葉酸改善卵泡液中同型半胱氨酸水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響

鄭可欣，張 寧

（1.濱州醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003 ；2.煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，山東 煙臺(tái) 264099）

在輔助生殖治療過(guò)程中，獲得具有受精能力和發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞對(duì)妊娠結(jié)局至關(guān)重要[1]。在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，卵泡液為卵母細(xì)胞提供了特殊的內(nèi)分泌營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。異常的卵泡組成可影響卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟。在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，卵泡液中的氧化應(yīng)激現(xiàn)象可造成卵母細(xì)胞線粒體的損傷、三磷酸腺苷（ATP）缺乏、減數(shù)分裂異常和染色體非整倍體數(shù)目增加，進(jìn)而損害卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能[2]。同型半胱氨酸的主要不良作用為引起或加重氧化應(yīng)激現(xiàn)象，導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育潛能降低。葉酸作為一碳單位載體參與DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，具有促進(jìn)甲基化反應(yīng)、細(xì)胞分裂、核酸合成以及抗氧化的作用，可防止卵母細(xì)胞氧化損傷，促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟，保證卵母細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性。補(bǔ)充葉酸可減輕同型半胱氨酸和氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)卵母細(xì)胞的損傷，從而提高卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，增加輔助生育治療的成功率。

1 氧化應(yīng)激

1.1 氧化應(yīng)激現(xiàn)象

活性氧(reactive oxygen species，ROS) 是生物體內(nèi)活性含氧化合物的總稱，包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基等。在卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育的微環(huán)境中，由氧氣參與新陳代謝所產(chǎn)生的活性氧如得不到及時(shí)清除，會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的現(xiàn)象[2]。在輔助生殖過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生主要來(lái)自兩方面：（1）由配子和胚胎自身代謝產(chǎn)生，相關(guān)反應(yīng)過(guò)程包括氧化磷酸化和細(xì)胞凋亡；（2）在周圍環(huán)境因素的影響下產(chǎn)生，影響因素包括培養(yǎng)基中氧氣濃度、吸煙、年齡和可導(dǎo)致生育力低下的疾病〔包括子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）、早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等〕[3-4]。正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體的氧化/ 抗氧化水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。ROS 會(huì)在體內(nèi)不斷產(chǎn)生和被清除，這使ROS 濃度處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體抵抗ROS 的能力下降時(shí)，相關(guān)動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常[5]。在輔助生殖過(guò)程中，細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)物無(wú)法被及時(shí)清除，且體外培養(yǎng)的環(huán)境會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致過(guò)量ROS 蓄積，可引起一系列病理狀態(tài)，包括生物膜脂質(zhì)損傷、糖化氧化、DNA 損傷、蛋白質(zhì)過(guò)氧化等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、組織器官損傷和各種疾病的發(fā)生[6]。

1.2 氧化應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響

機(jī)體中ROS 和抗氧化劑可保持一種平衡。生理濃度范圍內(nèi)的ROS 是卵母細(xì)胞成熟、排卵、黃體化、黃體孕酮產(chǎn)生和單卵泡形成所必需的物質(zhì)[7-8]。當(dāng)平衡被打破，過(guò)量的ROS 會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化[9]；同時(shí)，過(guò)量的ROS 與胚胎碎裂增加、胚胎分裂減少和囊胚形成率降低有關(guān)[10]，它可通過(guò)造成DNA 損傷、線粒體改變、脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化來(lái)影響未成熟卵母細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟，從而降低胚胎的發(fā)育潛力[11]。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，卵母細(xì)胞和胚胎不可避免地會(huì)暴露在光照和比體內(nèi)更高的氧濃度下，這可能導(dǎo)致過(guò)量ROS 的產(chǎn)生，進(jìn)而引起氧化損傷，影響卵母細(xì)胞和胚胎的正常發(fā)育。清除體內(nèi)過(guò)多的ROS 對(duì)卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育至關(guān)重要[12]。Das 等[13]從78 名接受控制性卵巢刺激的輸卵管性不孕患者的體內(nèi)采集了208 份卵泡液樣品，并對(duì)其進(jìn)行了ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid hydroperoxide，LPO)分析，結(jié)果顯示卵泡液中高水平的ROS 會(huì)降低卵母細(xì)胞的受精潛力，卵泡液中ROS 及LPO 的水平與胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)氧化應(yīng)激水平可以通過(guò)相應(yīng)標(biāo)記物的水平反映，標(biāo)記物包括三類：（1）氧化產(chǎn)物類：包括丙二醛（malondialdehyde，MDA）、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products，AOPP)、巰基蛋白；（2）抗氧化酶：包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 等；（3）總氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）指標(biāo)。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中的氧自由基可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中活性最高的非自由基中間體和終產(chǎn)物，其主要衍生出活性羰基物質(zhì)。研究表明，高水平的MDA 可降低卵母細(xì)胞的成熟率，影響受精能力，導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育潛力下降、高質(zhì)量胚胎減少以及不良臨床妊娠結(jié)局的產(chǎn)生[14]。AOPP 是反映人體氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)損傷的可靠指標(biāo)。巰基蛋白可以保持氧化還原狀態(tài)，發(fā)揮防止氧化損傷的作用[15]。它可誘導(dǎo)還原型谷胱甘肽（glutathione reduced，GSH）的合成，提高配子中GSH 的濃度，促進(jìn)胚胎發(fā)育至囊胚階段[16]。有研究者提出，卵泡液中最重要的抗氧化酶是SOD。研究發(fā)現(xiàn)，SOD 濃度及活性較高的卵母細(xì)胞具有更高的受精率與卵裂率，形成的胚胎移植后臨床妊娠率更高[17]。Paszkowski 等[10]的研究已證實(shí)卵泡液TAC 與卵母細(xì)胞成熟率呈正相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)人類體外受精成功的指標(biāo)。Chattopadhayay 等[18]研究指出，在多囊卵巢綜合征患者中，未成熟卵母細(xì)胞卵泡液中的TAC 水平低于成熟卵母細(xì)胞。Oyawoye 等[19]的研究表明，較高的TAC 水平可提高接受體外受精女性的受精潛力。Mojtaba Kafi 等[20]的研究則證實(shí)，將MDA 作為氧化應(yīng)激標(biāo)志物的效果比TAC 更好。目前TAC 與卵母細(xì)胞發(fā)育和輔助生殖技術(shù)結(jié)果之間的關(guān)系仍有很大爭(zhēng)議。Oyawoye 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，低TAC 與卵子受精不全相關(guān)，而與胚胎活力無(wú)關(guān)。在多囊卵巢綜合征患者中，受精不全與TAC 升高相關(guān)。

