寄主誘導(dǎo)的基因沉默干擾核盤(pán)菌致病基因OAH在甘藍(lán)型油菜抗菌核病中的應(yīng)用

楊一丹 何 督 劉 靜 張 巖 陳飛志 巫燕飛 杜雪竹,*

寄主誘導(dǎo)的基因沉默干擾核盤(pán)菌致病基因在甘藍(lán)型油菜抗菌核病中的應(yīng)用

楊一丹1何 督1劉 靜2張 巖1陳飛志1巫燕飛1杜雪竹1,*

1湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 省部共建生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062;2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062

油菜是我國(guó)第一大油料作物, 菌核病是我國(guó)油菜面臨的主要病害之一。本試驗(yàn)利用HIGS技術(shù)將核盤(pán)菌中關(guān)鍵致病基因()的干擾片段轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜中, 獲得含有siRNA的轉(zhuǎn)基因油菜植株, 研究HIGS介導(dǎo)的基因沉默對(duì)油菜抗菌核病的影響。接種核盤(pán)菌后的抗病鑒定結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因油菜植株對(duì)核盤(pán)菌抗性增強(qiáng); R18、R25和R36株系葉片接菌后病斑部位核盤(pán)菌菌絲內(nèi)的基因表達(dá)量均低于野生型, 證明siRNA在轉(zhuǎn)基因油菜中成功表達(dá); 在添加了轉(zhuǎn)基因油菜葉片提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的核盤(pán)菌擴(kuò)展面積顯著小于野生型, 分別降低35.29%、21.98%、31.53%, 且菌絲生長(zhǎng)顯著遲緩, 擴(kuò)展長(zhǎng)度較短, 分支少, 生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生斷裂, 生長(zhǎng)異常, 將其接種于正常的野生型油菜后, 其致病力明顯下降; 對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜葉片接種核盤(pán)菌后觀察發(fā)現(xiàn), 葉片上的菌絲擴(kuò)展較為稀疏, 生長(zhǎng)受阻, 侵染墊形成受到抑制, 暗示在油菜中表達(dá)基因的干擾片段影響了菌絲生長(zhǎng)和擴(kuò)展; 進(jìn)一步檢測(cè)其病斑組織中的草酸含量發(fā)現(xiàn), 接菌36 h、48 h后轉(zhuǎn)基因油菜病斑組織中的草酸含量為391 μg g–1、446 μg g–1, 與野生型相比分別減少54 μg g–1、32 μg g–1。這一研究表明在油菜中表達(dá)核盤(pán)菌的干擾片段能夠降低核盤(pán)菌侵染時(shí)草酸的積累, 從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)核盤(pán)菌的抗性水平。本試驗(yàn)利用HIGS技術(shù)研究了干擾核盤(pán)菌關(guān)鍵致病基因增強(qiáng)油菜對(duì)核盤(pán)菌的抗性, 為選育油菜抗菌核病品種提供理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源。

甘藍(lán)型油菜; 核盤(pán)菌; HIGS; 草酰乙酸乙酰水解酶; 草酸

核盤(pán)菌()是一種具有非寄生專(zhuān)一性、侵襲性和壞死性的腐生型真菌, 能夠侵害600多種植物, 包括油菜、大豆、向日葵和一些蔬菜作物[1-2]。油菜作為我國(guó)最重要的油料作物之一, 常年受到核盤(pán)菌的侵害, 每年造成油菜減產(chǎn)10%～20%, 嚴(yán)重的甚至高達(dá)80%, 影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。目前防治核盤(pán)菌的措施主要包括化學(xué)農(nóng)藥防治、物理防治、生物防治等, 但由于核盤(pán)菌主要是以菌核的形式存在于土壤和病株殘?bào)w中進(jìn)行越冬越夏, 能夠生存長(zhǎng)達(dá)7年之久, 且生命力頑強(qiáng), 難以消除[5-7]。農(nóng)業(yè)上主要以化學(xué)藥劑防治為主, 然而該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 長(zhǎng)時(shí)間施用后易使核盤(pán)菌產(chǎn)生耐藥性, 降低防治效果。因此, 培育抗(耐)菌核病油菜品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑。

