蛋白A 免疫吸附清除致敏腎移植受者HLA 抗體的臨床觀察

董 梅，顧云娜，李興勤，熊 路，胡 偉，伍云松

(昆明市第一人民醫(yī)院血液凈化中心，云南 昆明 650224)

腎移植（renal transplantation）是終末期腎病的主要治療手段之一，而高度致敏受者由于體內(nèi)預(yù)存抗HLA 抗體和致敏淋巴細(xì)胞，難以找到人類白細(xì)胞抗原相容的供腎，導(dǎo)致高致敏患者接受腎移植的機會大大減少。同時，術(shù)前群體反應(yīng)性抗體滴度越高，術(shù)后發(fā)生嚴(yán)重排斥反應(yīng)的危險性越大。因此群體反應(yīng)性抗體陽性者移植物長期存活率顯著低于群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibodies，PRA）陰性者。PRA＞10%的患者移植腎的丟失概率是PRA＜10%的3 倍，而PRA＞40%則預(yù)示超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，PRA＞80%一度公認(rèn)為移植禁區(qū)[1]。高致敏患者體內(nèi)抗體長期維持高水平并難以清除，故致敏受者的脫敏治療成為移植領(lǐng)域的難點問題。通過脫敏治療清除預(yù)存抗體、阻斷新生抗體和保護(hù)靶器官，可以為致敏患者帶來更多的移植機會，移植后延長生存時間，提高生活質(zhì)量。因此，移植前設(shè)法減少或清除患者體內(nèi)抗HLA 抗體是此類高PRA 患者腎移植成功的關(guān)鍵。蛋白A 免疫吸附是近年來新興的血液凈化技術(shù)，能夠高選擇性地清除體內(nèi)的致敏物質(zhì)，降低PRA 陽性率，可以預(yù)防和減輕腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)[2-4]，且在美國血漿凈化協(xié)會（ASFA）診療指南中明確推薦其為用于腎移植術(shù)前脫敏和術(shù)后抗排斥反應(yīng)的血液凈化療法[5]。本研究對致敏受者采用蛋白A 免疫吸附聯(lián)合小劑量免疫抑制劑清除體內(nèi)預(yù)存的抗HLA 抗體，分析其清除效果及安全性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年5 月-2018 年10 月昆明市第一人民醫(yī)院收治的擬行腎移植致敏患者7 例為研究對象。其中男5 例，女2 例；年齡28～57 歲；6 例為2 次移植，1 例為首次移植，其中1 例有生育史。納入標(biāo)準(zhǔn)：移植前均行血液透析治療1～6 年，2～3 次/周；受試者PRA＞40%。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染、系統(tǒng)炎癥性疾病、糖尿病、腫瘤，近3 個月內(nèi)輸血及免疫抑制劑治療史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受者及直系親屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 所有受者均接受蛋白A 免疫吸附治療3～5 次，隔日治療1 次。利用NCU-18（尼普洛株式會社）血液凈化機，膜式血漿分離器（OP-08W，旭化成醫(yī)療器械有限公司），蛋白A 免疫吸附柱（康碧爾○R，KC IA08，廣州康盛生物科技股份有限公司）完成治療。建立體外循環(huán)后，低分子肝素抗凝，體外循環(huán)下全血以100～120 ml/min 速度流經(jīng)血漿分離器，分離出的血漿再以30～40 ml/min 的速度流經(jīng)葡萄球菌蛋白A 免疫吸附柱進(jìn)行吸附，單個循環(huán)吸附時間為15～20 min，吸附血漿量450～600 ml。吸附完成后用生理鹽水將吸附柱內(nèi)血漿回輸入體內(nèi)；回漿完成后再用檸檬酸洗脫液洗脫（流速50～70 ml/min），吸附柱內(nèi)pH 值降至2.8～3.0 時，蛋白A 與所結(jié)合的抗體解離，抗體被洗脫清除；再用磷酸緩沖液沖洗吸附柱（流速50～70 ml/min），使柱內(nèi)pH 值恢復(fù)到6.4～7.0時，蛋白A 又恢復(fù)吸附能力，然后生理鹽水二次預(yù)沖（流速50～70 ml/min）3 min，完成吸附柱再生。二次預(yù)沖結(jié)束后開始下一循環(huán)吸附，通過控制吸附柱的吸附、再生，實現(xiàn)“吸附-洗脫-平衡-二次預(yù)沖”4個步驟組成的吸附循環(huán)，每次6～10 個循環(huán)，每次吸附治療血漿3600～6000 ml[3，6]。吸附過程中如出現(xiàn)嚴(yán)重過敏、心律失常、休克等不良反應(yīng)則終止治療。

