熱休克蛋白47與特發(fā)性肺纖維化關(guān)系研究進(jìn)展

李雪恒 李龍

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性進(jìn)行性纖維性間質(zhì)性肺炎，其特征是進(jìn)行性肺瘢痕形成和常見(jiàn)間質(zhì)性肺炎的組織學(xué)表現(xiàn)。確診IPF主要依靠臨床病史、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、肺功能、胸部高分辨率CT和組織病理學(xué)的結(jié)合，并且排除其它病因的間質(zhì)性肺病[1]。數(shù)據(jù)表明[2]，IPF診斷后的中位生存期約為2～3年，男性發(fā)病多于女性，常見(jiàn)于老年人，尤其是75歲以后的患病率和發(fā)病率更高。由于IPF是一種致命性疾病，目前可用的治療方法療效有限，因此早期的精確診斷非常重要。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，熱休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)與IPF有千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，抑制HSP47的表達(dá)可以影響生物體內(nèi)膠原蛋白的合成，進(jìn)而抑制肺纖維化的進(jìn)展。因此，本文就HSP47與IPF發(fā)病相關(guān)性的研究進(jìn)展作一綜述。

一、HSP47及其生物學(xué)功能

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類存在于所有生物界中的高度保守的蛋白質(zhì)，按照分子量大小和彼此聯(lián)系的密切程度，HSP又可分為：HSP110、HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小HSP等家族。HSP能與很多蛋白質(zhì)分子結(jié)合，在生物體內(nèi)發(fā)揮多種生理功能，包括新生多肽鏈的正確折疊、變性蛋白質(zhì)的重新折疊、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化等[5]。

HSP47是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)的小分子量HSP，是各種膠原蛋白正確折疊和分泌所必需的重要伴侶，該蛋白最早在雞胚成纖維細(xì)胞中被描述為一種能與I型膠原結(jié)合的HSP，后來(lái)通過(guò)對(duì)其核苷酸序列的測(cè)定，證實(shí)HSP47雖然缺乏絲氨酸蛋白酶抑制活性，但由SERPINH1基因編碼,屬于serpin家族[6]。在正常的生理情況下，生物體內(nèi)均存在一定程度的HSP47表達(dá)，它廣泛存在于體內(nèi)能夠表達(dá)膠原的細(xì)胞中，如纖維原細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，參與前膠原的加工、折疊、聚合和分泌等過(guò)程，促進(jìn)膠原的順利合成。

HSP47作用的特異性底物是膠原，膠原是哺乳動(dòng)物中含量最豐富的蛋白質(zhì)，擁有特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)，由Gly-XY重復(fù)序列組成，HSP47 C末端具有ER滯留信號(hào)序列RDEL，專門(mén)識(shí)別膠原蛋白的三螺旋區(qū)域。HSP47與ER中的原膠原瞬時(shí)結(jié)合，以pH依賴性方式在順式高爾基體或ER-高爾基體中間隔室中解離，然后通過(guò)其RDEL保留序列轉(zhuǎn)運(yùn)回ER[6-7]。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[8]，HSP47還直接與富含亮氨酸的小蛋白家族核心蛋白聚糖、lumican和纖維調(diào)節(jié)蛋白相互作用，HSP47在核心蛋白聚糖存在下影響I型膠原原纖維的形成，特別是在原纖維生成的開(kāi)始和結(jié)束時(shí)。

二、HSP47與IPF

1 HSP47與IPF發(fā)病關(guān)系

(1)HSP47在IPF膠原合成中的作用。IPF是一種膠原蛋白相關(guān)疾病，這種疾病的特征是膠原蛋白的異常積累和HSP47的表達(dá)增加。HSP47是一種膠原蛋白特異性分子伴侶，在ER中的膠原生物合成和原膠原的質(zhì)量控制中起關(guān)鍵作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，在不存在HSP47的情況下，在正常培養(yǎng)溫度下可以觀察到膠原生物合成的各種缺陷,例如在ER中的積累、過(guò)度修飾包括脯氨酰羥基化、賴氨酰羥基化和進(jìn)一步的糖基化，以及I型膠原同源三聚體的異常分泌，最終導(dǎo)致分泌的未折疊或錯(cuò)誤折疊的對(duì)蛋白酶消化敏感的膠原蛋白的比例增加。而在IPF患者體內(nèi)，HSP47高度表達(dá)，這導(dǎo)致膠原的正確合成和分泌增加，膠原異常積累，從而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生[11]。

