豆天蛾江蘇種群滯育期間營養(yǎng)物質及激素變化規(guī)律

郭明明，陸明星，趙雪君，李曉峰，陳 鳳，樊繼偉

(1.連云港市農業(yè)科學院/江蘇徐淮地區(qū)連云港農業(yè)科學研究所，江蘇 連云港 222000；2.揚州大學，江蘇 揚州 225009；3.江蘇省灌云縣植物保護站，江蘇 連云港 222200)

【研究意義】豆天蛾(ClanisbilineatatsingtauicaMell)屬鱗翅目(Lepidoptera)天蛾科(Sphingidae)云紋天蛾亞科(Ambulicinae)豆天蛾屬(Clanis)[1]。豆天蛾是一種資源昆蟲，具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)藥價值[2]，分析其滯育前后體內營養(yǎng)物質及相關激素的變化規(guī)律，有助于進一步探明豆天蛾的滯育機制，為其幼蟲綠色高效飼養(yǎng)奠定理論基礎。【前人研究進展】豆天蛾江蘇種群存在滯育現(xiàn)象[3]，滯育蟲態(tài)為老熟幼蟲，其滯育的發(fā)生不僅能夠躲避不利環(huán)境條件，還可以保證群體發(fā)育的一致性，進而提高成蟲交配率[4]。昆蟲滯育是一個較為緩慢的發(fā)育過程，處于滯育期的昆蟲，體內代謝活動會產生相應變化，從而保障昆蟲存活[5]。如煙蚜繭蜂(Aphidiusgifuensis)滯育個體的海藻糖含量是非滯育個體的 1.5倍以上，山梨醇含量達到滯育初期的1.2倍[6]。七星瓢蟲(Coccinellaseptempunctata)的滯育成蟲總脂肪含量不斷富集，達到(173.66±19.01)μg/mg，是非滯育個體總脂肪含量的2倍以上[7]；滯育還能夠引起歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)體內脂肪酸組成成分發(fā)生改變，其中滯育個體的三酰甘油組分中，棕櫚油酸、油酸等含量會增加，而棕櫚酸和亞油酸含量相對減少[8]。中華通草蛉(Chrysoperlasinica)滯育期間，血淋巴中果糖、葡萄糖含量會顯著增加[9]。還有研究表明，柞蠶(Antheraeapernyi)和麗草蛉(ChrysopaformosaBrauer)在滯育期間，蛋白質、脂肪及糖類含量等方面均存在一定差異[10-11]?！颈狙芯壳腥朦c】與其他研究較多的昆蟲，如九香蟲(Aspongopuschinensis)、中華通草蛉及蚊科昆蟲等相比[12-14]，前人關于豆天蛾滯育的研究相對較少，且對其滯育過程中體內營養(yǎng)物質及激素水平變化還未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以豆天蛾江蘇種群為試驗蟲源，分別在滯育前、滯育中和滯育解除后3個不同時期對豆天蛾老熟幼蟲體內糖類、可溶性蛋白和脂肪酸等營養(yǎng)成分進行測定，同時分析滯育過程中體內滯育激素水平的變化趨勢，為后期深入探究激素參與滯育行為的調控機制及相關生理活動奠定基礎，同時也為豆天蛾滯育誘導及解除機制研究提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

以2021年9月連云港市農業(yè)科學院東辛試驗基地飼養(yǎng)的同一批剛取食結束的豆天蛾老熟幼蟲作為試驗蟲源。

1.2 試驗設計

試驗蟲源為江蘇豆天蛾種群，設置豆天蛾滯育前期(D1)、滯育期(D2)和滯育解除后(D3)3個蟲體時期。其D1蟲體在豆天蛾幼蟲取食結束且即將有入土行為時進行采集；D2蟲體在豆天蛾老熟幼蟲入土做蟲室且停止活動時進行采集，此時豆天蛾幼蟲被誘導進入滯育狀態(tài)[15]；D3蟲體在豆天蛾即將化蛹前進行采集，此時豆天蛾滯育幼蟲開始活動，并逐漸轉移至土表，即被視為解除滯育狀態(tài)。滯育前期、滯育期和滯育解除后每個滯育狀態(tài)分別采集10頭豆天蛾幼蟲，3次重復。采集后的豆天蛾蟲體放入透明自封袋(長14 cm×寬10 cm)，每個自封袋中放1頭豆天蛾幼蟲，密封袋封口后立即放入美國Thermo Fisher公司生產的88400V型超低溫冰箱冷凍保存，用于豆天蛾幼蟲體內可溶性蛋白、糖原、單糖、氨基酸、脂肪酸含量及保幼激素(Juvenile hormone，JH)、蛻皮激素(Molting hormone，MH)水平的測定。