2 同型半胱氨酸

2.1 同型半胱氨酸的代謝

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物，在體內(nèi)有甲基化和轉(zhuǎn)硫兩條代謝途徑，前者使Hcy 重新獲得甲基轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，后者則經(jīng)胱硫醚作用生成半胱氨酸。Hcy代謝過(guò)程中有三個(gè)關(guān)鍵酶：亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、胱硫醚p.合成酶(cystathionine βsynthase，CBS) 及甲硫氨酸合成酶(methionine synthetase，Ms)[22]。目前學(xué)者們認(rèn)為，體內(nèi)Hcy 水平主要受參與蛋氨酸代謝過(guò)程中的三種酶的影響，另外各種輔因子( 如鈷胺素、維生素B6、葉酸) 也對(duì)其水平有一定影響[23]。

2.2 Hcy 對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響

Hcy 的主要不良作用是產(chǎn)生活性氧(ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞分裂減少，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，改變一氧化氮代謝，增加氧化應(yīng)激，增加細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致甲基化紊亂[24]。卵泡液Hcy 濃度與卵子受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，卵母細(xì)胞成熟率會(huì)隨著卵泡液中Hcy 濃度的降低而增加[25-26]。卵泡液Hcy水平與卵母細(xì)胞質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[27]；在受精方面，隨著卵泡液中Hcy 濃度的增加，受精率下降。此外，卵泡液中的Hcy 濃度與卵泡直徑呈負(fù)相關(guān)，提示卵泡液中Hcy 濃度過(guò)高會(huì)抑制卵泡的生長(zhǎng)，并可能影響卵母細(xì)胞的成熟和受精[28]。董麗霞等[29]的研究表明，PCOS患者采卵日血漿和卵泡液中Hcy 的濃度明顯高于非PCOS 患者（P＜0.05），血漿中Hcy 的濃度與卵泡液中Hcy 的濃度呈正相關(guān)，卵泡液中Hcy 的濃度與受精率、卵裂率和優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Luting Chen 等[30]的一項(xiàng)研究表明，在IVF/ICSI 周期中，Hcy 與臨床妊娠和著床率呈高度負(fù)相關(guān)，尤其是在攜帶MTHFR C677T TT 基因型的女性中。Y Razi 等[31]的研究表明，卵母細(xì)胞成熟率＜80% 的女性其卵泡液中Hcy 的濃度高于9.8 μmol/L，大多數(shù)優(yōu)質(zhì)胚胎為Hcy 水平＜9.8 μmol/L 的胚胎。降低卵泡液中的Hcy 濃度可以顯著提高卵母細(xì)胞成熟率和胚胎質(zhì)量。另外，衰老可能是通過(guò)增加卵泡液中Hcy 水平導(dǎo)致胚胎質(zhì)量和卵母細(xì)胞成熟率下降的間接因素。卵泡液中Hcy 濃度的升高可刺激氧自由基的產(chǎn)生，降低機(jī)體的抗氧化能力[32]。其還可以通過(guò)干擾體內(nèi)的轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)來(lái)影響DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，從而影響細(xì)胞的發(fā)育和分化[33]。Priscila Queiroz D’Elia 等[34]的一項(xiàng)前瞻性研究證明在卵泡發(fā)育中，高Hcy 血癥可激活細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖，影響卵母細(xì)胞的成熟和體外培養(yǎng)胚胎的質(zhì)量。超閾值Hcy 可能對(duì)卵母細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和基因毒性作用，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)發(fā)生光鏡無(wú)法觀察到的異常變化，從而降低卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛力，影響胚胎著床和正常妊娠的維持[29]。