目前已有多項(xiàng)siRNA介導(dǎo)的HSP47敲低的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[12-14]，抑制HSP47表達(dá)可以抑制膠原蛋白的積累，從而抑制IPF的進(jìn)展。例如，HSP47的選擇性藥理學(xué)抑制劑COL003可競(jìng)爭(zhēng)性抑制HSP47與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的前膠原蛋白之間的相互作用，減少膠原蛋白的分泌，從而抑制纖維化[3,14]。Takuto Miyamura等人[4]為了評(píng)估HSP47抑制劑對(duì)體外膠原合成和肺纖維化過(guò)程的影響而進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，他們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡評(píng)估了膠原蛋白的表達(dá)，并分別通過(guò)3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑測(cè)定和劃痕試驗(yàn)確定人和小鼠肺中的細(xì)胞活力和遷移成纖維細(xì)胞，最后發(fā)現(xiàn)，HSP47抑制劑以劑量依賴性方式降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)處理的肺成纖維細(xì)胞中I型膠原蛋白的表達(dá)，同時(shí)還降低了肺成纖維細(xì)胞的活力和細(xì)胞遷移能力。

(2)HSP47 與IPF相關(guān)細(xì)胞及細(xì)胞因子。IPF主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎癥、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和肺纖維化形成，其特征是上皮損傷和異常組織修復(fù)，其中活化的效應(yīng)細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[15]，HSP47影響成纖維細(xì)胞的膠原代謝，在HSP47高表達(dá)的成纖維細(xì)胞中，膠原蛋白的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)會(huì)顯著增加，而在HSP47敲除的成纖維細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，膠原蛋白的分泌緩慢，最終被自噬降解，導(dǎo)致膠原合成減少。

HSP47的表達(dá)調(diào)控受各種細(xì)胞因子的影響，其中尤以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)最為重要。TGF-β是成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵激活劑，是纖維化反應(yīng)的中心細(xì)胞效應(yīng)器，也可能通過(guò)促進(jìn)免疫和血管細(xì)胞中的纖維化表型發(fā)揮作用[16]。TGF-β有3個(gè)亞型，人體細(xì)胞中含量最高的是TGF-β1，它是參與肌成纖維細(xì)胞分化和促纖維化微環(huán)境創(chuàng)建的主要生長(zhǎng)因子。已有研究證實(shí)[4，17-18]，體外TGF-β1可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)HSP47，也可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)HSP47的表達(dá)，是促進(jìn)HSP47表達(dá)的主要細(xì)胞因子。有國(guó)外學(xué)者使用各種細(xì)胞因子處理成纖維細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)HSP47表達(dá)，最終發(fā)現(xiàn)[17]，在Th1細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α)、Th2細(xì)胞因子(IL-4和IL-13)、促炎細(xì)胞因子(TGF-β1)、Th17細(xì)胞因子 (IL-17A)、Toll樣受體配體和IL-1β等各種細(xì)胞因子中，只有TGF-β1顯著增加HSP47水平，而且，TGF-β1可以以劑量依賴性方式同時(shí)增加HSP47mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。

在真核生物中，熱休克反應(yīng)受熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor，HSF)家族的調(diào)控，其中，HSF1主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的經(jīng)典HSR[19]。有研究表明，HSP47的表達(dá)受HSF1的轉(zhuǎn)錄控制，在熱休克時(shí)，HSF1與位于HSP47轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-180 bp的熱休克元件結(jié)合，并激活HSP47 mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)HSP47的表達(dá)。通過(guò)siRNA沉默HSF1可以阻止HSP47的誘導(dǎo)和隨后的膠原蛋白生成，而HSF1的過(guò)表達(dá)則恢復(fù)了HSP47的表達(dá)水平以及膠原蛋白生成[20]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，肺上皮中的HSR以及HSF1的激活會(huì)改變肺纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，它們對(duì)IPF的發(fā)生發(fā)展有著一定的影響[21]。