患者在免疫吸附開始前1 周開始口服嗎替麥考酚酯分散片（杭州中美華東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20052083，規(guī)格：0.25 g×40 片）0.75 g，2 次/d；他克莫司（安斯泰來制藥<中國>有限公司,國藥準(zhǔn)字J20090141，規(guī)格：0.5 mg×50 粒）1.5 mg，2次/d。免疫吸附治療后，若免疫球蛋白IgG＜7.1 g/L 則靜注人免疫球蛋白（山西康寶生物制品股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S19994004，規(guī)格：50 ml∶2.5 g）10 g，免疫吸附治療結(jié)束后為預(yù)防抗體再次升高，予長期服用上述劑量免疫抑制劑。

1.3 觀察指標(biāo) 所有患者均在蛋白A 免疫吸附初次治療前和每次治療后留血標(biāo)本測定PRA，HLA 抗體滴度和血清免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）、補體（C3、C4）。采用酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）檢測群體反應(yīng)性抗體（PRA）。Luminex 技術(shù)檢測抗HLA 抗體滴度，檢測結(jié)果采用MFI 表示。MFI 參考范圍：＜1000為陰性；1000～4000 為弱陽性；4001～10 000 為中陽性；＞10 000 為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料以（P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后免疫球蛋白及補體變化比較 治療后免疫球蛋白IgG、IgA、IgM 及補體C3、C4低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 治療前后免疫球蛋白及補體變化情況（）

表1 治療前后免疫球蛋白及補體變化情況（）

2.2 治療前后免PRA 變化比較 治療后、隨訪1 個月PRA-Ⅰ類抗體低于治療前，且隨訪1 個月PRA-Ⅰ類抗體低于治療后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而治療前后及隨訪1 個月PRA-Ⅱ類抗體比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 治療前后群體反應(yīng)性抗體變化情況（,%）

表2 治療前后群體反應(yīng)性抗體變化情況（,%）

2.3 治療前后HLA 抗體MFI 值變化比較 患者1 進(jìn)行了4 次免疫吸附治療，治療后HLA-Ⅰ類抗體MFI 值低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05）；隨訪半個月后HLA-Ⅰ類抗體MFI 值低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=5.293，P＜0.05），而HLA-Ⅱ類抗體與治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=-0.269，P＞0.05），見表3。

表3 治療前后HLA 抗體MFI 值比較（）

表3 治療前后HLA 抗體MFI 值比較（）

注：（-）為陰性；/為未檢測

2.4 不良反應(yīng)觀察 7 例受者共接受27 例次蛋白A免疫吸附治療，吸附過程順利，無不適主訴，未發(fā)生過敏、感染等不良反應(yīng)，生命征平穩(wěn)。

3 討論

據(jù)美國器官共享聯(lián)合網(wǎng)（United States Organ Sharing Network，UNOS）統(tǒng)計[4]，影響移植腎長期存活的因素按程度排序依次是PRA、HLA-B 及HLADR 抗原的錯配、移植次數(shù)、移植前輸血、供者年齡及種族差異。研究表明[7]，PRA 與移植物存活和各種排斥反應(yīng)密切相關(guān)，同時PRA 水平高的患者術(shù)后發(fā)生急性排斥和慢性排斥的風(fēng)險越高，可見對于術(shù)前高PRA 的患者，設(shè)法減少或清除體內(nèi)預(yù)存抗HLA抗體意味著增加移植機會，縮短等待時間，減少術(shù)后排斥反應(yīng)及移植物失功。

