激活CB2受體對(duì)MPP+誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和Arg-1表達(dá)的影響

［摘要］ 目的 探討激活大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）對(duì)1－甲基－4－苯基吡啶離子（MPP+）處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2表型轉(zhuǎn)化的影響。

方法 培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，將其分為對(duì)照組、MPP+組、JWH133（CB2受體激動(dòng)劑）＋MPP＋組、AM630（CB2受體抑制劑）＋MPP＋組、JWH133＋AM630＋MPP＋組。應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)各組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶－1（Arg－1）蛋白的表達(dá)。

結(jié)果 與對(duì)照組相比，MPP+組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)明顯上升（F=9.825，q=6.346，P＜0.01）；JWH133預(yù)處理抑制MPP+誘導(dǎo)的iNOS蛋白的上調(diào)（q=5.714，P＜0.01），此抑制作用可被AM630逆轉(zhuǎn)（q=4.154，P＜0.05）。與MPP+組相比，JWH133預(yù)處理顯著上調(diào)Arg－1蛋白表達(dá)水平（F=5.800，q=5.520，P＜0.01），此作用可被AM630所阻斷（q=4.155，P＜0.05）。

結(jié)論

激活CB2受體可抑制MPP+處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，并且促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型轉(zhuǎn)化為M2型。

［關(guān)鍵詞］ 受體，大麻酚，CB2；大麻素受體激動(dòng)劑；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；表型；一氧化氮合酶Ⅱ型；精氨酸酶

［中圖分類號(hào)］ R338.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096－5532（2023）02－0195－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.022

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230303.0855.003.html;2023－03－03 16：37：49

帕金森?。≒D）是一種以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退化為特征的神經(jīng)退行性疾病。神經(jīng)炎癥是PD的主要病理因素之一，小膠質(zhì)細(xì)胞是參與調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的重要細(xì)胞。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞分為經(jīng)典激活型（M1型）和選擇性激活型（M2型）。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生促炎遞質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、白細(xì)胞介素1β（IL－1β）等；M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如精氨酸酶－1（Arg－1）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）等。因此，有效調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的表型狀態(tài)，可能成為未來(lái)治療PD的新策略。

近些年研究表明，大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞上，激活CB2受體可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥。有研究報(bào)道，激活CB2受體可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化，進(jìn)而減輕出血性腦病的腦損傷。然而，激活CB2受體對(duì)1－甲基－4－苯基吡啶離子（MPP+）處理的小膠質(zhì)細(xì)胞表型影響目前尚不清楚。本研究應(yīng)用MPP+處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞建立體外PD模型，觀察CB2受體激動(dòng)劑JWH133對(duì)MPP＋誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞不同表型標(biāo)志物iNOS和Arg－1表達(dá)的影響，以及CB2受體拮抗劑AM630的阻斷效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries（BI）公司；青霉素/鏈霉素溶液購(gòu)自索萊寶公司；MPP+、CB2受體激動(dòng)劑JWH133和CB2受體抑制劑AM630購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司；兔抗iNOS和β－actin抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；兔抗Arg－1抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自中國(guó)愛(ài)必信公司；ECL發(fā)光液購(gòu)于中國(guó)雅酶公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01的青霉素/鏈霉素。細(xì)胞置于溫度為37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行傳代，將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于六孔板中，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將BV2細(xì)胞分為對(duì)照組（A組）、MPP＋組（B組）、JWH133＋MPP＋組（C組）、AM630＋MPP＋組（D組）以及JWH133＋AM630＋MPP＋組（E組）。A組不做任何處理；B組使用200 μmol/L的MPP+處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h；C組先加入1 μmol/L的JWH133預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞40 min，再加入200 μmol/L的MPP+共處理細(xì)胞24 h；D組先加入1 μmol/L的AM630預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞40 min，再加入200 μmol/L MPP+共處理細(xì)胞24 h；E組同時(shí)使用1 μmol/L的JWH133和1 μmol/L的AM630預(yù)處理細(xì)胞40 min，再加入200 μmol/L MPP+共處理細(xì)胞24 h。

1.3 免疫印跡法檢測(cè)iNOS和Arg－1蛋白的表達(dá)

各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)藥物處理后，用PBS洗滌3次，每孔加入100 μL RIPA裂解緩沖液冰上裂解30 min。

用刮板將細(xì)胞刮下，經(jīng)離心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）提取細(xì)胞蛋白。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將含有20 μg蛋白質(zhì)的樣品通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，

隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將膜放進(jìn)50 g/L 脫脂牛奶中，室溫封閉2 h，分別加入iNOS（1∶2 000）、Arg－1（1∶1 000）和β－actin（1∶5 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG（1∶10 000）二抗室溫孵育1 h。應(yīng)用ECL發(fā)光液顯影，然后使用Image J軟件分析iNOS和Arg－1蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA），然后采用Turkey法進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 JWH133對(duì)MPP+處理的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比較，MPP+組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（F=9.825，q=6.346，P＜0.01）；與MPP+組比較，JWH133＋MPP＋組iNOS蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=5.714，P＜0.01）；而JWH133的作用可以被AM630逆轉(zhuǎn)，JWH133＋AM630＋MPP＋組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)水平較JWH133＋MPP＋組有所上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.154，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 JWH133對(duì)MPP+處理的小膠質(zhì)細(xì)胞Arg－1蛋白表達(dá)的影響