核盤(pán)菌主要通過(guò)分泌細(xì)胞壁降解酶、草酸及致病分泌蛋白參與侵染寄主植物, 并發(fā)揮重要作用。早期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 利用紫外誘變技術(shù)能使核盤(pán)菌中的草酸合成受到影響, 導(dǎo)致該突變體的致病能力下降, 證明了草酸在核盤(pán)菌致病中的重要作用[8]。病菌中的草酸能夠降低寄主病斑部位及周?chē)膒H, 營(yíng)造適合菌核發(fā)育的環(huán)境, 抑制寄主抗病相關(guān)酶的活性, 從而使病菌產(chǎn)生更多的胞外酶, 加速核盤(pán)菌對(duì)寄主細(xì)胞的降解[9]。草酸還能夠螯合寄主細(xì)胞中的Ca2+, 阻斷寄主細(xì)胞的鈣離子信號(hào)通路, 并且在侵染初期抑制寄主活性氧的爆發(fā)、防衛(wèi)反應(yīng)和防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 同時(shí)損傷細(xì)胞釋放的鈣離子濃度, 使生長(zhǎng)中的菌絲免受毒性鈣離子濃度的影響[10-11]。草酸的合成主要通過(guò)草酰乙酸乙酰水解酶(axaloacetate acetylhydrolase, OAH)催化水解草酰乙酸生成草酸[12]。核盤(pán)菌中的被證實(shí)是OA生物合成的調(diào)控樞紐[13]。

最近的研究進(jìn)展表明, 小RNA誘導(dǎo)的基因沉默可以提高寄主抗性, 擴(kuò)大抗病資源[14]。這種方法主要是小RNA在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平上抑制目的基因表達(dá)。宿主誘導(dǎo)基因沉默(host-induced gene silencing, HIGS)就是隨著該技術(shù)發(fā)展而來(lái)的一種便捷高效的研究手段。該技術(shù)主要通過(guò)針對(duì)病原微生物的目的基因設(shè)計(jì)干擾片段, 將含有干擾片段的載體導(dǎo)入寄主中進(jìn)行表達(dá), 產(chǎn)生的dsRNA分子被DCL酶切割成21～24 nt的siRNA, 與寄主中的AGOs蛋白結(jié)合形成復(fù)合物, 從而靶向沉默病原生物的特定序列, 抑制寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng), 通過(guò)降解目的基因的mRNA而使該基因的轉(zhuǎn)錄水平下降, 進(jìn)而使寄主植物對(duì)病原生物產(chǎn)生抗性。

本試驗(yàn)選取核盤(pán)菌侵染油菜的關(guān)鍵致病基因, 利用HIGS技術(shù)將的干擾片段導(dǎo)入油菜體內(nèi), 靶向降解該基因, 抑制草酸合成, 提高油菜對(duì)核盤(pán)菌的抗性, 從而創(chuàng)建一批能夠干擾核盤(pán)菌致病的高抗性油菜株系, 為選育油菜抗菌核病品種提供理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為甘藍(lán)型油菜Westar品種, 種植于湖北大學(xué)溫室及培養(yǎng)箱, 培養(yǎng)溫度為23℃, 光周期為18 h光培養(yǎng), 6 h 暗培養(yǎng)。核盤(pán)菌菌種為本實(shí)驗(yàn)室保存, 活化條件為23℃暗培養(yǎng)。大腸桿菌DH5α、Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)均為本實(shí)驗(yàn)室保存; DNA marker (DL2000)、逆轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser)購(gòu)買(mǎi)于TaKaRa公司; 植物RNA提取試劑盒購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司; 瓊脂、乙酰丁香酮、Tris飽和酚購(gòu)于Sigma公司; MES、甘露醇購(gòu)于iosharp公司; MS培養(yǎng)基粉末購(gòu)于武漢天源慧達(dá)生物科技有限公司; 無(wú)水乙醇、蔗糖、氯化鈣等常規(guī)試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; Easy酶、T4-DNA連接酶、2K DNA marker (Trans 2K)購(gòu)買(mǎi)于全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HIGS沉默表達(dá)載體的構(gòu)建 取20～22℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)了36 h的核盤(pán)菌菌絲, 提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板, 選擇合適的目的基因干擾序列, 將OAH干涉片段(OAH-s/OAH-as)和中間link序列片段使用引物OAH-sF和OAH- ovlapsR進(jìn)行PCR擴(kuò)增; 將正向干涉片段(OAH-s)與中間link序列使用引物OAH-asF和OAH-asR通過(guò)PCR重疊延伸技術(shù)連接到一起, 之后進(jìn)行膠回收。

