鐵死亡在腦卒中的作用及針刺干預機制

鄧小嫚,彭擁軍

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

腦卒中(Stroke)是我國目前發(fā)病率、致殘率、致死率與復發(fā)率均較高的疾病之一，也是我國目前傷殘調(diào)整壽命年的主要原因[1]。腦卒中是由于多種原因?qū)е履X血管突然發(fā)生破裂或堵塞，表現(xiàn)為腦組織損害及腦功能障礙的急性腦血管疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種類型。腦卒中患者常易罹患各種并發(fā)癥，不僅危害患者身心健康，還極大增加家庭及社會經(jīng)濟負擔[2]。溶栓治療(Thrombolytic therapy)是目前治療腦卒中公認的最有效的方法，但是有嚴格的時間要求，而且目前針對腦卒中損傷的藥物治療效果并不理想。因此，探討腦卒中發(fā)生機制和尋找減輕腦卒中損傷的潛在有效治療靶點，具有十分重要的意義。

腦卒中的損傷機制目前認為與壞死、凋亡、自噬及焦亡等神經(jīng)細胞死亡形式密切相關。近期研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡(Ferroptosis)作為一種新興的細胞死亡形式正在成為腦卒中以及其他急性腦損傷類疾病的重要發(fā)生機制。而且，有研究證實鐵抑制劑或鐵螯合劑可明顯減輕神經(jīng)功能損傷。鐵死亡是由Stockwell團隊于2012年首次提出[3]，以鐵超載、鐵依賴性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物蓄積、線粒體體積減小及線粒體膜厚度增加為主要特征。目前認為，鐵死亡的主要機制是由于二價鐵(Fe2+)或酯氧合酶(Lipoxygenases，LOXs)的作用，催化了細胞膜上高表達的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而誘導細胞發(fā)生死亡[4]。

中醫(yī)學常采用針刺治療腦卒中，療效顯著[5]。針刺治療腦卒中的干預機制可能與抑制炎性反應、減輕氧化應激、調(diào)節(jié)腦代謝、抑制凋亡、激活自噬、促進神經(jīng)再生及血管新生等密切相關[6]。近年來，由于鐵死亡研究的不斷深入，學者們發(fā)現(xiàn)針刺治療腦卒中與鐵死亡亦關系密切。關于針刺抑制腦卒中神經(jīng)細胞鐵死亡的干預機制仍在研究中，目前尚不明確。本研究旨在探討鐵死亡在腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用及針刺的干預機制，以期為臨床研究中針刺靶向鐵死亡減輕腦卒中后神經(jīng)損傷提供強有力的科學證據(jù)。

1 鐵死亡機制

1.1 氧化還原失衡

鐵死亡最突出特征為脂質(zhì)活性氧(Reactive oxygen species，ROS) 過載，與細胞膜上的PUFA發(fā)生過氧化反應，造成細胞膜破壞，導致細胞死亡。細胞對鐵死亡的敏感性主要是由谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4，GPX4)調(diào)節(jié)。GPX4是細胞內(nèi)唯一一個用于脂質(zhì)過氧化物還原的硒代半胱氨酸酶，它在還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的作用下將脂質(zhì)過氧化的過氧鍵轉(zhuǎn)為羥基，使其失去過氧化物的活性。GSH在細胞內(nèi)促進磷脂氫過氧化物(Phospholipid hydrope-roxides，PLOOHs)還原為相應的醇，從而提高細胞抗氧化能力，減少脂質(zhì)活性氧的堆積，抑制鐵死亡的發(fā)生。胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體(the cystine /glutamate reverse transporters，System Xc-)是細胞內(nèi)重要的抗氧化體系，可以攝取胱氨酸，排出谷氨酸，促進GSH的合成，維持GPX4活性。研究證實[7]，小分子erastin可以通過抑制System Xc-對胱氨酸的轉(zhuǎn)運，從而促進GSH耗竭，使GPX4失活，進而誘導鐵死亡，而Ras選擇性致死小分子3(RAS-selective lethal small molecule 3，RSL3)則通過抑制GPX4的活性直接誘導細胞發(fā)生鐵死亡[8]。間接抑制System Xc-或直接抑制GPX4活性均可引起細胞鐵死亡的發(fā)生?？梢酝茰y，System Xc-GSH-GPX4軸氧化還原失衡是鐵死亡的重要機制之一[4]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)[9]，LOXs可以直接氧化生物膜的PUFA，提示LOXs可能介導鐵死亡的誘導過程。LOXs不依賴于GPX4的活性，主要與半胱氨酸缺乏誘導的鐵死亡相關，但目前尚無明確遺傳學證據(jù)證明LOXs參與鐵死亡過程。除了有爭議的LOXs在鐵死亡中的作用外，最新研究報道[10]，細胞色素P450氧化還原酶(POR)參與啟動脂質(zhì)過氧化。NADPH作為電子供體從POR接受電子后，下游電子受體(細胞色素P450和CYB5A)被還原，進而通過從PUFAs中提取亞甲基氫或還原鐵觸發(fā)脂質(zhì)過氧化反應。目前推測，LOXs與POR氧化還原失衡也可能參與了鐵死亡的發(fā)生。