與MPP+組相比較，JWH133＋MPP＋組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Arg－1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.800，q=5.520， P＜0.01）；而JWH133＋AM630＋MPP＋組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Arg－1蛋白的表達(dá)水平較JWH133＋MPP＋組有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.155，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 討 論

PD是全球第二常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其典型的臨床癥狀有靜止性震顫、姿勢(shì)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)遲緩和肌僵直等。PD發(fā)病過(guò)程中，伴隨著過(guò)度的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等病理改變，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失。目前，左旋多巴替代治療是臨床治療PD的重要手段，但是卻不能抑制PD的進(jìn)展。因此，探究導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡的確切機(jī)制，有針對(duì)性地尋找治療靶點(diǎn)，是目前改善PD療效的關(guān)鍵。神經(jīng)炎癥是促使PD進(jìn)展的重要病理因素。TIWARI等發(fā)現(xiàn)，過(guò)度的神經(jīng)炎癥會(huì)破壞神經(jīng)元。并且有研究表明，在PD病人的大腦黑質(zhì)中，小膠質(zhì)細(xì)胞被異常激活，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能是影響PD進(jìn)展的重要因素之一。小膠質(zhì)細(xì)胞具有高度可塑性的特征，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)兩種表型，包括促炎的M1型和抗炎的M2型。在神經(jīng)退行性疾病中會(huì)伴隨著慢性炎癥，導(dǎo)致不同表型小膠質(zhì)細(xì)胞的比例失衡。有研究報(bào)道，米諾環(huán)素能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化，抑制M1極化，有助于神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復(fù)?，F(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為，促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型可改善周圍神經(jīng)元的炎癥，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)，大麻素具有神經(jīng)保護(hù)和調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)的功能。有體外實(shí)驗(yàn)研究表明，Δ9四氫大麻二醇（Δ9－THC）能抵抗1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，可能是治療PD的有前途的藥物。而大麻素的生理效應(yīng)主要是由大麻素Ⅰ型受體（CB1受體）和CB2受體介導(dǎo)的。其中CB2受體主要在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，研究表明，存在慢性炎癥的大腦組織中，CB2受體聚集于激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中。CB2受體敲除的小鼠大腦中，神經(jīng)炎癥水平明顯升高?，F(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為，CB2受體的神經(jīng)保護(hù)作用是由于其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響，激活CB2受體促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由具有神經(jīng)損傷作用的M1型轉(zhuǎn)化為具有神經(jīng)保護(hù)作用的M2型。本研究應(yīng)用MPP+制備體外PD模型，探究激活CB2受體對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響。結(jié)果顯示，MPP+處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)顯著增加，表明BV2小膠質(zhì)細(xì)胞主要為M1型；CB2受體激動(dòng)劑JWH133預(yù)處理可抑制MPP+誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達(dá)上調(diào)，表明激活CB2受體對(duì)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制作用。進(jìn)一步使用CB2受體抑制劑AM630進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示JWH133的作用被阻斷。此外，MPP+處理的小膠質(zhì)細(xì)胞Arg－1蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。推測(cè)產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因是：①M(fèi)PP+是具有神經(jīng)毒性的藥物，可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，對(duì)于抗炎因子Arg－1的釋放無(wú)直接作用；②小膠質(zhì)細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)MPP+的毒性刺激產(chǎn)生了自我抗炎的保護(hù)作用，從而使Arg－1的水平保持不變；③MPP+對(duì)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的影響更顯著，本實(shí)驗(yàn)中MPP+的用量可能對(duì)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞未產(chǎn)生明顯的影響。本文研究結(jié)果與之前的有關(guān)研究結(jié)果一致。本文結(jié)果還顯示，JWH133預(yù)處理顯著上調(diào)Arg－1蛋白表達(dá)水平，表明激活CB2受體促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，而該作用可以被AM630逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，JWH133激活CB2受體可以抑制MPP+處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，同時(shí)促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化。本文結(jié)果為以激活CB2受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化作為靶點(diǎn)的PD治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但是CB2受體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)作用仍未明確。有研究表明，JWH133通過(guò)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶1（HO－1）通路改善促炎M1巨噬細(xì)胞極化，從而顯示出抗肥胖炎癥作用。另外有研究表明，JWH133可通過(guò)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）途徑促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化，參與生發(fā)基質(zhì)出血誘導(dǎo)后CB2受體介導(dǎo)的抗炎作用。因此，JWH133對(duì)MPP+誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表型調(diào)節(jié)作用可能也與cAMP/PKA或者Nrf2/HO－1通路相關(guān)，但具體的機(jī)制通路仍需要進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）