將回收的干涉片段產(chǎn)物克隆至pEasy-Blunt載體上, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中培養(yǎng), 挑選克隆進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。選擇pCAMBIA1301載體中的I與I酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切, 膠回收線(xiàn)性載體質(zhì)粒。I與I酶切Ri02s-W載體, 選擇I與I酶切位點(diǎn), 雙酶切Ri02as載體后均回收相應(yīng)的外源片段, 利用T4DNA連接酶連接回收的線(xiàn)性載體質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因油菜的獲得與鑒定 采用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法, 用含有RNAi干擾載體的農(nóng)桿菌侵染甘藍(lán)型油菜Westar的下胚軸, 經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、分化培養(yǎng)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因油菜。利用PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因中油菜植株中潮霉素抗性基因和RNAi干擾片段是否存在, 篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因油菜植株。

1.2.3 qRT-PCR表達(dá)量分析 各取3片野生型和轉(zhuǎn)基因油菜植株葉片進(jìn)行接菌, 在接菌24、36、48、60、72 h后取油菜葉片病斑部位核盤(pán)菌菌絲, 使用上海生工生物工程有限公司提供的真菌總RNA提取試劑盒提取核盤(pán)菌菌絲RNA。利用TaKaRa Bio提供的反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒, 對(duì)抽提后的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)q-PCR特異性引物檢測(cè)基因表達(dá)量, 使用CFX ConnectReal-time System熒光定量PCR儀進(jìn)行分析, 采用2–ΔΔCt法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)量的差異表達(dá)分析, 每個(gè)樣本設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因油菜植株抗病性鑒定 離體葉片接菌:將核盤(pán)菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化2次。各取3片生長(zhǎng)6～8周, 生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的油菜葉片。接菌后注意保濕, 并放置于22℃暗培養(yǎng)箱中, 分別在接菌不同時(shí)間后進(jìn)行觀察并照相, 使用ImageJ統(tǒng)計(jì)其病斑面積, 試驗(yàn)重復(fù)3次。

活體莖稈接菌: 選取距離地面20～60 cm處, 生長(zhǎng)狀態(tài)及莖稈大小一致的油菜, 將活化好的核盤(pán)菌菌塊用保鮮膜包裹, 接種于油菜莖稈上。選擇晴朗天氣進(jìn)行接種, 并做好保濕工作。接種4 d后將莖稈剪下照相并用標(biāo)尺測(cè)量病斑直徑。

幼苗接菌觀察: 配制200 mL PDB培養(yǎng)基, 放入5個(gè)核盤(pán)菌菌塊, 23℃、200轉(zhuǎn) min–1震蕩培養(yǎng)48 h。用紗布過(guò)濾菌絲, 再用20 mL PDB培養(yǎng)液重懸24 h。重懸完成后, 用無(wú)菌槍頭將菌球打碎, 用單層紗布將菌絲過(guò)濾, 即菌液制備完成。用定量移液槍將菌液接種在生長(zhǎng)10 d左右的油菜葉片上, 在接種后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣, 同株系油菜葉片各取3片, 試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 棉藍(lán)染色 在轉(zhuǎn)基因油菜葉片上接種菌液后, 觀察其發(fā)病情況。取不同時(shí)間點(diǎn)的6片油菜子葉, 放入50 mL的分裝管中, 固定液固定24～48 h。用去離子水洗滌后, 棉藍(lán)染色液染色1～2 h, 染色完成后二甲苯透明24 h, 最后制片鏡檢, 并在Model SZX2-ILLTQ體視顯微鏡下觀察照相。

1.2.6 油菜葉片提取物體外抗真菌 取生長(zhǎng)良好、狀態(tài)一致的野生型和轉(zhuǎn)基因油菜新鮮葉片5 g, 液氮研磨成粉狀, 配制buffer提取液(pH調(diào)節(jié)至6.8～7.0)。如表1所示, 量取30 mL buffer提取液, 混勻后離心20 min, 吸取上清液。去離子水與提取的上清液按1∶1的比例加入到PDA培養(yǎng)基中。將活化后的核盤(pán)菌接種至培養(yǎng)基中, 再次活化培養(yǎng)40 h, 置于Model SZX2-ILLTQ體視顯微鏡下觀察, 測(cè)量并統(tǒng)計(jì)菌絲擴(kuò)展長(zhǎng)度, 試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 草酸含量測(cè)定 本試驗(yàn)使用上海雙贏生物科技有限公司提供的植物(Plant)草酸(OA)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 核盤(pán)菌致病相關(guān)基因表達(dá)模式分析