1.2 鐵代謝障礙

鐵代謝障礙引起細胞內(nèi)游離鐵增多是鐵死亡的特征之一。鐵分為Fe2+與Fe3+兩種氧化態(tài)，在鐵死亡的過程中扮演著十分重要的角色。生理狀態(tài)下，鐵池能夠保持動態(tài)平衡。而病理狀態(tài)下，F(xiàn)e2+集聚在細胞內(nèi)，發(fā)生哈伯-韋斯反應與芬頓反應，產(chǎn)生大量ROS，與細胞膜上的PUFA發(fā)生過氧化反應，導致細胞膜結構破壞，引起細胞鐵死亡[11]。其次，F(xiàn)e2+能夠作為多種磷脂過氧化代謝酶的輔因子，參與了代謝酶發(fā)揮催化活性的過程[12]。此外，許多細胞過程通過改變細胞內(nèi)的不穩(wěn)定鐵含量而改變細胞對鐵死亡的敏感性。轉(zhuǎn)鐵蛋白及其受體通過將鐵導入細胞而共同促進鐵死亡。相反，促進細胞內(nèi)鐵排出已被證明使細胞對鐵死亡具有更強的抵抗力，鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP1與IRP2參與了與細胞內(nèi)鐵儲存和釋放相關基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。因此，鐵儲存、釋放及轉(zhuǎn)運等代謝障礙是鐵死亡的重要機制之一[13]。

1.3 GPX4非依賴性鐵死亡

目前認為，GPX4非依賴性鐵死亡主要與FSP1-CoQ-NAD(P)H軸、GCH1-BH4-DHFR軸及鯊烯積累有關[4]。Bersuker和Doll等[14-15]認為FSP1-CoQ-NAD(P)H軸與GPX4-GSH軸協(xié)同參與了鐵死亡的發(fā)生。鐵死亡抑制蛋白1(Ferroptosis suppressor protein-1，F(xiàn)SP1)是一種類似于脂質(zhì)過氧化物捕獲劑的鐵死亡抑制劑，其不依賴于GPX4的活性而獨立起作用。FSP1具有NADH：泛醌氧化還原酶活性，F(xiàn)SP1通過還原泛醌(CoQ10)/泛醌的不完全氧化產(chǎn)物半氫醌產(chǎn)生泛醇，或者間接促進氧化型α-生育酚自由基(天然抗氧化劑)再生，減少脂質(zhì)自由基，終止脂質(zhì)自氧化反應。最近研究報道[16]，GTP環(huán)水解酶-1(GCH1)可通過其代謝產(chǎn)物四氫生物蝶呤(BH4)和二氫生物蝶呤(BH2)預防鐵死亡。BH4被證明可能通過雙重機制，即既作為直接RTA(需要通過二氫葉酸還原酶DHFR再生)，又參與CoQ10合成，保護含有兩個PUFA尾的磷脂免受氧化降解。GCH1-BH4-DHFR軸可能參與鐵死亡的發(fā)生，但仍有待闡明。膽固醇途徑中的一種代謝物鯊烯積累通過內(nèi)在機制保護自身免受有害的脂質(zhì)過氧化，在固醇缺陷型淋巴癌細胞系和原發(fā)腫瘤中具有抗鐵死亡活性[17]，但尚未證實這是癌癥亞型特異性效應還是一種普遍的保護機制。

1.4 信號通路異常

1.4.1 GPX4-FSP1信號通路 越來越多的證據(jù)表明，GPX4的表達受到嚴格調(diào)控，如增加細胞內(nèi)硒含量可以協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄因子TFAP2c和Sp1來促進神經(jīng)元中GPX4的表達。FSP1是重要的鐵死亡抑制因子，最初是作為p53應答基因被發(fā)現(xiàn)。因此，F(xiàn)SP1還被稱為p53應答基因3(p53-responsive gene 3，PRG3)。FSP1是轉(zhuǎn)錄因子NRF2、CRBP和PPARα的靶基因，同時作用于還原性和氧化性底物。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控，F(xiàn)SP1的氧化還原酶活性是如何被調(diào)控尚不明確。但目前已知的是[18]，GPX4和FSP1在某種程度上與甲羥戊酸途徑相交集，GPX4-FSP1信號通路異?？赡軈⑴c鐵死亡的過程。

