣本相同。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜分析

采用超高效液相色譜系統(tǒng)(Vanquish UHPLC)對10個樣品進(jìn)行分離。柱溫40℃;流速:0.3 mL/min;正模式流動相組成:流動相A:0.1%甲酸,95%乙腈,10 mmol/L醋酸銨。流動相B:0.1%甲酸,50%乙腈,10 mmol/L醋酸銨。負(fù)模式流動相組成:流動相A:95%乙腈,10 mmol/L醋酸銨,pH9.0。流動相B:50%乙腈,10 mmol/L醋酸銨,pH9.0。分離后用QE HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。掃描范圍選擇m/z 100-1 500;ESI源的設(shè)置如下:Spray Voltage:3.2 kV;Sheath gas flow rate:35 arb;Aux Gas flow rate:10 arb;Capillary Temp:320 °C。Polarity:positive;negative;MS/MS二級掃描為data-dependent scans。表2

表2 色譜梯度洗脫程序Table 2 Chromatographic gradient elution procedure

1.2.4 游離氨基酸定量測定

取50 μL血漿加50 μL蛋白沉淀劑(含NVL),渦旋震蕩,13 200 r/min、4℃離心4 min去蛋白,取8 μL上清加入42 μL標(biāo)記緩沖液和20 μL衍生液混勻,于55℃恒溫條件下衍生15 min后冷卻、離心,取50 μL上清進(jìn)行LC-MS檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的配對樣本t檢驗(yàn)對心率、呼吸頻率和游離氨基酸定量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示,以P<0.05為差異顯著水平,P<0.01為差異極顯著水平,0.05≤P≤0.1具有差異趨勢。

非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù):將下機(jī)數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Compound discoverer(CD)搜庫軟件中,設(shè)置參數(shù)質(zhì)量偏差0.005‰、信號強(qiáng)度偏差30%、信噪比3、最小信號強(qiáng)度100 000、加和離子等信息進(jìn)行峰提取,用QC樣本對定量結(jié)果進(jìn)行歸一化,對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,得到質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)。分析PCA和PLS-DA。PLS-DA模型以變量投影重要度VIP>1.0,差異倍數(shù)FC>1.2或FC<0.833為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 600 m速度賽前、后伊犁馬的心率和呼吸頻率變化

研究表明,試驗(yàn)馬匹在3 600 m速度賽過程中心率、呼吸頻率顯著升高(P<0.05)。表3

2.2 代謝物質(zhì)總離子色譜圖

研究表明,伊犁馬血漿經(jīng)過正、負(fù)離子檢測,得到的兩個二維數(shù)據(jù)陣。數(shù)據(jù)陣中質(zhì)荷比、保留時間及其峰面積等數(shù)據(jù),在mzCloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步對化合物精確定性和相對定量。圖1

表3 3 600 m速度賽前、后伊犁馬的心率 和呼吸頻率Table 3 Heart rate and respiratory rate of the Yili horse before and after 3 600 m speed race(bpm)

2.3 代謝差異產(chǎn)物

2.3.1 偏最小二乘法判別(PLS-DA)

研究表明,樣本都處于楠圓置信區(qū)間內(nèi),并且5個質(zhì)控樣品能夠較好的聚類。賽前、賽后血漿樣品有明顯分開區(qū)域。試驗(yàn)伊犁馬血漿正離子和負(fù)離子模式數(shù)據(jù)建立的PLS-DA模型的解釋率和預(yù)測能力強(qiáng),且排序檢驗(yàn)R2>Q2,解釋率大于該模型的預(yù)測率,模型未“過擬合”,模型可靠,能很好的描述樣本。圖2,圖3

2.3.2 代謝差異產(chǎn)物的篩選

研究表明,與賽前相比,伊犁馬賽后血漿甘油、檸檬酸、琥珀酸、精氨基琥珀酸、乳酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、尿酸、犬尿氨酸、胱氨酸、N-乙酰天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、乙酰左旋肉堿含量顯著升高(VIP>1.0)。血漿葡萄糖、D-葡萄糖-6-磷酸、亮氨酸、色氨酸、組氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、蘇氨酸、乙酰精氨酸、混旋肉堿、辣椒素、多巴胺含量顯著降低(VIP>1.0)。表4

