JWH133對(duì)右旋糖酐鐵過載小鼠脾臟鐵代謝影響

［摘要］ 目的 探討激活大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）對(duì)右旋糖酐鐵處理的鐵過載模型小鼠脾臟鐵代謝的影響。

方法 將18只9周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、右旋糖酐鐵組、JWH133（CB2受體激動(dòng)劑）+右旋糖酐鐵組。應(yīng)用鐵檢測(cè)試劑盒（比色法）檢測(cè)各組小鼠脾臟鐵水平，采用Western blot法檢測(cè)脾臟轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TFR1）和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FPN1）的表達(dá)。

結(jié)果 與對(duì)照組相比，右旋糖酐鐵組小鼠脾臟總鐵含量和Fe3+含量明顯升高（F=12.710、8.352，q=6.980、5.698，P＜0.01），F(xiàn)e2+含量有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；JWH133預(yù)處理抑制右旋糖酐鐵造成的總鐵含量和Fe3+含量的升高（q=4.747、3.687，P＜0.05）。與對(duì)照組相比，右旋糖酐鐵組小鼠脾臟TFR1表達(dá)顯著升高（F=12.090，q=6.859，P＜0.01）；JWH133預(yù)處理抑制右旋糖酐鐵引起的TFR1蛋白表達(dá)上調(diào)（q=4.419，P＜0.05）。3組小鼠脾臟FPN1表達(dá)比較差異無(wú)顯著性（F=1.152，P＞0.05）。

結(jié)論 激活CB2受體可以抑制右旋糖酐鐵引起的小鼠脾臟鐵水平增高以及TFR1蛋白表達(dá)上調(diào)，CB2受體可能通過調(diào)節(jié)TFR1蛋白表達(dá)介導(dǎo)小鼠脾臟鐵的聚集。

［關(guān)鍵詞］ 受體，大麻酚，CB2；鐵右旋糖酐復(fù)合物；脾；受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白；小鼠

［中圖分類號(hào)］ R338.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096－5532（2023）02－0199－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.033

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

大麻素的生物學(xué)效應(yīng)主要由G蛋白偶聯(lián)受體家族的兩個(gè)成員大麻素Ⅰ型受體（CB1受體）和大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）介導(dǎo)。CB1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，參與各種腦功能的調(diào)節(jié)，包括執(zhí)行力和記憶處理等，被稱為“中樞型”大麻素受體。而CB2受體則被認(rèn)為是“外周型”大麻素受體，主要分布在外周組織中，如脾臟邊緣區(qū)、扁桃體、胸腺等。近年來(lái)的研究表明，CB2受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也廣泛表達(dá)，并參與多巴胺相關(guān)的行為調(diào)節(jié)，包括抑郁癥、焦慮和精神分裂癥等。有研究表明，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與了機(jī)體鐵代謝相關(guān)疾病的發(fā)生。在HEK293T細(xì)胞中，CB2受體通過抑制二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體磷酸化來(lái)介導(dǎo)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)。本課題組的前期研究也證實(shí)，JWH133（CB2受體激動(dòng)劑）激活CB2受體能夠抑制1－甲基－4－苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞鐵攝取。但大麻素系統(tǒng)對(duì)全身鐵代謝的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用右旋糖酐鐵建立鐵過載小鼠模型，用JWH133進(jìn)行預(yù)處理，觀察小鼠脾臟鐵水平以及鐵代謝相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TFR1）、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FPN1）的表達(dá)，探討JWH133激活CB2受體是否影響小鼠脾臟鐵的聚集及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)9周齡雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。飼養(yǎng)條件：溫度（21±1）℃，濕度（50±5）%，12 h晝夜循環(huán)光照，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1周。

1.1.2 主要試劑 右旋糖酐鐵購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司；CB2受體激動(dòng)劑JWH133購(gòu)自美國(guó)APE×BIO公司；鐵檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TFR1抗體購(gòu)自中國(guó)正能生物公司；FPN1抗體購(gòu)自以色列Alomone Labs公司；β－actin抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自中國(guó)愛必信公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)于中國(guó)雅酶公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將18只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、右旋糖酐鐵組（B組）和JWH133＋右旋糖酐鐵組（C組），每組6只。右旋糖酐鐵組小鼠每天給予右旋糖酐鐵100 mg/kg腹腔注射，構(gòu)建鐵過載小鼠模型；JWH133+右旋糖酐鐵組小鼠每天先腹腔注射1 mg/kg的JWH133，4 h后再腹腔注射100 mg/kg的右旋糖酐鐵；對(duì)照組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水。持續(xù)腹腔注射15 d后處死小鼠，取脾臟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 脾臟鐵含量檢測(cè) 使用鐵檢測(cè)試劑盒（比色法）測(cè)定小鼠脾臟鐵含量。首先將脾臟用預(yù)冷的PBS洗滌，在鐵檢測(cè)緩沖液中勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中，將收集的上清液和鐵還原劑混勻后加入96孔板中，37 ℃孵育30 min。最后，每孔分別加入鐵探針，37 ℃孵育1 h，在比色酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度（波長(zhǎng)為593 nm）。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)脾臟TFR1和FPN1的表達(dá) 脾臟組織按每4 mg 100 μL加入裂解液，充分研磨后冰上裂解30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，提取上清。用 BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按1∶4比例加入Loading buffer，金屬浴100 ℃煮5 min。蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳（電壓80～120 V）后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含有50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h后，將PVDF膜分別放入TFR1（1∶1 000）、FPN1（1∶1 000） 和β－actin（1∶10 000）一抗溶液中，4 ℃搖床過夜孵育。加HRP偶聯(lián)的二抗（用TBST稀釋至1∶10 000），室溫孵育1 h。用UVP Bio Doc－It成像系統(tǒng)（美國(guó)Upland）和ECL高靈敏化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Image J分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA檢驗(yàn)），組間兩兩比較采用Turkey法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 JWH133對(duì)右旋糖酐鐵處理小鼠脾臟鐵水平的影響