(3)HSP47 與IPF相關(guān)信號(hào)通路。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，某些信號(hào)通路可以促進(jìn)IPF的進(jìn)展，這些信號(hào)通路可能和HSP47的致纖維化作用有關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是參與IPF的重要信號(hào)通路之一，可分為4個(gè)亞族：ERK、p38、JNK和ERK5。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)，抑制MAPK信號(hào)通路可以抑制IPF的進(jìn)展[22-23]。ERK1/2和JNK可以調(diào)節(jié)熱休克轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)幾乎所有HSP的合成[24]。由于HSP47是HSP家族的成員，因此有學(xué)者推測(cè)ERK1/2和JNK將參與HSP47的誘導(dǎo)表達(dá)，他們通過(guò)實(shí)驗(yàn)[25]首先證明TGF-β1處理HK-2細(xì)胞可激活ERK1/2和JNK通路，并且顯著增加了HSP47的表達(dá)水平，隨后使用ERK1/2和JNK MAPK抑制劑抑制ERK1/2和JNK信號(hào)，結(jié)果清楚地表明，體外誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中HSP47表達(dá)水平也會(huì)隨之降低，進(jìn)而減少膠原蛋白表達(dá)以減輕纖維化程度。

(4)HSP47 與IPF相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是鋅依賴性內(nèi)切蛋白酶家族，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分和許多非基質(zhì)蛋白，因其在異常纖維化過(guò)程中的作用而被廣泛研究。MMPs的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，因此，其在誘導(dǎo)肺纖維化損傷中的具體作用尚未被研究透徹，一些MMPs的作用是促纖維化，而其它的則具有抗纖維化功能[26-27]?，F(xiàn)有研究顯示，HSP與MMPs之間有著密切聯(lián)系，例如，HSP家族的一些成員是由MMP3誘導(dǎo)的，且MMP3和熱休克因子1(HSF1)具有共調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞內(nèi)的MMP3和HSF1協(xié)同控制某些HSP基因的啟動(dòng)子區(qū)[28]。目前研究表明，HSP與MMPs在某些疾病的發(fā)生中相互關(guān)聯(lián)[29-31]，例如，HSP可以通過(guò)與HSP27的界面位點(diǎn)AA29-40處的MMP-2和MMP-9直接相互作用促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑[29]。有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物的進(jìn)行性纖維化過(guò)程中觀察到，HSP47的表達(dá)水平及MMP-2和MMP-9活性均增加，同時(shí)MMPs的組織抑制劑也增加，而且HSP47的表達(dá)水平更高，組織抑制劑的表達(dá)水平也更高[31]。

2 HSP47對(duì)于IPF的臨床意義及藥物治療

在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中[32]，研究人員以加重期IPF患者、穩(wěn)定期IPF患者和健康者為研究對(duì)象，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定各組血清HSP47水平，結(jié)果表明血清HSP47水平加重期患者高于穩(wěn)定期患者，穩(wěn)定期患者高于健康者。故而可以得出，IPF患者血清中HSP47水平隨著病情的加重而升高，檢測(cè)血清HSP47水平有利于輔助評(píng)估IPF患者的病情嚴(yán)重程度。

盡管IPF發(fā)病率逐年增加，但目前尚無(wú)能夠治愈IPF的藥物。某些學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)[33]，HSP47的功能障礙可以通過(guò)兩種伴隨方式減輕纖維化：抑制膠原蛋白分泌和誘導(dǎo)膠原蛋白產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。因此，HSP47的下調(diào)或HSP47功能的化學(xué)抑制代表了一種治療各種纖維化的新治療策略。