3 葉酸

3.1 葉酸的代謝

葉酸又稱維生素B9，在體內(nèi)可被二氫葉酸還原酶還原成為二氫葉酸，繼而還原成為四氫葉酸。四氫葉酸是一碳單位的傳遞體，容易接受或脫離一碳單位(甲基、次甲基、亞甲基、甲烯基) 參與DNA 修復(fù)和其他功能。四氫葉酸加甲基后變?yōu)?0- 甲酰四氫葉酸，之后在10- 甲酰四氫葉酸脫氫酶的作用下變?yōu)?，10-亞甲基四氫葉酸，再經(jīng)MTHFR 作用形成6S-5- 甲基四氫葉酸[35]。葉酸可作為一碳單位載體參與DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、甲基化反應(yīng)、核酸合成和抗氧化的作用。在對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響方面，葉酸具有促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟，保證卵母細(xì)胞遺傳穩(wěn)定和防止卵母細(xì)胞氧化損傷的作用，是胚胎發(fā)育過(guò)程中必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[36]。

3.2 葉酸對(duì)Hcy 的改善

植入前的胚胎在很大程度上依賴于在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中獲得的內(nèi)源性還原葉酸池的再循環(huán)，主要用于合成嘌呤和嘧啶[37]。葉酸缺乏會(huì)影響DNA 甲基化和完整性，增加血液Hcy 水平。卵泡液中Hcy 水平升高與形成不成熟的卵母細(xì)胞和質(zhì)量差的胚胎相關(guān)，而MTHFR 基因變異與卵巢儲(chǔ)備降低、卵泡刺激反應(yīng)減弱和體外受精后活產(chǎn)機(jī)會(huì)減少相關(guān)。攜帶多種MTHFR 變體的胚胎似乎具有選擇性劣勢(shì)，研究表明葉酸代謝和相關(guān)基因變異的不平衡可能會(huì)損害女性的生 育 能 力[38]。Wies?aw Szymański 等[39]的 研 究 結(jié) 果顯示，在補(bǔ)充葉酸的較低Hcy 濃度的一組女性中，第一級(jí)和第二級(jí)成熟度卵母細(xì)胞的比例較高，補(bǔ)充葉酸降低了卵泡液和血清中Hcy 的濃度。暴露在低濃度Hcy 下的卵母細(xì)胞有更好的質(zhì)量和更高的成熟度。一項(xiàng)對(duì)于卵泡液中適合卵母細(xì)胞發(fā)育的葉酸和Hcy 濃度的多因素Logistic 回歸分析顯示，卵泡液中葉酸濃度＜14.25 ng/mL 和Hcy ＜4.9nmol/mL 分別是優(yōu)質(zhì)胚胎和臨床妊娠的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)[40]。Brouwer IA 等[41]的研究表明，健康的年輕女性除日常飲食攝入葉酸外，補(bǔ)充250 μg/d 的葉酸可顯著降低其血漿總Hcy 的濃度。Jolanda CBoxmeer 等[28]的研究表明，卵巢刺激可導(dǎo)致血液Hcy 的水平顯著降低(P ≤0.001)。Hcy 和葉酸在血液中的濃度與其在卵泡液中的濃度密切相關(guān)(P ≤0.001)。在補(bǔ)充葉酸的女性中，卵泡液葉酸水平與卵泡直徑呈負(fù)相關(guān)(P ≤0.05)，提示卵泡液中過(guò)多的葉酸可能對(duì)卵泡發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

3.3 葉酸對(duì)氧化應(yīng)激現(xiàn)象的改善

一項(xiàng)對(duì)相關(guān)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)回顧和薈萃分析表明，補(bǔ)充葉酸可通過(guò)增加血清中GSH 和TAC 的濃度來(lái)降低血清中MDA 的濃度[42]。此外，葉酸可通過(guò)降低ROS 的蓄積來(lái)調(diào)節(jié)卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)，從而影響卵巢刺激治療的結(jié)果[43]。葉酸可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)在抗氧化劑水平使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的傷害。此外，來(lái)自葉酸代謝的不同分子對(duì)DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成、適當(dāng)?shù)谋碛^遺傳活動(dòng)和染色體結(jié)構(gòu)維護(hù)也是必不可少的，這使得葉酸在細(xì)胞快速生長(zhǎng)和增殖期間（包括生殖細(xì)胞成熟、懷孕和受精等過(guò)程）不可或缺[44]。

4 總結(jié)與展望

卵泡液中的氧化應(yīng)激反應(yīng)與Hcy 可通過(guò)各種機(jī)制影響卵母細(xì)胞的發(fā)育，研究表明補(bǔ)充葉酸可以改善它們的不利影響，提高卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。然而，補(bǔ)充過(guò)多的葉酸則會(huì)起到相反的作用。未來(lái)需要更多的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)確定葉酸的相關(guān)臨床療效，探索葉酸提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的最適濃度，并通過(guò)與個(gè)人的葉酸代謝能力相結(jié)合來(lái)個(gè)性化地制定補(bǔ)充葉酸的劑量，以期提高輔助生育的成功率。