1.4.2 E-cadherin-NF2-Hippo-YAP信號通路 E-cadherin-NF2-Hippo-YAP信號通路在調(diào)控鐵死亡方面發(fā)揮作用。細胞密度對上皮細胞鐵死亡的調(diào)控作用是由上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)介導的細胞間接觸所介導，這種細胞間作用能通過NF2腫瘤抑制蛋白激活細胞內(nèi)Hippo信號通路，從而抑制腫瘤蛋白YAP的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性。YAP靶向多個鐵死亡調(diào)控因子[19]，包括ACSL4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR1等。因此，抑制Hippo通路和激活YAP均可以促進鐵死亡。

1.4.3 AMPK信號通路 有研究發(fā)現(xiàn)[20]，在腫瘤細胞中使用AMPK激活劑，可以調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)合成代謝，進而減輕鐵死亡的發(fā)生。葡萄糖饑餓可以抑制細胞鐵死亡，這種保護作用依賴于能量感應激酶AMPK的活性。當葡萄糖缺乏時，AMPK被激活，啟動了一種能量應激保護程序，以對抗鐵死亡，這涉及到PUFAs的生物合成受損，而PUFAs是脂質(zhì)過氧化誘導的鐵死亡所必須。這種保護機制可能是保護機體免受能量耗竭導致的器官損傷的第一道防線。

2 鐵死亡在腦卒中中的作用

2.1 鐵死亡參與腦卒中的發(fā)生

缺血性腦卒中由于缺血、缺氧但尚未發(fā)生器質(zhì)性壞死，故其腦組織仍具有可逆性，在恢復血液供應后病情惡化，即腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[21]。研究發(fā)現(xiàn)[22]，CIRI發(fā)生后，脂質(zhì)過氧化明顯增多，且細胞內(nèi)鐵含量出現(xiàn)升高，與鐵依賴性非凋亡形式的鐵死亡表現(xiàn)十分符合。另外，鐵螯合劑或抗氧化劑可以預防CIRI。CIRI患者的T2加權磁共振圖像也證實了由于鐵沉積而導致基底節(jié)、丘腦及白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)低強度信號[23]。此外，在CIRI的實驗動物模型中可以看到腦部患側區(qū)域出現(xiàn)鐵蓄積[23]。目前，鐵死亡作為一種新型的死亡形式已經(jīng)越來越被重視，并且有望成為逆轉(zhuǎn)缺血性腦卒中神經(jīng)細胞損傷的重要環(huán)節(jié)。

出血性腦卒中可使神經(jīng)細胞發(fā)生鐵死亡。當腦出血發(fā)生后，血液進入大腦間隙，紅細胞大量溶解，血紅蛋白釋放，并被裂解為含鐵血紅素和珠蛋白，在HO-1的氧化作用下，含鐵血紅素被分解為游離鐵、CO和膽綠素，過量的鐵沉積在血腫周圍的腦間質(zhì)中，在胞吞小泡的作用下進入細胞質(zhì)，并以鐵蛋白的形式儲存，引起胞內(nèi)鐵蓄積，繼而發(fā)生芬頓反應產(chǎn)生大量ROS，與細胞膜上的PUFA發(fā)生過氧化反應，從而促進細胞鐵死亡。Zille等[24]研究發(fā)現(xiàn)腦出血后神經(jīng)細胞出現(xiàn)鐵死亡的藥理學和分子學特征。Li等[25]發(fā)現(xiàn)血腫周圍神經(jīng)細胞發(fā)生了鐵死亡，并且發(fā)現(xiàn)鐵死亡的神經(jīng)細胞形態(tài)學特征。