2.4 游離氨基酸定量

研究表明,伊犁馬3 600 m速度賽賽后血漿氨基酸含量的變化較大,為進(jìn)一步驗(yàn)證,又進(jìn)行血漿氨基酸定量測定。伊犁馬3 600 m速度賽賽后即刻與賽前相比血漿多種氨基酸含量產(chǎn)生顯著變化,其中:血漿Asp、Lys含量極顯著升高(P<0.01);Trp、His、Asn含量以及色氨酸/支鏈氨基酸比值極顯著降低(P<0.01);Ala含量顯著升高(P<0.05)。表5

注:A為正離子模式,B為負(fù)離子模式

注:圖中置信橢圓為95%。A為正離子模式,B為負(fù)離子模式,下同

注:R2:表示模型解釋率;Q2:表示模型預(yù)測能力

表4 伊犁馬3 600 m速度賽賽前賽后的血漿代謝差異物(n=5)Table 4 Plasma differential metabolites before and after 3 600 m Speed Race in Yili horse(n=5)

2.5 KEGG富集分析

研究表明,經(jīng)過KEGG富集后,伊犁馬在3 600 m速度賽中檸檬酸循環(huán)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、五糖和葡萄糖醛酸間轉(zhuǎn)化、半胱氨酸與蛋氨酸代謝、氧化磷酸化、脂肪酸降解、鞘脂代謝等途徑呈現(xiàn)顯著性變化(P<0.05)。表6

3 討 論

3.1心率30～42次/min,呼吸數(shù)8～16次/min是成年馬的正常閾值[6]。試驗(yàn)馬匹在賽前心率和呼吸頻率在正常范圍內(nèi),馬匹的生理狀態(tài)穩(wěn)定。賽后即刻試驗(yàn)馬匹心率和呼吸頻率達(dá)到較高水平,表明運(yùn)動期間馬匹心肺功能快速運(yùn)轉(zhuǎn),增加血氧供應(yīng),促進(jìn)機(jī)體氧化供能,使得血液中營養(yǎng)物質(zhì)快速代謝轉(zhuǎn)換。利用非靶向代謝組學(xué)的方法對伊犁馬3 600 m速度賽賽前、賽后即刻兩個時間點(diǎn)的血漿代謝小分子進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)能量代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等途徑在伊犁馬運(yùn)動過程中呈現(xiàn)顯著性變化。

3.2伊犁馬3 600 m速度賽后即刻血漿檸檬酸、琥珀酸含量上升。檸檬酸、琥珀酸是需氧生物體內(nèi)能源物質(zhì)的最終代謝通路—檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán),TCA)的重要物質(zhì),是有氧代謝供能的中樞環(huán)節(jié)。在三羧酸循環(huán)中乙酰膽堿和草酰乙酸生成的檸檬酸,檸檬酸的含量可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)能源物質(zhì)有氧氧化代謝的狀況。表明伊犁馬在3 600 m速度賽過程中有氧氧化參與代謝供能,加速了三羧酸循環(huán)的物質(zhì)代謝。

3.3伊犁馬3 600 m速度賽后即刻血漿葡萄糖含量下降,丙酮酸、乳酸含量上升。說明馬匹在劇烈運(yùn)動時ATP快速分解供能且不斷消耗氧氣,當(dāng)磷酸肌酸耗盡后,肌細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)厭氧酵解狀態(tài),能量代謝轉(zhuǎn)為糖酵解途徑,分解糖原,產(chǎn)生大量乳酸[7-8]和丙酮酸。丙酮酸加氫還原成乳酸后繼續(xù)分解釋放ATP[9]。在運(yùn)動員比賽過程中糖無氧供能加強(qiáng),賽前、賽后乳酸和葡萄糖濃度顯著變化[10]。

伊犁馬3 600 m速度賽后血漿葡萄糖濃度降低。葡萄糖是機(jī)體內(nèi)主要的供能物質(zhì),血漿葡萄糖濃度降低可能是因?yàn)榧∪膺\(yùn)動刺激APMK通路,加速葡萄糖向肌肉轉(zhuǎn)運(yùn)速度,以供肌肉氧化供能[11]。馬拉松運(yùn)動員賽后[12]以及大鼠一次性力竭運(yùn)動后[13]血清葡萄糖濃度也呈現(xiàn)顯著降低態(tài)勢。

表5 伊犁馬3 600 m速度賽賽前賽后的血漿游離氨基酸含量變化(n=5, μmol/L)Table 5 Changes of free amino acids in pasma before and after 3 600 m Speed Race in Yili horse(n=5, μmol/L)