為篩選核盤(pán)菌中的關(guān)鍵致病因子, 本試驗(yàn)對(duì)已經(jīng)報(bào)道的核盤(pán)菌侵染油菜后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析[15], 初步篩選到8個(gè)核盤(pán)菌壞死誘導(dǎo)分泌蛋白, 利用q-PCR對(duì)其進(jìn)行分析驗(yàn)證。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),()基因的表達(dá)量顯著高于其他致病基因。在接菌24 h時(shí), 核盤(pán)菌中()基因的表達(dá)顯著上升, 接菌48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高, 72 h時(shí)開(kāi)始下降(圖1)。表明, 在核盤(pán)菌侵染油菜過(guò)程中,()是核盤(pán)菌基因組中關(guān)鍵的致病因子。因此, 選擇基因構(gòu)建RNAi干擾載體。

圖1 核盤(pán)菌侵染野生型油菜后相關(guān)致病基因的表達(dá)情況

2.2 RNAi載體構(gòu)建及鑒定

根據(jù)NCBI公布的核盤(pán)菌基因序列進(jìn)行分析, 使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物, 以提取的核盤(pán)菌RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板, 擴(kuò)增出的干擾片段。擴(kuò)大培養(yǎng)載體菌株, 提取質(zhì)粒DNA, 以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增中間Link連接片段, 電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。

回收目的片段, 并以干涉片段和中間Link片段為模板, 采用PCR擴(kuò)增方式進(jìn)行重疊延伸, 將干涉片段和中間Link片段連接到一起, 再次膠回收PCR擴(kuò)增條帶, 連接到載體構(gòu)建成正向干涉中間載體, 將第一步得到的干涉片段連接到載體上構(gòu)建成反向干涉中間載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài), 挑取單菌落做PCR陽(yáng)性鑒定。

用I和I同時(shí)雙酶切pCAMBIA1300和正向干涉中間載體,I和I雙酶切反向干涉中間載體, 回收相應(yīng)片段, 用T4-DNA連接酶連接, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 挑取單菌落進(jìn)行陽(yáng)性鑒定(圖2)。擴(kuò)大培養(yǎng)后送公司測(cè)序, 干涉區(qū)域與預(yù)期結(jié)果一致, 序列正確無(wú)突變。將菌株提取質(zhì)粒后, 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中, 挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定, 并于–80℃保存。

圖2 OAH干擾終載體菌落PCR檢測(cè)

M: DL2000; 1～8: 菌落PCR片段。

M: DL2000; 1–8: the colony PCR fragments.

2.3 SS.OAH.RNAi轉(zhuǎn)基因油菜的獲得及抗病性鑒定

利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法將RNAi干擾載體轉(zhuǎn)化至甘藍(lán)型油菜Westar中, 通過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定共獲得9個(gè)陽(yáng)性株系。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因油菜的T0代植株進(jìn)行菌核病抗性鑒定后篩選出R18、R25、R36三個(gè)抗性植株, 自交繁育后獲得T2代穩(wěn)定遺傳材料(圖3)。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、大小一致的野生型和T2代轉(zhuǎn)基因油菜的葉片與莖稈, 接種核盤(pán)菌進(jìn)行抗性鑒定。對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜株系離體葉片接菌36 h后的結(jié)果發(fā)現(xiàn), R18、R25、R36轉(zhuǎn)基因株系葉片上的病斑面積明顯小于野生型, 其病斑面積分別降低11.68%、14.42%、15.06% (圖4-A, B)?；铙w莖稈接菌4 d后轉(zhuǎn)基因油菜莖稈的病斑直徑顯著低于野生型, 其分別降低33.07%、38.46%、35.38% (圖5-A, B)。表明轉(zhuǎn)基因油菜提高了對(duì)核盤(pán)菌的抗性。

圖3 T2代SS.OAH.RNAi轉(zhuǎn)基因植株部分陽(yáng)性鑒定凝膠電泳圖

M: Trans 2K; WT: 陰性對(duì)照。M: Trans 2K; WT: the negative control.