1.3 測定項目和方法

糖原參照張輝等[16]的方法進行測定。單糖參照韓桂茹等[17]的方法進行測定。可溶性蛋白采用考馬斯亮藍比色法[18]進行測定。

脂肪酸測定。采用美國產安捷倫7890A-5975氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，通過GC-MS方法檢測樣品中多種脂肪酸組分含量。色譜條件：安捷倫毛細管為DB-225 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；氣相條件：進樣口溫度280 ℃；分流比20∶1；升溫程序為初始溫度50 ℃，5 ℃/min升至200 ℃，2 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；載氣 He，載氣流量 1.0 mL/min；質譜條件：離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描質量范圍為 35～800，進樣量1 μL。

保幼激素和蛻皮激素測定。取樣品置于液氮中研磨粉碎，準確稱取0.2 g放入10 mL離心管中，加入2 mL乙酸乙酯；4 ℃ 水浴超聲30 min，結束后12 000 r/min離心5 min，取上清液；沉淀中加入2 mL甲醇再提取1次，合并2次上清液；氮氣吹干上清液，以0.2 mL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜，采用美國產安捷倫1260液相色譜串聯(lián)6420A質譜儀進液質檢測。色譜條件：色譜柱為poroshell 120 EC-C18反相色譜柱(2.1 mm×150.0 mm，2.7 μm)；柱溫35 ℃；流動相A 0.1%甲酸水，流動相B 甲醇；流速 0.3 mL/min；進樣體積 2 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0和Excel 2016進行統(tǒng)計分析和繪圖，不同滯育時期豆天蛾幼蟲體內營養(yǎng)物質含量及激素水平顯著性采用Tukey’s HSD test 進行分析。

2 結果與分析

2.1 豆天蛾滯育期間體內糖原、單糖和可溶性蛋白含量變化

從圖1可以看出，豆天蛾滯育期間體內3種營養(yǎng)物質含量表現(xiàn)為可溶性蛋白>糖原>單糖，且3種營養(yǎng)物質含量在豆天蛾不同滯育時期均存在一定差異。隨著其滯育進程的推進，體內糖原含量不斷降低，在滯育解除后(D3)降到最低，僅為11.63 mg/g，顯著低于D1和D2時期(F=20.34，df=2，P=0.018)；豆天蛾體內的單糖和可溶性蛋白含量呈先降低后升高的變化趨勢，均在D2時期降到最低，分別為2.63和13.28 mg/g。豆天蛾體內的糖原和單糖含量在D1和D2時期均無顯著差異，發(fā)育至D3時期時單糖含量顯著升高(F=309.16，df=2，P=0.0003)；豆天蛾體內的可溶性蛋白含量在3個不同滯育時期均存在極顯著差異(F=1078.46，df=2，P=0.0001)，在D1時期最高，達到31.25 mg/g，顯著高于D2時期的15.95 mg/g和D3時期的11.63 mg/g。說明豆天蛾滯育進程改變會引起其體內糖原、單糖和可溶性蛋白含量發(fā)生變化。