與對(duì)照組相比，右旋糖酐鐵組總鐵含量明顯升高，F(xiàn)e3+含量升高也較為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.710、8.352，q=6.980、5.698，P＜0.01）；Fe2+含量有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與右旋糖酐鐵組相比，JWH133＋右旋糖酐鐵組總鐵含量和Fe3+含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.747、3.687，P＜0.05）。見表1。

2.2 JWH133對(duì)右旋糖酐鐵處理小鼠脾臟TFR1和FPN1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，右旋糖酐鐵組小鼠脾臟TFR1蛋白的表達(dá)顯著升高（F=12.090，q=6.859，P＜0.01）；與右旋糖酐鐵組相比，JWH133＋右旋糖酐鐵組TFR1蛋白的表達(dá)顯著降低（q=4.419，P＜0.05）。3組小鼠脾臟FPN1蛋白表達(dá)比較差異無(wú)顯著性（F=1.152，P＞0.05）。見表1。

3 討 論

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)主要由內(nèi)源性大麻素、大麻素受體以及負(fù)責(zé)生成、轉(zhuǎn)運(yùn)和水解大麻素的各種調(diào)節(jié)因子組成。大麻素受體與G蛋白偶聯(lián)，通過抑制腺苷酸環(huán)化酶和電壓門控鈣通道（例如N型、P/Q型和L型鈣電流）介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活絲裂原活化蛋白激酶和向內(nèi)整流鉀離子通道。目前臨床上應(yīng)用的大麻素受體激動(dòng)劑如大麻醇、屈大麻酚、Δ9－四氫大麻酚和大麻二酚均為CB1受體/CB2受體的非選擇性激動(dòng)劑。已有研究表明，這些非選擇性激動(dòng)劑引起的不良反應(yīng)大多來(lái)自CB1受體而不是CB2受體，因此CB2受體選擇性激動(dòng)劑在臨床應(yīng)用上會(huì)有許多優(yōu)勢(shì)。CB2受體作為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，主要存在于外周免疫器官和免疫組織中，如脾臟邊緣區(qū)。激活CB2受體在心血管、胃腸道、肝臟、腎臟、肺相關(guān)疾病中發(fā)揮組織保護(hù)作用。此外，CB2受體在神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物模型中發(fā)揮抗炎和保護(hù)作用。CB2受體激活還可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并改善神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)功能缺陷和延緩疾病的進(jìn)展。在1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)損傷的模型小鼠中使用CB2受體激動(dòng)劑AM1241，可以減輕MPTP對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷作用。

鐵作為人體內(nèi)必需的微量元素之一，參與氧輸送、線粒體呼吸以及DNA的合成，是神經(jīng)遞質(zhì)及髓鞘蛋白合成重要酶的輔基，對(duì)能量代謝、氧化還原平衡、氧氣運(yùn)輸以及炎癥反應(yīng)等基本生物學(xué)過程都具有重要的作用。生物體內(nèi)存在許多生理過程來(lái)確保鐵穩(wěn)態(tài)。有研究報(bào)道，大麻素可以通過激活CB2受體抑制HEK293T細(xì)胞對(duì)鐵的攝入，激活CB2受體也能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞鐵攝取。本室前期研究表明，JWH133可以通過激活CB2受體來(lái)抑制MPP+誘導(dǎo)的SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)的鐵水平升高。鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)維持人類機(jī)體正常代謝起著不可或缺的作用。本研究使用鐵染色試劑盒采用比色法檢測(cè)小鼠脾臟鐵含量，結(jié)果表明，右旋糖酐鐵引起脾臟總鐵含量和Fe3+含量明顯升高，使用JWH133預(yù)處理可明顯抑制右旋糖酐鐵引起的脾臟總鐵含量和Fe3+含量升高，提示JWH133激活脾臟CB2受體可以減少右旋糖酐鐵引起的脾臟鐵聚集。攝入鐵的膜蛋白TFR1是鐵代謝所必需的，它可以將Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)體中，在核內(nèi)體中Fe3+進(jìn)一步被還原成為Fe2+。最終，在二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的介導(dǎo)下，F(xiàn)e2+從核內(nèi)體釋放到胞質(zhì)內(nèi)不穩(wěn)定鐵池中。一部分鐵可以通過FPN1輸出細(xì)胞，而多余的鐵則以鐵蛋白輕鏈和鐵蛋白重鏈1的形式儲(chǔ)存在細(xì)胞胞質(zhì)中。這些鐵代謝相關(guān)蛋白的異常表達(dá)或功能失調(diào)將會(huì)使細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度因代謝失衡而升高。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，使用CB2受體激動(dòng)劑JWH133預(yù)處理激活CB2受體能夠抑制右旋糖酐鐵誘導(dǎo)的脾臟TFR1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示TFR1參與脾臟的鐵沉積過程，但激活CB2受體調(diào)控脾臟TFR1蛋白表達(dá)的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究用小鼠鐵過載模型初步探討了CB2受體在脾臟鐵代謝中的作用，結(jié)果提示，激活CB2受體參與了右旋糖酐鐵引起的小鼠脾臟鐵過載，其可能的機(jī)制是通過抑制鐵代謝相關(guān)蛋白TFR1的表達(dá)來(lái)減少鐵的攝入。本文研究結(jié)果為治療鐵代謝相關(guān)疾病提供了新的方向，但還需要進(jìn)一步研究其所涉及的機(jī)制。

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（本文編輯 馬偉平）