圖4 T2代SS.OAH.RNAi轉(zhuǎn)基因油菜株系離體葉片接菌36 h病斑面積統(tǒng)計(jì)圖

WT: 野生甘藍(lán)型油菜; R25、R36、R18為T(mén)2代轉(zhuǎn)基因株系材料。

WT: wild; R25, R36, and R18 are T2generationtransgenic lines.

WT: 野生甘藍(lán)型油菜; R25、R36、R18為T(mén)2代轉(zhuǎn)基因株系材料。

WT: wild; R25, R36, and R18 are T2generationtransgenic lines.

2.4 SS.OAH.RNAi轉(zhuǎn)基因油菜病斑組織部位菌絲內(nèi)SsOAH表達(dá)量分析

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因油菜株系抗性的提高是否由于siRNA降解核盤(pán)菌基因所導(dǎo)致的, 分別提取野生型與轉(zhuǎn)基因油菜植株接菌24、36、48、60、72 h后病斑部位核盤(pán)菌菌絲的RNA, 通過(guò)q-PCR分析核盤(pán)菌在侵染油菜時(shí)核盤(pán)菌菌絲體內(nèi)的基因的表達(dá)情況。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn), 與WT相比, R18株系葉片病斑組織上核盤(pán)菌菌絲中的表達(dá)量在接菌24～72 h過(guò)程中顯著下降, 在接菌36 h時(shí)表達(dá)量為最低, 72 h時(shí)達(dá)到峰值; R25和R36株系葉片病斑組織中的表達(dá)量在接菌24 h、36 h、48 h、60 h和72 h時(shí)均低于野生型。R25株系在接菌60 h時(shí)靶基因表達(dá)量下降顯著, 72 h時(shí)達(dá)到峰值。R36株系在接菌24 h時(shí)靶基因表達(dá)量達(dá)到峰值, 之后開(kāi)始逐漸下降, 接菌60 h后開(kāi)始升高(圖6)。表明,轉(zhuǎn)基因株系降低了核盤(pán)菌菌絲內(nèi)基因的表達(dá), siRNA在轉(zhuǎn)基因油菜中成功表達(dá), 靶向降解了基因的表達(dá)。

圖6 T2代SS.OAH.RNAi轉(zhuǎn)基因油菜葉片接菌后病斑部位核盤(pán)菌菌絲內(nèi)OAH基因的表達(dá)模式分析

WT: 野生甘藍(lán)型油菜; R25、R36、R18為T(mén)2代轉(zhuǎn)基因株系材料。

WT: wild; R25, R36, and R18 are T2generationtransgenic lines.

2.5 轉(zhuǎn)基因油菜葉片提取物抗病性鑒定

為進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)基因材料對(duì)核盤(pán)菌的抗性影響, 本試驗(yàn)萃取轉(zhuǎn)基因油菜葉片的提取物培養(yǎng)核盤(pán)菌并接種于野生型油菜葉片上, 進(jìn)一步驗(yàn)證基因材料對(duì)核盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響。

在添加了轉(zhuǎn)基因油菜葉片提取物的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)核盤(pán)菌, 培養(yǎng)40 h后觀察菌絲擴(kuò)展面積以及擴(kuò)展情況(圖7)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因材料(R18、R25、R36)葉片提取物制成的PDA培養(yǎng)的核盤(pán)菌菌絲的生長(zhǎng)受到明顯抑制, 擴(kuò)展面積與野生型相比顯著降低, 分別降低35.29%、21.98%、31.53% (圖7-A, B1～B5); 在體式顯微鏡下觀察核盤(pán)菌菌絲的生長(zhǎng)和擴(kuò)展情況發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因材料制成的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲, 其生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型油菜培養(yǎng)的菌絲相比, 擴(kuò)展長(zhǎng)度變短, 菌絲細(xì)密并且分支較少。其中R18和R36株系葉片提取物培養(yǎng)的菌絲在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生斷裂, 且生長(zhǎng)異常; R25株系葉片提取物培養(yǎng)的菌絲則生長(zhǎng)細(xì)密, 擴(kuò)展受限(圖7-B6～B10)。

(圖7)