同一指標柱形圖上方不同字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。

2.2 豆天蛾滯育期間體內脂肪酸含量變化

由表1可知，豆天蛾幼蟲體內不同脂肪酸含量存在一定差異，9,12,15-十八碳三烯酸(亞麻酸)、9,12-十八碳二烯酸(亞油酸)和十六烷酸(棕櫚酸)含量較高，其中亞麻酸含量高達14 476.04 μg/g，十二烷酸(月桂酸)和十四烷酸(豆蔻酸)含量最低，僅為0.17和1.34 μg/g。此外，隨著滯育進程推進，豆天蛾體內各種脂肪酸含量均有不同程度變化，表現(xiàn)為先緩慢降低后急劇升高的趨勢，D3時期均達到最高值，相比D2時期含量均提高10倍以上，其中棕櫚酸和豆蔻酸含量增長速率最快，分別提高164.7和118.9倍。D1和D2時期，豆天蛾體內亞麻酸和亞油酸含量相對較高，分別達到930.58、736.01和380.94、312.16 μg/g；D3時期，豆天蛾體內亞麻酸和棕櫚酸含量較高。說明豆天蛾滯育狀態(tài)解除后，體內代謝活動逐漸增加，各種脂肪酸含量明顯升高。

表1 豆天蛾滯育期間體內脂肪酸含量

進一步分析滯育前后豆天蛾幼蟲體內不同類型脂肪酸含量(表2)發(fā)現(xiàn)，滯育前期、滯育中期和滯育解除后3個時期豆天蛾體內不飽和脂肪酸含量明顯高于飽和脂肪酸含量。滯育前期(D1)，豆天蛾體內飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別占總脂肪酸的9.12%和90.88%；滯育中期(D2)，豆天蛾體內飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別占總脂肪酸的12.80%和87.20%；滯育解除后(D3)，豆天蛾體內飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別占總脂肪酸的37.97%和62.03%。隨著滯育進程推進，豆天蛾體內飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸及總脂肪酸含量均呈“V”形變化趨勢，在D2時期降到最低，但與D1時期并無顯著差異，發(fā)育至D3時期后，飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸和總脂肪酸含量均顯著提高(F=4131.01，df=2，P=0.0001；F=829.99，df=2，P=0.0001和F=1358.44，df=2，P=0.0001)。說明豆天蛾處于不同的滯育狀態(tài)，體內脂肪酸含量會發(fā)生一定變化。

表2 豆天蛾滯育期間不同類型脂肪酸含量變化

2.3 豆天蛾滯育期間體內滯育激素水平變化

從圖2可以看出，不同滯育時期，豆天蛾體內保幼激素(JH)和蛻皮激素(MH)水平變化趨勢不同。在D1時期，JH滴度較高，在D2和D3時期，MH滴度均高于JH。2種激素水平間差異在不同滯育時期表現(xiàn)為D2>D3>D1。隨著滯育進程推進，豆天蛾體內JH和MH 2種滯育激素水平發(fā)生不同程度的變化，其中JH滴度逐漸降低，并在D3時期出現(xiàn)顯著下降(F=159.21，df=2，P=0.0009)；豆天蛾體內MH滴度則表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在D2時期達到最大值，為4.23 ng/mL，3個不同滯育時期MH滴度存在顯著差異(F=35.38，df=2，P=0.0082)，說明豆天蛾滯育狀態(tài)的變化會引起體內滯育相關激素水平發(fā)生變化。

同一指標折線圖上方不同字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。JH.保幼激素；MH.蛻皮激素。

3 討 論

昆蟲滯育狀態(tài)和非滯育狀態(tài)下，體內營養(yǎng)物質積累會產生一定變化[19]。研究發(fā)現(xiàn)，滯育和非滯育麗草蛉的物質積累存在較大差異，滯育預蛹的蛋白質、脂類、甘油三酯、糖原等能源物質以及甘油、海藻糖等低溫保護物質積累較多，有利于增強麗草蛉的抗逆性[11]。孫良振等[20]研究表明，一化性和二化性柞蠶在滯育解除過程中，滯育蛹的海藻糖含量無明顯變化；糖原變化趨勢在一化性和二化性柞蠶間存在一定差異，其中一化性柞蠶糖原含量先降低后升高，二化性柞蠶糖原含量則不斷下降。吳有芳等[21]認為，隨著滯育進程推進，九香蟲體內脂肪含量逐漸降低，糖類和蛋白質含量均先升高后降低。本試驗中，豆天蛾滯育期間體內可溶性蛋白、糖原、單糖和脂肪酸含量不斷變化，隨著滯育進程推進，從滯育前期到滯育期，豆天蛾體內各營養(yǎng)物質均減少，說明豆天蛾在滯育前期就已經取食充足的食物以維持滯育期間的代謝，還能作為冷凍保護物質，保證滯育蟲體在低溫下的存活。從滯育前期到完全進入滯育狀態(tài)，豆天蛾還存在微弱的生命活動，因此體內的營養(yǎng)物質被逐漸消耗。當滯育解除后，豆天蛾體內可溶性蛋白、單糖和脂肪酸含量急劇升高，其中棕櫚酸和豆蔻酸含量增長速率最快，該時期亞麻酸和棕櫚酸含量最高，說明在豆天蛾滯育解除過程中，體內代謝活動增加，可溶性蛋白含量增多，糖原不斷分解為單糖，同時脂肪酸被大量合成，用于豆天蛾滯育解除后的生命活動的能量來源，為豆天蛾順利進入下個蟲態(tài)奠定良好基礎，這與前人的研究結果基本一致[5]。