移植前設(shè)法減少或清除患者體內(nèi)預(yù)存的抗HLA 抗體是此類高PRA 患者腎移植成功的關(guān)鍵。臨床常用的脫敏手段有藥物的免疫調(diào)節(jié)和血液凈化。研究表明[8]，使用免疫調(diào)節(jié)藥物可減少、阻斷新的抗體生成并保護(hù)靶器官。血液凈化方式主要是清除血循環(huán)中抗體，包括血漿置換和免疫吸附等手段，可以快速清除體內(nèi)預(yù)存致敏抗體，在短期內(nèi)顯著降低致敏患者體內(nèi)的抗體水平，但不能阻止抗體的重新生成，常與其他脫敏手段或藥物聯(lián)合應(yīng)用[9]。血漿置換的缺點在于需要大量的血漿、白蛋白，在血制品緊張的醫(yī)療環(huán)境下，極大限制其臨床治療的時效性；會丟失血漿中大量生理成分（凝血因子、蛋白類成分、有益抗體）；非選擇性清除抗體，導(dǎo)致患者免疫力低下，加上移植術(shù)后使用免疫抑制劑，增加感染機會。免疫吸附療法則是利用免疫學(xué)原理或物理化學(xué)原理，通過吸附劑選擇性地吸附并清除血液中的抗體，其優(yōu)勢在于不用棄去原有血漿，且無需補充外源性血漿，允許一次性進(jìn)行更大血漿容量的治療，并避免了血漿中凝血因子、纖維蛋白原等有益成分的損失以及血漿輸注可能存在的風(fēng)險；對正常血漿成分影響極微，不影響同時進(jìn)行的藥物治療；避免了人體正常成份丟失，出現(xiàn)術(shù)中/術(shù)后低血壓、感染等并發(fā)癥，同時不影響藥物治療的時機。IA 具有高度的選擇性[10]，對IgG 具有高親和力，對于IgM 和IgA 親和力可變。也有研究報道[11-13]，蛋白A 免疫吸附對于對于免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG4清除效率明顯高于IgG3。

本研究使用的蛋白A 免疫吸附柱，其配基基因重組葡萄球菌蛋白A 與血漿中致病性抗體是一種可逆的pH 敏感的結(jié)合，能夠循環(huán)吸附致敏抗體。免疫吸附的1 次治療進(jìn)行多個循環(huán)，在2 個循環(huán)的中間，吸附柱再生過程中，一部分體液抗體會轉(zhuǎn)移到血管內(nèi)在下一次循環(huán)中被清除，故免疫吸附既可以去除血液中抗體又可以去除體液抗體，故蛋白A 免疫吸附克服了抗體在體內(nèi)的重新分布，致敏抗體清除率優(yōu)于血漿置換。Belàk M 等[14]研究指出，87%的預(yù)存抗體可以通過單次2.5 個血漿容量的治療被清除。有研究顯示[15]，單次的蛋白A 免疫吸附對IgG 的選擇性明顯高于連續(xù)3 次的血漿置換，而后者引起的FIB 的下降明顯高于前者，且免疫吸附可使淋巴毒由陽性轉(zhuǎn)為陰性，對補體C3、C4也有吸附能力。因此，本研究選擇了蛋白A 免疫吸附療法來清除圍手術(shù)期患者體內(nèi)預(yù)存的HLA 抗體。