WT: 野生甘藍(lán)型油菜; R25、R36、R18為T(mén)2代轉(zhuǎn)基因株系材料。Mock: PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的核盤(pán)菌; A:添加提取物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)核盤(pán)菌40 h后的菌絲擴(kuò)展面積統(tǒng)計(jì); B: 標(biāo)尺為1 cm; B1: 無(wú)添加萃取液的PDA活化的菌絲; B2: 添加了野生型油菜葉片萃取液活化的核盤(pán)菌; B3～B5為添加了轉(zhuǎn)基因油菜(R18、R25、R36)葉片萃取液活化的核盤(pán)菌; B6～B10: 分別對(duì)應(yīng)圖B1～B5在體視顯微鏡下觀察到的核盤(pán)菌菌絲生長(zhǎng)情況; C: 野生型油菜與轉(zhuǎn)基因油菜(R18、R25、R36)葉片提取物制成的培養(yǎng)基培養(yǎng)的核盤(pán)菌菌絲接種于野生型油菜后48 h的病斑擴(kuò)展情況, 標(biāo)尺為2 cm。

WT: wild; R25, R36, and R18 are T2generationtransgenic lines. Mock:cultured in PDA medium; A: the statistics of the expanded area of the culture disk after adding PDA to the mycelial extract for 40 hours; B: bar: 1 cm; B1: PDA activated hyphae without added extract; B2:activated by wild-type rape leaf extract; B3–B5 addedtransgenic rape (R18, R25, and R36) leaf extract; B6–B10: corresponding to the mycelial growth ofobserved under stereomicroscope in Fig. B1–B5 respectively. C: the expansion ofhyphae cultured in the medium made of wild-type rape and transgenic rape (R18, R25, and R36) leaf extract 48 hours after inoculation in wild-type rape. Bar: 2 cm.

將野生型油菜與轉(zhuǎn)基因油菜葉片提取物制成的培養(yǎng)基培養(yǎng)的核盤(pán)菌菌絲分別接種于正常的野生型油菜葉片48 h后發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因油菜葉片提取物制成的培養(yǎng)基培養(yǎng)的核盤(pán)菌致病能力明顯下降(圖7-C)。表明轉(zhuǎn)基因油菜葉片提取物能夠限制核盤(pán)菌菌絲的生長(zhǎng)和擴(kuò)展, 影響核盤(pán)菌的致病能力。

2.6 棉藍(lán)染色觀察轉(zhuǎn)基因油菜葉片接菌部位菌絲生長(zhǎng)及擴(kuò)展情況

進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)基因油菜株系接菌后, 核盤(pán)菌菌絲在葉片上的生長(zhǎng)及定殖情況。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在接菌12 h時(shí), 野生型與轉(zhuǎn)基因油菜葉片表面開(kāi)始出現(xiàn)少量菌絲, 說(shuō)明菌絲在野生型和轉(zhuǎn)基因材料葉片表面開(kāi)始定殖。其中R36株系葉片表面的菌絲與野生型無(wú)較大差異, 而R18和R25株系葉片表面的菌絲明顯較野生型少(圖8-A～D); 在接菌24 h時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因油菜的葉片表面菌絲增多(圖8-E～H)。與野生型相比, R18株系葉片上的菌絲分支較少, 侵染墊形成較為遲緩。R25株系葉片的菌絲分支與其他轉(zhuǎn)基因材料相比顯著減少, 菌絲生長(zhǎng)緩慢, 無(wú)侵染墊的形成。R36株系葉片上的菌絲生長(zhǎng)異常, 生長(zhǎng)緩慢且僅有少量侵染墊形成。說(shuō)明菌絲在轉(zhuǎn)基因油菜葉片上的生長(zhǎng)和侵染墊形成受到了影響(圖8-I～L)。在接菌36 h時(shí)核盤(pán)菌菌絲向外擴(kuò)展, R18株系葉片上的菌絲擴(kuò)展稀疏, 形成的圓頂型侵染墊顯著低于對(duì)照, R25和R36株系葉片上幾乎無(wú)侵染的形成(圖8-M～P)。表明,轉(zhuǎn)基因油菜早期可通過(guò)干擾菌絲定殖、侵染墊形成和菌絲擴(kuò)展來(lái)限制核盤(pán)菌的入侵。