2.2 鐵死亡抑制劑或鐵螯合劑改善腦卒中

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種物質(zhì)可以抑制鐵死亡，如甲磺酸去鐵胺、維生素E、谷胱甘肽、Trolox、Ferrostatin-1、Liproxstatin-1、部分中藥及其活性成分等。Tuo等[26]在小鼠腦缺血損傷中檢測到顯著的鐵死亡發(fā)生，當再灌注時使用鐵死亡抑制劑liproxstatin-1或ferrostatin-1可顯著減少梗死面積，從而改善腦缺血再灌注損傷。鐵螯合劑可以通過抑制自由基的生成，提高酶活性，促進新生羊缺血再灌注損傷模型神經(jīng)功能恢復，改善缺血再灌注腦損傷，提高生存率[27]。方氏等[28]認為鐵螯合劑改善腦缺血再灌注損傷可能與其結合體內(nèi)鐵離子、促進鐵離子排泄和減少鐵離子在腦組織內(nèi)沉積有關。GUAN等[29]發(fā)現(xiàn)香芹酚可通過有效降低活性氧表達，減少鐵沉積和提高GPX4含量，抑制缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元的損害，并且逆轉(zhuǎn)神經(jīng)功能的缺陷。此外，研究發(fā)現(xiàn)[30]，抑制鐵蓄積及活性氧的產(chǎn)生，可以降低早期腦損傷、預防繼發(fā)性腦損傷，進而改善腦出血患者的預后情況。鐵死亡在腦卒中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用，而鐵死亡抑制劑或鐵螯合劑等有望通過調(diào)節(jié)鐵代謝障礙，改善鐵死亡誘導的腦損傷。然而，目前針對鐵死亡與腦卒中的研究仍局限于細胞實驗、動物實驗等，鐵死亡與人類腦血管疾病之間的確切關系仍有待深究。

3 針刺干預機制

3.1 減輕氧化應激

氧化應激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，傾向于氧化，是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用。氧化應激是腦卒中神經(jīng)元損傷的重要原因之一。因此，清除自由基、提高腦細胞的抗氧化能力可保護大腦減少氧化應激損傷。研究表明[31]，針刺腦缺血再灌注損傷模型大鼠的“百會”“四神聰”等穴位可顯著增加腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)等重要抗氧化酶的含量，有助于提高抗氧化能力，起到腦保護作用。針刺也可以降低腦出血組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物LPO含量[32]。朱氏等[33]發(fā)現(xiàn)電針預處理可以上調(diào)缺血半暗帶區(qū)域興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運體2的表達，誘導腦缺血耐受。王氏等[34]發(fā)現(xiàn)針刺大鼠“百會穴”“足三里穴”，可以上調(diào)血清中SOD表達，降低MDA含量，拮抗氧化應激反應，從而達到修復與保護腦組織的目的。研究證實[35]，腦出血大鼠腦組織內(nèi)GPX4含量顯著降低，而針刺可以上調(diào)大鼠腦組織內(nèi)GPX4表達，提高抗氧化能力，抑制鐵死亡，進而改善腦出血大鼠早期損傷。李氏等[36]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，針刺“百會”透“曲鬢”可明顯降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，推測針刺療法可能通過抑制腦出血大鼠神經(jīng)細胞鐵死亡促進出血大鼠神經(jīng)功能修復。

3.2 改善線粒體損傷

鐵死亡的發(fā)生過程中一定會伴有不同程度的線粒體形態(tài)改變和功能失調(diào)，如出現(xiàn)線粒體積縮小，線粒體嵴減少，線粒體外膜破裂等[37]。而且，鐵死亡的發(fā)生與線粒體損傷程度、能量供應及新陳代謝的損害嚴重程度密切相關。缺血性腦卒中發(fā)生后，缺血再灌注會嚴重阻礙ATP的產(chǎn)生，然而大腦需要持續(xù)產(chǎn)生高水平的ATP才可以維持代謝活性和神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)來對抗氧化應激[38]。因此，在缺血狀態(tài)下大腦非常容易累積線粒體代謝副產(chǎn)物[39]。GAO等[40]在研究中發(fā)現(xiàn)抑制線粒體三羧酸循環(huán)及電子傳遞鏈能夠減少線粒體膜電位過極化，降低脂質(zhì)過氧化物積累，使細胞免于鐵死亡。研究證實[41]，針刺能促進MCAO大鼠大腦尾狀殼、皮質(zhì)運動區(qū)以及體感皮層等區(qū)域中的腦葡萄糖代謝，提高調(diào)節(jié)細胞代謝和能量穩(wěn)態(tài)關鍵分子腺苷一磷酸激活的絲氨酸蛋白激酶的磷酸化程度，從而促進神經(jīng)活動和運動功能的恢復。許多研究表明[42-43]，針刺可以保護海馬線粒體超微結構的完整性。李氏等[36]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，針刺“百會”透“曲鬢”在一定程度上改善了線粒體形態(tài)損傷，并推測針刺通過改善線粒體損傷進而抑制神經(jīng)細胞鐵死亡，促進腦出血大鼠神經(jīng)功能修復。通過對線粒體的具體作用機制進一步研究，發(fā)現(xiàn)電針“百會”與“足三里”通過Pink1/Parkin介導的線粒體自噬清除，可以明顯增加線粒體膜電位和ATP水平，減輕硝基/氧化應激誘導的線粒體功能損傷，減少受損線粒體的堆積，從而保護腦細胞免受腦缺血/再灌注損傷[44]。

