酒黃精總黃酮提取工藝及其抗氧化作用研究

薛妙，郭凱麗，袁盼盼，劉繼平，史永恒，過曉芳，王斌，朱星枚，，*（. 陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 706；. 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 706；. 陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點研究室，陜西 咸陽 706；. 西安工業(yè)大學數(shù)理系，西安 700）

酒黃精收錄于2020年版《中國藥典》黃精（Polygonati Rhizoma）項下，由凈黃精經(jīng)酒燉或酒蒸制得，主補氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明黃精具有調(diào)節(jié)血脂血糖、增強免疫、抗氧化、抗衰老等多種藥理活性[2-4]，而酒黃精在滋陰養(yǎng)腎、抗氧化、提高免疫等方面較黃精生品作用更強[5-7]，因此酒黃精具備更廣闊的天然產(chǎn)物開發(fā)市場，但是目前對酒黃精化學成分研究偏少，功效物質(zhì)及機制尚不清楚。本研究擬通過響應面法優(yōu)化酒黃精總黃酮的提取工藝，并探討其抗氧化作用及對順鉑誘導的急性腎損傷的保護作用。

1 材料

1.1 試藥

酒黃精購自陜西西安萬壽路中藥材市場，由陜西中醫(yī)藥大學顏永剛教授鑒定為酒黃精。蘆丁對照品（純度≥97%，批號：C06M11Y112461）、維生素C（VC，純度≥99%，批號：S19J6G1）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，純度≥99%，批號：Y17A9Y307695）（上海源葉）；纖維素酶（批號：191125）（上海藍季生物）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、羥基自由基、總還原能力（ABTS+）、MDA、GSH-Px、SOD檢測試劑盒（南京建成）；其他試劑（分析純，天津科密歐）。

1.2 儀器

KS-500DV液晶超聲波清洗器（昆山潔力美）；BSA224S分析天平（精度：0.0001 g）、pH酸度計（北京賽多利斯）；TDZ5-WS低速離心機（湖南湘儀）；TY2021000834全波長酶標儀（美國伯騰）。

1.3 細胞及動物

KM小鼠40只，體質(zhì)量25～35 g，雄性[成都達碩，動物合格證號SCXK（川）2020-030]。動物實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（SUCMDC 20210310009）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮提取液的制備

酒黃精經(jīng)干燥粉碎后過6號篩備用。精密稱取酒黃精粉末2.00 g，加入10 mL乙醇溶液至錐形瓶中，充分溶解，用0.1 mol·L-1的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為4.8。稱取適量纖維素酶，40℃水浴中活化30 min。50℃超聲提取結(jié)束后沸水浴滅活10 min，趁熱過濾，上清液用乙醇溶液定容至10 mL，備用。

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 標準曲線的繪制 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[8]測定總黃酮含量。用色譜甲醇溶解蘆丁對照品制成0.2 mg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取蘆丁對照品儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL量瓶中，依據(jù)文獻[9]以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y＝10.24x+0.0272（R2＝0.9976），線性范圍為0.0080～0.0480 mg·mL-1。

2.2.2 樣品中總黃酮含量的測定 精密吸取“2.1”項下提取液1.0 mL，依“2.2.1”項下方法測定黃精總黃酮提取液的吸光度，代入標準曲線后，計算總黃酮提取率。

總黃酮提取率（%）＝（總黃酮質(zhì)量濃度×藥液體積）/ 藥材質(zhì)量×100%。

2.3 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 7.0進行數(shù)據(jù)分析，Oneway Analysis of Variance（ANOVA）比較多組間差異，t檢驗比較兩組間差異，P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2.4 響應面法優(yōu)化提取黃精總黃酮的最佳工藝

2.4.1 單因素實驗 依“2.1”項下方法，超聲提取，分別考查纖維素酶用量（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%），乙醇濃度（45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%），料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL），提取時間（5、10、15、20、25、30、35、40、45 min）對總黃酮提取率的影響。各單因素結(jié)果見圖1。初步確定最佳條件分別為纖維素酶用量為2.5%，乙醇濃度為55%，提取時間為15 min，料液比為1∶15（g/mL）。

圖1 單因素對酒黃精總黃酮提取率的影響Fig 1 Influence of single factors on the yield of total flavonoids of alcoholic polygonatum

2.4.2 響應面法優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果 依據(jù)Box-Behnken中心組合的實驗設(shè)計原理，針對“2.4.1”單因素實驗結(jié)果，選取纖維素酶用量（A）、乙醇濃度（B）、料液比（C）、提取時間（D）為變量因素，以總黃酮提取率（Y）為響應值，采用四因素三水平的響應面分析法進行測試，各因素水平見表1，實驗結(jié)果見表2。利用Design Expert 10.6.4軟件對數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到總黃酮提取率Y對以上4個因素的二次多項回歸模型：Y＝116-0.36A-6.63B+31.08C+2.6D+2.01AB-2.51AC+2.23AD+3.73BC-1.89BD-2.99CD-0.12A2-2.47B2-24.33C2-1.31D2。方差分析見表3。