研究中賽后即刻伊犁馬血漿乳酸濃度升高。乳酸是糖酵解的最終產(chǎn)物,機(jī)體運(yùn)動導(dǎo)致無氧代謝增強(qiáng),乳酸在體內(nèi)不斷積累[14],使得血漿乳酸濃度升高。研究表明,運(yùn)動員訓(xùn)練后乳酸酵解能系統(tǒng)參與機(jī)體供能,血清中乳酸含量升高[10]。乳酸根離子(La-)與鈉(Na+)或鉀(K+)離子形成鹽,對肌肉細(xì)胞不構(gòu)成威脅,但肌肉中H+的積累,降低pH能夠抑制肌動蛋白和肌球蛋白纖維的相互作用,以及抑制肌漿網(wǎng)中鈣離子(Ca2+)再攝取,可能延長肌肉收縮時間并導(dǎo)致疲勞[15-16]。乳酸是判斷運(yùn)動性疲勞的標(biāo)志物之一。

伊犁馬在3 600 m速度賽過程中供能方式不僅有葡萄糖和檸檬酸參與的有氧氧化,還有在耗氧狀態(tài)下,糖酵解系統(tǒng)逐漸參與機(jī)體供能,也逐漸積累了能夠引起降低力的乳酸。

3.4伊犁馬血漿各氨基酸含量賽前、賽后即刻出現(xiàn)顯著差異,伊犁馬在運(yùn)動過程中血漿氨基酸含量有顯著影響。血液中氨基酸的濃度不高,但更新迅速,一些組織器官可以不斷地從血液中攝取/釋放氨基酸,尤其是骨骼肌[17]。機(jī)體運(yùn)動時,血液多集中在肢體骨骼肌中,且隨著骨骼肌運(yùn)動收縮,能量代謝,血液循環(huán)也加快,使得血液中氨基酸含量也發(fā)生變化。

伊犁馬3 600 m速度賽后即刻血漿谷氨酸含量顯著升高,血漿谷氨酰胺含量顯著降低。可能說明在伊犁馬運(yùn)動過程中機(jī)體谷氨酰胺快速分解用于供能產(chǎn)生的谷氨酸。谷氨酸和谷氨酰胺可在體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化,運(yùn)動時谷氨酰胺可分解產(chǎn)生谷氨酸間接參與能量供應(yīng),運(yùn)動強(qiáng)度越大谷氨酰胺濃度下降越快[18]。骨骼肌中谷氨酰胺持續(xù)下降被認(rèn)為是過度訓(xùn)練的指標(biāo)之一[19]。Glu和Gln不僅能促進(jìn)氨代謝,還可促進(jìn)機(jī)體氧化供能。且運(yùn)動時Glu+丙酮酸=Ala+α-酮戊二酸反應(yīng)增強(qiáng),可減少乳酸生成[20-21]。

伊犁馬3 600 m速度賽后血漿亮氨酸、色氨酸含量顯著降低,犬尿氨酸含量升高。亮氨酸屬于支鏈氨基酸,可參與供能。在運(yùn)動過程中肌糖原減少,BCAA氧化參與供能,使得運(yùn)動后血漿中BCAA濃度下降[22]。色氨酸是5-羥色胺(5-HT)的前體,腦內(nèi)5-HT合成增加就是由于大腦吸收血液運(yùn)輸傳遞的游離Trp而引起的,可調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮系統(tǒng)。在運(yùn)動過程中BCAA濃度不僅與運(yùn)動供能有關(guān),也關(guān)系到腦中游離Trp的濃度,因?yàn)锽CAA能競爭結(jié)合Trp在血腦屏障上的載體-白蛋白通道[23-24],BCAA被氧化為骨骼肌收縮過程提供的能量,導(dǎo)致BCAA減少,減少競爭抑制使得更多游離Trp進(jìn)入到大腦中,利于5-HT的合成,造成中樞疲勞[25-26]。亮氨酸及其代謝通路對外周疲勞和中樞疲勞均可產(chǎn)生影響。亮氨酸、色氨酸及其涉及的代謝通路可作為營養(yǎng)調(diào)控的參考方向之一。