免疫吸附只是清除了受者外周血中預(yù)存的致敏抗體，對受者體內(nèi)合成和分泌抗體的免疫致敏細(xì)胞和免疫記憶細(xì)胞并未清除，若再次受到相同抗原刺激，可再次發(fā)生免疫應(yīng)答。因此，本研究在免疫吸附清除抗體的同時聯(lián)合免疫抑制藥物治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后PRA 和IgG 水平下降明顯，同時IgM、IgA 和C3、C4水平亦較治療前降低；治療結(jié)束后1 月內(nèi)隨訪PRA 水平無明顯反彈。經(jīng)過多次蛋白A 免疫吸附聯(lián)合小劑量免疫抑制劑治療，創(chuàng)造了一個低群體反應(yīng)性抗體的“窗口”期。其中，1 例患者成功進(jìn)行了腎移植手術(shù)。由于DBD/DCD 供腎時間的不確定性，導(dǎo)致高致敏受者脫敏治療的準(zhǔn)備時間不充分。當(dāng)抗體滴度過高時往往需要多次血液凈化聯(lián)合大劑量免疫調(diào)節(jié)藥物來治療。有限的時間內(nèi)若抗體水平下降不滿意，有可能讓致敏受者錯失移植機會。因此，臨床上通過制定合理脫敏方案，盡可能為致敏患者爭取一個相對長的低群體反應(yīng)性抗體“窗口”期，可以為此類患者贏得更多的腎移植機會。但長期的免疫抑制方案的利弊尚需更深入的研究來探索。

本研究選擇了蛋白A 免疫吸附療法來清除圍手術(shù)期患者體內(nèi)預(yù)存的DSA。經(jīng)過多次蛋白A 免疫吸附治療，創(chuàng)造了一個交叉配型陰性，低群體反應(yīng)性抗體的“窗口”時間。本研究納入7 例高致敏患者共接受27 例次蛋白A 免疫吸附治療，治療后PRA 和IgG 水平下降明顯，且隨訪1 個月與治療前PRA 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1 例患者隨訪1 個月HLA 抗體持續(xù)陰性，于2 個月后成功進(jìn)行腎移植手術(shù)；其余患者進(jìn)入一直等待期，有4 例患者經(jīng)過蛋白免疫吸附治療，HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ的MFI 值治療前后變化不明顯，可能與患者依從性有關(guān)，針對以上現(xiàn)象，需要進(jìn)行更多大樣本、多中心深入研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)采用蛋白A 免疫吸附可迅速降低PRA水平，其對HLA-Ⅰ類抗體的清除效果優(yōu)于HLA-Ⅱ類抗體。當(dāng)然，并非對HLA-Ⅱ類抗體清除效果不佳，其原因原因很可能是Ⅱ類抗體的MFI 值普遍更高，更容易達(dá)到飽和狀態(tài)，尤其是HLA-DQ 抗體[16]。有研究用滴定法測定抗HLA 抗體，結(jié)果也顯示血漿置換對HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ類的清除效果沒有區(qū)別[17]。因此，免疫吸附對于抗體清除效果的差異可能與下列因素相關(guān)：抗體亞型、滴度，吸附次數(shù)，免疫調(diào)節(jié)藥物（種類、劑量、給藥時機）。當(dāng)HLA-Ⅱ類抗體被清除后，同時免疫抑制不充分，負(fù)反饋抑制被解除導(dǎo)致新生抗體速度超過了清除速度，表現(xiàn)出檢驗值不下降。針對以上疑問亟需更多大樣本、多中心的深入研究。

因此，對于高致敏受者處理可參考以下原則[18-21]：①腎移植手術(shù)前期采用蛋白A 免疫吸附降低PRA水平，快速清除預(yù)存HLA 抗體，并聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑抑制/阻斷HLA 抗體產(chǎn)生；②避免供體具有致敏抗體的靶抗原；③選擇CDC 陰性的供者；④在CDC 陰性的前提下，尋找HLA 匹配的供腎；⑤配合完善的免疫抑制方案的同時，術(shù)后監(jiān)測PRA、DSA，必要時予蛋白A 免疫吸附治療預(yù)防急性排斥反應(yīng)。

綜上所述，蛋白A 免疫吸附可以有效降低PRA水平，且具有良好的安全性。