表1 響應面實驗因素及水平Tab 1 Factor and level of response surface experiment

表2 響應面實驗設(shè)計及結(jié)果Tab 2 Response surface design and experimental results

從表3中可看到，回歸模擬方程中，一次項乙醇濃度（B），料液比（C），二次項料液比（C2）對總黃酮提取率具有顯著影響。各因素之間的互作關(guān)系通過響應面曲面分析圖展示（見圖2），曲面越陡，其對提取率影響越顯著。由此可見料液比是酒黃精總黃酮提取率的決定因素。

圖2 酒黃精總黃酮提取工藝各影響因素互作圖Fig 2 Influence of different factors on the yield of total flavonoids of alcoholic polygonatum

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis of variance

2.4.3 最佳工藝確定及驗證 經(jīng)Design Expert 10.6.4軟件分析，最優(yōu)工藝為纖維素酶用量1.5%，乙醇濃度45%，提取時間15.879 min，料液比1∶21.028（g/mL），根據(jù)實際情況校正酒黃精總黃酮最佳提取工藝為：纖維素酶用量1.5%，乙醇濃度45%，提取時間16 min，料液比1∶21（g/mL）。并進行3次平行實驗驗證，結(jié)果最優(yōu)工藝下酒黃精總黃酮提取率為0.119%，RSD＝0.58%。表明該工藝簡便可行，重復性好。

2.5 體外抗氧化作用研究

2.5.1 溶液配制與分組 ABTS工作液的配制：將7 mmol·L-1ABTS溶液和140 mmol·L-1過硫酸鉀水溶液按50∶1混合，避光反應16 h，用乙醇稀釋到A732nm約0.7備用。

各實驗設(shè)置樣品組（As，加入樣品的 DPPH無水乙醇溶液），樣品對照組[Abs，加入乙醇（蒸餾水）的提取液]，空白對照組（Abc，等體積無水乙醇（蒸餾水）代替樣品的DPPH（羥自由基工作液，ABST溶液），陽性對照組（VC或BHT）。每組實驗重復3次。

2.5.2 DPPH自由基清除能力的測定 精密吸取不同濃度酒黃精總黃酮溶液100 μL，加0.1 mmol·L-1DPPH無水乙醇溶液100 μL，混勻，室溫避光30 min，517 nm測定A值，計算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率（%）＝[1-（As-Abs）/Abc]×100%。

2.5.3 羥基自由基清除能力的測定 精密吸取不同濃度酒黃精總黃酮溶液50 μL，依次加入50 μL 6 mmol·L-1FeSO4、100 μL 6 mmol·L-1H2O2，充分搖勻后室溫放置10 min；再加入50 μL 6 mmol·L-1水楊酸，充分搖勻后室溫放置30 min，510 nm測定A值，計算羥自由基清除率。羥自由基清除率（%）＝（Abs-As）/Abs×100%。

2.5.4 ABTS總抗氧化能力的測定 精密吸取不同濃度酒黃精總黃酮溶液50 μL，加入100 μLABTS，避光10 min，734 nm測定A值，計算總抗氧化能力?？偪寡趸芰Γ?）＝[1-（As-Abs）/Abc]×100%。

結(jié)果如圖3所示，酒黃精總黃酮具有較強的抗氧化能力，可以劑量依賴性地清除DPPH、羥自由基和ABTS自由基，其IC50分別是（19.43±0.96）μg·mL-1、（4.46±0.14）μg·mL-1和（31.57±0.14）μg·mL-1，尤其是對羥自由基具有較VC [IC50＝（22.23±0.99）μg·mL-1]和BHT [IC50＝（54.83±0.95）μg·mL-1]更強的清除能力。其對ABTS的清除能力在低濃度時較VC低，但當濃度達到100 μg·mL-1時，作用比BHT強，與VC相當。

圖3 酒黃精總黃酮體外抗氧化能力Fig 3 In vitro antioxidant capacity of total flavonoids from alcoholic polygonatum

2.6 酒黃精提取物對順鉑誘導小鼠急性腎損傷的保護作用

2.6.1 順鉑誘導小鼠急性腎損傷模型制備 依文獻方法[9]單日腹腔注射順鉑（20 mg·kg-1）建立小鼠急性腎損傷模型。

2.6.2 分組及給藥 將40只雄性KM小鼠隨機分為空白組，模型組，酒黃精低、中、高劑量組（3.08、9.25、27.74 mg·kg-1），每組8只?？瞻捉M、模型組連續(xù)灌胃7 d生理鹽水，酒黃精組（參照2020年版《中國藥典》方法換算小鼠等效劑量3.08 mg·kg-1）連續(xù)灌胃7 d提取物。除空白組外，每組小鼠按0.02 mL·g-1腹腔注射順鉑?？瞻捉M腹腔注射等量生理鹽水。