吡非尼酮是一種新型抗纖維化、抗炎和抗氧化化合物，在多個(gè)關(guān)于吡非尼酮的臨床試驗(yàn)中，與安慰劑相比，吡非尼酮可有效減慢IPF患者的疾病進(jìn)展[34-35]。另有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[36-37]，吡非尼酮抗纖維化作用不僅可能通過(guò)直接抑制I型膠原蛋白表達(dá)介導(dǎo)，還可能通過(guò)抑制肺泡上皮細(xì)胞中HSP47表達(dá)介導(dǎo)，導(dǎo)致膠原蛋白合成減少，從而抑制纖維化疾病的進(jìn)展。

從某些中藥中提取到的一些物質(zhì)也能通過(guò)抑制HSP47而達(dá)到抗肺纖維化的作用。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性半琥珀酸鹽衍生物，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[38]。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠減少人胚肺成纖維細(xì)胞膠原的產(chǎn)生，另有研究人員通過(guò)復(fù)制大鼠肺纖維化模型，觀察到使用青蒿琥酯干預(yù)能夠顯著降低HSP47水平，這與膠原的變化趨勢(shì)相同[39]。大黃素，一種從大黃中提取的主要生物活性蒽醌衍生物，被認(rèn)為具有多種藥理作用，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌等[40]。GuanRuijuan等人進(jìn)行的大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，大黃素可以通過(guò)抑制TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制HSP47表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，顯著緩解大鼠的肺水腫和肺纖維化程度，發(fā)揮其抗肺纖維化作用[41]。

某研究[12]測(cè)試了ND-L02-s0201在臨床前肺纖維化模型中的功效，ND-L02-s0201是一種脂質(zhì)納米顆粒，包裹了一種siRNA，可抑制HSP47的表達(dá)。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中，他們證明了ND-L02-s0201治療后相對(duì)肺重量、膠原沉積和組織學(xué)以及纖維化評(píng)分的劑量依賴性和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低。同時(shí)在二氧化硅誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中也觀察到了ND-L02-s0201的抗纖維化作用，ND-L02-s0201的干預(yù)導(dǎo)致小鼠肺組織病理學(xué)改變的改善并阻止了纖維化的惡化。最后可以得出結(jié)論，ND-L02-s0201逆轉(zhuǎn)肺間質(zhì)纖維化，恢復(fù)肺的結(jié)構(gòu)完整性，并改善臨床前大鼠模型的肺功能。因此，體內(nèi)HSP47表達(dá)水平和IPF的發(fā)生有一定的相關(guān)性，抑制HSP47的表達(dá)可以抑制肺纖維化的進(jìn)展，甚至可能逆轉(zhuǎn)肺纖維化。

總體而言，這些研究可以證明HSP47是IPF的潛在治療靶點(diǎn)，HSP47可能通過(guò)抑制膠原蛋白的過(guò)度表達(dá)來(lái)介導(dǎo)抗纖維化作用，這些均可以為設(shè)計(jì)更有效的治療肺纖維化的藥物提供一定基礎(chǔ)。

三、小 結(jié)

IPF是一種慢性進(jìn)展性肺部疾病，通常無(wú)法逆轉(zhuǎn)，總體預(yù)后較差，而且目前可用的治療方法療效有限。越來(lái)越多的證據(jù)表明,HSP47可以作為未來(lái)潛在治療IPF的靶點(diǎn)，抑制HSP47的小化合物將是治療肺纖維化的有希望的候選者，有望為IPF提供新的治療方向和思路，因此，我們?nèi)孕韪由钊氲靥剿饕云錇榘悬c(diǎn)的肺纖維化發(fā)病機(jī)制及其表達(dá)調(diào)控，同時(shí)HSP47與IPF發(fā)病相關(guān)物質(zhì)之間具體相互作用機(jī)制也需要進(jìn)一步的研究。本文總結(jié)了HSP47與IPF發(fā)病相關(guān)的研究成果，并闡述了HSP47的臨床意義，旨在指導(dǎo)臨床治療。