3.3 調(diào)節(jié)鐵代謝

腦出血發(fā)生過程中，鐵總濃度會增加，導致神經(jīng)元細胞產(chǎn)生嚴重損傷。血腫吸收過程中釋放的血紅素和游離鐵可能是腦出血神經(jīng)細胞死亡的重要誘發(fā)因素之一。研究發(fā)現(xiàn)[45]，大鼠發(fā)生腦出血后，腦脊液內(nèi)的鐵含量會增加，并且需要至少28 d多余的鐵才能被清除。研究表明[46]，在腦出血大鼠的腦內(nèi)注射鐵離子可以直接引起腦水腫，而鐵離子螯合劑可以減輕水腫，說明鐵離子在腦出血水腫的形成中具有十分重要的作用。畢氏通過研究發(fā)現(xiàn)[47]，電針治療通過對microRNA的調(diào)控影響ASCL4、Ireb2、PTGS2、FPN和GPX4基因的表達改善腦低灌注導致的腦鐵沉積。徐氏等[48]發(fā)現(xiàn)腦出血發(fā)生后，音樂電針可降低腦內(nèi)鐵離子含量，降低腦組織水腫，減少腦神經(jīng)元細胞的凋亡。說明音樂電針對急性腦出血大鼠腦內(nèi)灶周的鐵離子具有良性調(diào)節(jié)作用，通過抑制腦出血后早期血腫周圍部位神經(jīng)元細胞的凋亡，減輕腦水腫。

3.4 調(diào)控信號通路

針刺可通過調(diào)節(jié)腦卒中發(fā)生過程中相關信號通路促進神經(jīng)元再生和修復，從而改善神經(jīng)病變。頭針可以有效改善腦出血后神經(jīng)功能已經(jīng)得到廣泛認可[49]。研究發(fā)現(xiàn)，針刺“百會”透“曲鬢”可以減輕腦出血后繼發(fā)性病理損傷，其中包括抑制神經(jīng)細胞死亡信號傳導[50]。頭針治療腦出血可以減輕MDA和鐵螯合，減少線粒體形態(tài)改變，抑制神經(jīng)元鐵死亡，這些效應的通路可能與增強p62、Nrf2、GPX4及FTH1的表達，抑制Keap1的表達密切相關。而且應用頭針可減少腦出血后神經(jīng)行為異常，與去甲氧胺治療的效果無明顯差異。目前推測，頭針可能通過調(diào)控抗氧化通路p62-Keap1-Nrf2，引起FTH1和GPX4的表達增加，從而改善腦出血后的神經(jīng)恢復[51]。此外，實驗表明[52]，夾脊電針可以激活Nrf2的活性，通過Nrf2/ARE通路增加GSH含量，發(fā)揮抗氧化作用。在鐵死亡中GSH正是System Xc-GSH-GPX4通路中關鍵的抗氧化物質(zhì)，可以上調(diào)GPX4的活性，從而抑制鐵死亡。因此，夾脊電針促進神經(jīng)恢復與鐵死亡System Xc-GSH-GPX4通路密切相關。鐵死亡的發(fā)生過程還與E-cadherin-NF2-Hippo-YAP信號通路、AMPK信號通路等有關，目前針刺療法與其他信號通路之間的聯(lián)系尚不明確，未來還有待進一步研究。

4 小結

綜上所述，鐵死亡在腦卒中的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，針刺在其中的干預機制已經(jīng)取得一定的進展，與減輕氧化應激、改善線粒體損傷、調(diào)節(jié)鐵代謝和調(diào)控信號通路等密切相關。但針刺對于腦卒中鐵死亡的干預機制錯綜復雜，未來仍有待進一步研究。針刺作為一種綠色療法，具有操作簡單、經(jīng)濟成本低和場所要求低等優(yōu)勢，值得廣泛推廣。在今后的研究中，還需關注更多的問題。其一，腦卒中發(fā)生時鐵死亡與其他細胞死亡方式可能是相互影響的，存在何種交互通路，未來還需進一步研究各機制之間的聯(lián)系，特別是分子生物學、蛋白質(zhì)組學及基因水平，進一步完善針刺干預機制;其二，在針刺治療方面，目前尚無明確的選穴，未來應該進一步探索選穴規(guī)律，完善中醫(yī)基礎理論;其三，目前關于腦卒中鐵死亡的研究大多以動物實驗為主，鮮有臨床試驗的開展，缺乏有力數(shù)據(jù)和樣本支撐，未來應擴展到臨床試驗的研究，以期為腦卒中的臨床治療及基礎研究提供新思路。