2.6.3 血清和腎組織中丙二醛（MDA）、過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的檢測 對實驗后的小鼠進行眼球取血，3000 r·min-1離心20 min獲得血清。取腎組織和生理鹽水按1∶9制備成10%的腎組織勻漿，勻漿于離心機12 000 r·min-1離心10 min，取上層清液，BCA蛋白濃度試劑盒測定腎臟組織蛋白濃度。依次對血清、腎組織按試劑盒說明書步驟，通過比色法在酶標儀上532 nm（450 nm、412 nm）處檢測并計算MDA（SOD、GSHPx）含量。與空白組比較，模型組小鼠氧化應激與抗氧化失衡，表現(xiàn)為血清和腎組織MDA顯著升高（P＜0.01），SOD和GSH-Px顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，酒黃精組血清和腎組織MDA含量降低（P＜0.01，P＜0.05），SOD和GSH-Px含量升高（P＜0.01，P＜0.05）。表明不同劑量酒黃精總黃酮提取物能減輕順鉑誘導小鼠急性腎損傷氧化應激水平（見圖4）。

圖4 不同劑量酒黃精總黃酮對順鉑誘導急性腎損傷小鼠血清、腎組織中MDA、SOD、GSH-Px的影響Fig 4 Effect of different dosages of total flavones of alcohol from alcoholic polygonatum on MDA，SOD，GSH-Px in the serum and renal tissue of mice with acute renal injury induced by cisplatin

2.6.4 病理學檢測 取實驗后的小鼠腎臟，經(jīng)過4%多聚甲醛固定，脫水透明后石蠟包埋，取腎臟切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察腎小管及周圍細胞變化。

模型組中觀察到急性腎損傷組織腎小管上皮細胞顆?；蚩张輼幼冃危偾粩U張，刷狀緣脫落，可看到基底膜斷裂，官腔內(nèi)可見透明、顆?；蚣毎苄?，有上皮細胞凋亡現(xiàn)象。而酒黃精提取物組腎小管空泡樣變形，上皮細胞顆粒均較模型組緩解，腎小管上皮脫落減輕，管腔內(nèi)脫落的細胞核固縮上皮細胞明顯減少（見圖5）。

圖5 酒黃精總黃酮對順鉑誘導急性腎損傷的影響Fig 5 Effect of total flavonoids from alcoholic polygonatum on acute renal injury induced by cisplatin in mice

3 討論與結(jié)論

課題組前期實驗表明，黃精總黃酮具有抗氧化、抗非小細胞肺癌增殖活性[10]。黃精含有多糖、皂苷、黃酮、蒽醌及氨基酸等活性成分，酒制后多糖和總酚含量降低，皂苷、黃酮和蒽醌含量升高[11]。故本研究首次利用響應面法優(yōu)化酒黃精總黃酮的提取工藝，使總黃酮提取率為0.119%，顯著高于基于黃精原藥材（0.01%）的黃酮得率[10]。驗證實驗表明該工藝方法可靠，重復性高（RSD＝0.58%）。黃精具有益腎健脾、補氣養(yǎng)陰等功效，而肝腎陰虛則是衰老的病機。衰老是一個復雜的生命過程，其與機體抗氧化與氧化系統(tǒng)失衡導致體內(nèi)過量自由基、炎癥因子堆積相關(guān)?，F(xiàn)代藥理學研究表明黃精多糖體外具備和VC相當?shù)那宄杂苫芰?，具有較好的抗氧化作用[12]。本研究進一步通過體外抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)提取的黃精總黃酮可清除DPPH、羥自由基和ABTS，具備顯著的抗氧化能力，尤其是其對羥自由基的IC50幾乎是水溶性抗氧化劑VC的5倍、脂溶性抗氧化劑BHT的11倍。因此，本研究獲得的酒黃精總黃酮是一種潛在的天然自由基強清除劑，為黃精抗氧化應用提供了理論依據(jù)。順鉑是臨床治療非小細胞肺癌的一線藥物[13]，但有25%～30%的患者出現(xiàn)腎毒性，如急性腎損傷、尿毒癥等[14-15]。本研究病理結(jié)果顯示順鉑主要損傷腎小管，使上皮細胞水腫變性、基底增厚、腎間質(zhì)輕度纖維化，最終誘導腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡、壞死，出現(xiàn)透明管型。其機制可能包括：氧化應激、炎癥反應、DNA損傷、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡等[16-17]。孫桃桃[18]研究表明黃精多糖對慶大霉素誘導大鼠腎損傷可通過抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)p38 MAPK/ATF2信號通路發(fā)揮保護作用。彭靜等[19]研究表明黃精皂苷可通過降低糖尿病腎損傷模型大鼠的腎臟指數(shù)來改善相關(guān)病理變化，本研究首次發(fā)現(xiàn)酒黃精黃酮提取物通過阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應，降低順鉑對腎組織的氧化損傷，可能與其強大的清除自由基能力相關(guān)。本研究表明酒黃精總黃酮可緩解順鉑所致的小鼠急性腎損傷，為協(xié)同順鉑治療非小細胞肺癌提供新的思路。