伊犁馬賽后血漿甜菜堿含量顯著降低?？赡苁窃谝晾珩R運(yùn)動過程中甜菜堿參與了能量代謝。甜菜堿以及膽堿主要是機(jī)體甲基供給物,其中一條甲基供給路線是機(jī)體肌酸合成代謝,甜菜堿可反應(yīng)生成蛋氨酸,然后在腺苷酶催化生成腺苷蛋氨酸(SAM)又經(jīng)過S-腺苷蛋氨酸-胍基乙酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GAMT)的催化下形成肌酸[27-28],參與磷酸原供能系統(tǒng)。因此甜菜堿-蛋氨酸循環(huán)也可作為營養(yǎng)調(diào)控的參考方向之一。

3.5脂質(zhì)中包括甘油三酯和類脂,而甘油三脂由脂肪酸和甘油合成,作為骨骼肌的主要能量來源,與耐力運(yùn)動性能的發(fā)揮有重要關(guān)系?？赡苡捎跈C(jī)體中脂肪細(xì)胞缺少甘油激酶,運(yùn)動中脂質(zhì)分解產(chǎn)生的甘油,必須通過血液送至肝臟進(jìn)行代謝[29],再參與三羧酸循環(huán)徹底氧化供能(氧充足)或糖異生產(chǎn)生乳酸(供氧不足)。伊犁馬在運(yùn)動過程中機(jī)體脂質(zhì)也參與了分解供能,使得血漿甘油含量升高。

運(yùn)動時糖酵解系統(tǒng)供能比例增加,并且當(dāng)生成CoA的速率大于檸檬酸的利用率時,肉堿則充當(dāng)乙?；氖荏w生成乙酰肉堿[30],伊犁馬3 600m速度賽后血漿混旋肉堿含量降低,乙酰左旋肉堿含量顯著升高。左旋肉堿是可運(yùn)輸脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行TCA和β-氧化循環(huán)[31]。研究證明,適當(dāng)補(bǔ)充左旋肉堿可改善脂肪代謝,進(jìn)而改善機(jī)體有氧能力[32]。肉毒堿也可作為營養(yǎng)調(diào)控的參考方向之一。

伊犁馬在3 600 m速度賽中參與能量供應(yīng)的代謝物變化最為顯著。運(yùn)動前期磷酸原供能系統(tǒng)快速供能[33],甜菜堿、蛋氨酸參與肌酸合成,運(yùn)動前后變化顯著。磷酸原供能短暫時間后轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跹趸┠?線粒體三羧酸循環(huán)供能、葡萄糖氧化、氨基酸(支鏈氨基酸)氧化、脂肪氧化加強(qiáng),促進(jìn)肌肉供能。隨后氧氣供應(yīng)不足,供能方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒夤┠?。運(yùn)動后期主要依賴脂肪(甘油)經(jīng)過甘油激酶等催化作用生成磷酸二羥丙酮作用下進(jìn)行糖酵解或者參與β-氧化供能。伊犁馬在比賽期間呈現(xiàn)無氧、有氧以及混氧的代謝特點(diǎn)。因此,在考慮調(diào)控運(yùn)動馬運(yùn)動性能方面,提高馬匹運(yùn)動過程中供能物質(zhì)的供給具有重要意義。其次,運(yùn)動過程中糖酵解供能時間較長,乳酸、氨等代謝物的堆積導(dǎo)致力的衰減,減少代謝廢物的堆積以及加速代謝物的排出對于運(yùn)動性能的提高以及運(yùn)動后疲勞恢復(fù)也很重要。谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸等功能性氨基酸可能對于代謝廢物的排出或減少產(chǎn)生有積極作用。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果,供能物質(zhì)亮氨酸、甘油、蛋氨酸、甜菜堿以及功能物質(zhì)色氨酸、谷氨酰胺、肉毒堿這幾類物質(zhì)涉及的調(diào)節(jié)通路可能為運(yùn)動馬營養(yǎng)調(diào)控提供參考。

4 結(jié) 論

基于LC/MS伊犁馬血漿代謝組學(xué)的分析,3 600m速度賽伊犁馬機(jī)體呈現(xiàn)出無氧、有氧以及混氧代謝的特點(diǎn)。伊犁馬3 600 m速度賽前、賽后血漿樣本的LC/MS代謝譜存在差異,涉及檸檬酸循環(huán)、糖酵解系統(tǒng)以及脂肪代謝、氨基酸代謝等過程。其中,亮氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甜菜堿、甘油、肉毒堿這幾類物質(zhì)涉及的調(diào)節(jié)通路可能為運(yùn)動馬營養(yǎng)補(bǔ)劑的研發(fā)提供參考。