2.7 草酸含量測(cè)定

核盤(pán)菌中草酸的合成主要通過(guò)草酰乙酸乙酰水解酶(OAH)催化草酰乙酸生成草酸和二氧化碳, 協(xié)助侵染寄主植物。因此, 本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)基因油菜葉片接菌36 h、48 h時(shí)病斑部位組織中的草酸含量, 驗(yàn)證核盤(pán)菌中基因的降解是否影響了病斑組織的草酸積累。

由圖9可知, 轉(zhuǎn)基因油菜葉片在接菌36 h時(shí)病斑部位組織中的草酸含量為391 μg g–1, 與野生型相比減少了54 μg g–1; 在接菌48 h時(shí), 轉(zhuǎn)基因油菜葉片病斑部位組織中的草酸含量為446 μg g–1, 與野生型相比減少了32 μg g–1。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因油菜能夠抑制核盤(pán)菌侵染時(shí)草酸的積累。

3 討論

已有的研究表明, HIGS技術(shù)靶向性高、通用性強(qiáng)、能夠沉默多拷貝基因, 在水稻、棉花、大麥、小麥等多種植物中均得到了應(yīng)用, 能夠有效干擾病原菌中的致病基因, 提高寄主對(duì)病原菌的抗性水平[16-19]。研究表明, 利用HIGS技術(shù), 在大豆中轉(zhuǎn)入靶向沉默基因的干擾片段后, 導(dǎo)致該基因的相對(duì)表達(dá)量下降, 提高了轉(zhuǎn)基因大豆菌核病的抗性[20]。另外, Kusum等[21]通過(guò)在擬南芥中表達(dá)的干擾片段發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因擬南芥病斑組織上菌絲內(nèi)的表達(dá)量和草酸量積累同時(shí)減少, 表明的沉默導(dǎo)致草酸含量降低。以上研究均證明了草酸在核盤(pán)菌侵染寄主時(shí)發(fā)揮的重要作用。

圖8 棉藍(lán)染色觀察油菜葉片接菌情況

WT: 野生甘藍(lán)型油菜; R25、R36、R18為T(mén)2代轉(zhuǎn)基因株系材料。

WT: wild; R25, R36, and R18 are T2generationtransgenic lines.

圖9 T2代SS.OAH.RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片病斑部位草酸含量測(cè)定

字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異值, 基于< 0.05的單因素方差分析。

Different lowercase letters represent statistically significant differences at< 0.05 based on one-way ANOVA.

本研究利用HIGS技術(shù), 選擇核盤(pán)菌的重要致病因子為目的基因, 構(gòu)建RNAi干擾載體, 創(chuàng)建的轉(zhuǎn)基因油菜植株提高了對(duì)菌核病的抗性。前期我們通過(guò)q-PCR檢測(cè)研究未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜葉片體內(nèi)的表達(dá), 推測(cè)插入的干擾片段需要經(jīng)過(guò)核盤(pán)菌才能誘導(dǎo)表達(dá)。之后通過(guò)檢測(cè)T2代轉(zhuǎn)基因油菜葉片接菌后病斑組織部位核盤(pán)菌菌絲中的表達(dá)驗(yàn)證了這一猜想。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因植株中的靶基因表達(dá)量低于野生型, 推測(cè)基因表達(dá)量的下降可能是由于油菜體內(nèi)siRNA的成功轉(zhuǎn)錄, 特異性靶向降解所導(dǎo)致。值得注意的是, 核盤(pán)菌侵染寄主時(shí)基因的表達(dá)量雖然有所下降, 草酸積累被抑制, 但抑制效果不佳。推測(cè)可能是由于不同的HIGS技術(shù)表達(dá)系統(tǒng)沒(méi)有產(chǎn)生足夠的沉默信號(hào)分子轉(zhuǎn)移至病原菌中, 導(dǎo)致沉默的基因較少,因此抑制草酸合成的能力下降[22-23]。