昆蟲在滯育期間體內滯育激素水平也會發(fā)生變化[22]，其中保幼激素和蛻皮激素作為重要的滯育激素共同參與調控昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程[23]。劉夢姚[24]研究表明，保幼激素JH能夠促進昆蟲生殖系統(tǒng)的發(fā)育和卵黃原蛋白的合成，進而調控昆蟲滯育。本研究中，豆天蛾不同滯育時期體內JH和MH水平不斷變化，隨著豆天蛾滯育進程的推進，體內JH滴度不斷降低，使豆天蛾在滯育終止后能夠完成蛻皮化蛹，這與Belles等[25]研究結果基本一致。從滯育前期至滯育期，豆天蛾體內MH滴度不斷升高，說明在此階段豆天蛾通過提高MH水平并積累到最高值，提前為豆天蛾滯育解除后完成蛻皮化蛹奠定基礎；而在滯育解除后，MH滴度逐漸降低，在老熟幼蟲化蛹前出現(xiàn)一個高峰。本研究中，在豆天蛾滯育解除過程中，MH滴度始終高于JH滴度，說明在此階段MH發(fā)揮了較大作用，進而誘導豆天蛾蛻皮化蛹。以上結果均表明，JH和MH直接參與了豆天蛾滯育解除后的變態(tài)發(fā)育過程。

本研究中豆天蛾滯育前后體內主要營養(yǎng)物質含量和激素水平與其他昆蟲[26]存在較大差異，說明不同昆蟲種類和不同滯育蟲態(tài)，其滯育期間體內物質含量與激素調節(jié)機制不盡一致，初步認為與昆蟲遺傳背景和相關調控機制有關。本研究初步分析了豆天蛾滯育前后體內主要營養(yǎng)物質含量及滯育相關激素水平的差異，但在滯育激素如何參與豆天蛾滯育發(fā)生和解除過程，并調控體內物質合成途徑等方面未進行深入探究，下一步擬在滯育不同時期對豆天蛾幼蟲施加外源激素，觀察豆天蛾滯育解除情況，并深入分析營養(yǎng)物質及激素相關酶在豆天蛾滯育過程中的功能，探明豆天蛾滯育的生理機制。

4 結 論

在豆天蛾滯育形成過程中，體內營養(yǎng)物質不斷被消耗，蛻皮激素大量增加，同時保幼激素合成減少，為豆天蛾解除滯育提供依據(jù)；滯育解除后，豆天蛾生命活動開始逐漸增加，體內單糖、可溶性蛋白、脂肪酸等營養(yǎng)物質含量也隨之升高，滯育激素水平有所降低，但蛻皮激素始終維持在較高水平，保證豆天蛾完成蛻皮，順利進入下一個蟲態(tài)。說明豆天蛾在滯育活動中，體內滯育激素參與了豆天蛾的滯育活動，尤其是蛻皮激素發(fā)揮了較大作用，調節(jié)了體內營養(yǎng)物質的合成，進而改變營養(yǎng)物質的含量。本研究結果為深入研究豆天蛾滯育機制及其產業(yè)發(fā)展奠定了一定的理論基礎。