此外本研究還通過(guò)提取野生型和轉(zhuǎn)基因油菜葉片的粗蛋白制成PDA培養(yǎng)基, 從側(cè)面驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因材料的抗病性。棉藍(lán)染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因材料能夠影響核盤(pán)菌菌絲的生長(zhǎng)及擴(kuò)展, 而提取了轉(zhuǎn)基因油菜的粗蛋白制成的培養(yǎng)基活化的核盤(pán)菌菌絲與WT相比, 菌絲生長(zhǎng)及擴(kuò)展均受到了限制。推測(cè)RNA干擾片段可能以一種較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)存在于轉(zhuǎn)基因油菜組織中。值得注意的是, HIGS技術(shù)是將目的基因隨機(jī)插入植物基因組中, 具有一定的偶然性, 由于植物基因組以及體內(nèi)基因功能的復(fù)雜性, 可能會(huì)影響寄主中某個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá), 近而影響到植株的整體功能。但由于RNA極易降解, 因此, 干擾片段在轉(zhuǎn)基因油菜體內(nèi)的存在方式有待挖掘和探究。

另外, HIGS技術(shù)整體受到RNAi網(wǎng)絡(luò)調(diào)控, 機(jī)制復(fù)雜, 目前對(duì)于寄主植物中產(chǎn)生的沉默信號(hào)分子進(jìn)入病原菌的機(jī)制尚不清楚, 有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

將編碼核盤(pán)菌草酸合成的基因的干擾片段利用HIGS技術(shù)導(dǎo)入至油菜基因組中, 獲得的轉(zhuǎn)基因油菜提高了對(duì)核盤(pán)菌的抗性, 推測(cè)可能是在轉(zhuǎn)基因油菜中轉(zhuǎn)錄成功的siRNA靶向降解了的表達(dá), 影響了核盤(pán)菌菌絲的正常生長(zhǎng)和擴(kuò)展, 同時(shí)抑制了草酸的積累, 從而降低了核盤(pán)菌的致病能力。

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Application of host-induced gene silencing interfering withpathogenic geneinresistance to

YANG Yi-Dan1, HE Du1, LIU Jing2, ZHANG Yan1, CHEN Fei-Zhi1, WU Yan-Fei1, and DU Xue-Zhu1,*

1School of Life Sciences, Hubei University / State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, Wuhan 430062, Hubei, China;2Key Laboratory of Biology and Genetics and Breeding of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China

Rapeseed is the largest oil crop in China, andis one of the main diseases of rapeseed in China. In this experiment, to study the effect of HIGS-mediatedgene silencing on the resistance tointhe interference fragment of the key pathogenic gene() inwas transformed intoby HIGS technique, and the transgenic plants containing siRNA were obtained. The results of disease resistance identification after inoculation withshowed that the resistance oftransgenic rapeseed plants towas enhanced, and the relative expression levels ofgenes inmycelia of R18, R25, and R36 lines were lower than wild type, indicating that siRNA was successfully expressed in transgenic rapeseed. The lesion size ofcultured on the medium supplemented with transgenic rapeseed leaf extract was significantly smaller than wild type, which decreased by 35.29%, 21.98%, and 31.53% respectively. The mycelium grew slowly, the expansion length was shorter, the branches were few, and the growth was abnormal. After inoculating it into normal wild type rapeseed, its pathogenicity decreased significantly. After inoculating the transgenic rapeseed leaves with, it was observed that the mycelium expansion on the leaves was sparse, the growth was blocked, and the infection pad formation was inhibited, suggesting that the interference fragments expressinggene in rapeseed affected the mycelium growth and expansion. Compared with the wild type, the content of oxalic acid in the lesion tissue of transgenic rapeseed was 391 μg g–1and 446 μg g–1at 36 hpi and 48 hpi, which decreased 54 μg g–1and 32 μg g–1, respectively. This study showed that the interference fragment expressingin rapeseed could reduce the accumulation of oxalic acid duringinfection and enhance the resistance level of transgenic rapeseed to. In this experiment, HIGS technique was used to improve resistance toby transforming interference fragments ofgene in rapeseed, and to provide a theoretical basis and germplasm resources for breedingresistant varieties.

;; HIGS; oxalyl acetate acetylhydrolase; oxalic acid

10.3724/SP.J.1006.2023.24126

本研究由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金(KF2022001)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31771837)資助。

This study was supported by the Open Project Foundation of Key Laboratory of Oil Crop Biology and Genetics and Breeding of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs (KF2022001) and the National Natural Science Foundation of China (31771837).

杜雪竹, E-mail: duxuezhusk@163.com

E-mail: duxuezhusk@163.com

2022-05-26;

2022-10-10;

2022-10-31.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20221028.1836.004.html

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