湖南省多花黃精炭疽病病原鑒定及其藥劑篩選

邱澤瀾，陳 錦，張 卓，鐘 杰，朱俊子

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙 410128；2.湖南省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所, 長沙 410125；3.湖南省農(nóng)科院植物保護研究所, 長沙 410125)

【研究意義】多花黃精是百合科多年生草本植物，在亞洲分布廣泛，可以作為抗動脈粥樣硬化、抗衰老、抗氧化的臨床中藥材[1-2]。在很多亞洲國家，多花黃精作為茶和觀賞植物使用[2]。多花黃精中的多糖是天然藥物的主要活性成分，具有很多重要的生物學(xué)功能，包括免疫調(diào)節(jié)活性等[3-4]。多花黃精的生長階段可被多種病害侵染[5]，隨著栽培面積的不斷擴大，病害問題也日益突出。其中，炭疽病是對其生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失的主要病害之一。因此，鑒定黃精炭疽病病原菌以及對該病原菌的藥劑篩選可為科學(xué)防治黃精炭疽病提供理論依據(jù)，具有重要意義。【前人研究進展】蔥炭疽菌(Colletotrichumcircinans)是黃精炭疽病的致病因子[6]。蔥炭疽菌是一種最初被確定為導(dǎo)致洋蔥炭疽病[7]的病原真菌，廣泛分布在溫帶地區(qū)。它也會感染其他植物，包括樟子花、甜菜和硬毛堇菜等[8]。然而，根據(jù)現(xiàn)有的形態(tài)描述，蔥炭疽菌和白蠟樹炭疽菌(C.spaethianum)在形態(tài)特征上存在一定的差異。如Damm等[8]全面總結(jié)了白蠟樹炭疽菌和蔥炭疽菌的形態(tài)特征。白蠟樹炭疽菌屬于白蠟樹炭疽復(fù)合種，而蔥炭疽菌是束狀炭疽復(fù)合種的成員[9-10]。當(dāng)在SNA上培養(yǎng)時，白蠟樹炭疽菌的附著胞呈暗棕色，具有不規(guī)則輪廓，有時或多或少淺裂，壁部平滑，而蔥炭疽菌的附著胞是獨立的，呈長橢圓形的棍棒狀，有時呈圓鋸齒狀或稍淺裂，壁部平滑，單細(xì)胞或雙細(xì)胞，淺棕色或中棕色[8,11]。因此，附著胞的形態(tài)可能是鑒別兩種炭疽菌的有用特征。在對黃精炭疽病的防治上，高秋美等[12]提出，適當(dāng)提高黃精的栽種密度，可以使黃精植株生長旺盛，植株健壯，抗倒伏能力增強，有效預(yù)防病害。種植密度過大則會使植株爭奪養(yǎng)分等資源，造成植株弱小，病蟲害頻發(fā)。種植密度過小則會對土地資源造成浪費，無法保證單位面積的產(chǎn)量。因此，合理科學(xué)的種植密度是預(yù)防黃精植株發(fā)生病害的有效方法。南紅亮[13]研究表明，在黃精植株苗期、花期可使用健壯藥劑，在預(yù)防炭疽病等的同時，還能促進黃精根系發(fā)達(dá)，增大塊莖。陰雨天預(yù)防炭疽病發(fā)生時，可以采用健壯藥劑和悅帆欣彤樂組合噴施。在黃精葉片感染炭疽病初期，可使用先正達(dá)健壯2000倍液噴施葉片，每7 d噴施1次，連續(xù)噴施2～3次。若發(fā)病較重，可適當(dāng)加入40%苯醚甲環(huán)唑2500倍液，用噴霧法進行均勻噴施?！颈狙芯壳腥朦c】黃精人工培養(yǎng)具有一定難度，近年來病害問題逐步加重，2017—2019年，在湖南省多花黃精上發(fā)現(xiàn)了一種葉斑病，表現(xiàn)為炭疽病癥狀。目前湖南省黃精炭疽病病原還未有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對病樣進行分離培養(yǎng)，致病性測定，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征并采用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，對分離得到的病原菌進行鑒定，并通過室內(nèi)毒力測定篩選殺菌劑以期為該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離純化

2017—2019年分別采集湖南省4個多花黃精種植苗圃中的多花黃精葉片，共采集16份癥狀相似的多花黃精葉斑病葉。采用組織分離法分離病原菌[14]。在病葉的病健交界處取大小為5 mm×5 mm的組織塊，先用70%乙醇消毒30 s，1% NaOCl消毒1 min，再用無菌水沖洗3次，晾干后轉(zhuǎn)移到PDA平板上，于26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。待長出菌落后轉(zhuǎn)接到另一平板上純化培養(yǎng)。在新鮮的PDA中進行單孢分離，獲得純化的后代。將純化的菌株轉(zhuǎn)入試管斜面，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察

將純化菌株在PDA平板上培養(yǎng)3 d后，在菌落的邊緣打取直徑為5 mm的菌餅轉(zhuǎn)接入新的PDA和SNA培養(yǎng)基中央，在26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。觀察菌落的顏色和形態(tài)，測量菌落直徑。在SNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后，收集分生孢子，在光學(xué)顯微鏡下進行顯微觀察，記錄各菌株分生孢子的形態(tài)特征和計算孢子大小。利用玻片萌發(fā)法[15]，進一步觀察分生孢子和附著胞的形態(tài)，計算附著胞大小。

1.3 病原菌的分子鑒定

采用CTAB法提取真菌基因組DNA[16]。以提取的DNA作為PCR擴增模板，使用表1所示的引物對3株分離菌株的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、肌蛋白(ACT)、幾丁質(zhì)合成酶(CHS-1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPDH)基因進行擴增[17]。PCR反應(yīng)的總體系為50 μL，包括基因組DNA 1 μL、PCR Master Mix 25 μL、每對引物各1 μL(10 umol/L)和ddH2O 12 μL。PCR程序為：94 ℃初始變性5 min; 94 ℃變性30 s, 57～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司進行測序。測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTn同源性搜索。由于3株分離菌株的對應(yīng)序列相同，本研究選擇1株具有代表性的分離菌株CLHJY4-3進行后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。從GenBank中選擇炭疽屬模式菌株及其他菌株序列作為參考序列，使用MEGA6軟件利用鄰接法進行ITS、ACT、CHS-1和GPDH多基因聯(lián)合樹構(gòu)建，以1000次重復(fù)的自舉法進行檢測[18]。

表1 擴增炭疽菌的ITS，ACT，CHS-1和GPDH基因引物

1.4 病原菌致病性測定

用分生孢子懸浮液對盆栽多花黃精進行活體接種以測定分離菌株的致病性。將菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，用無菌水洗下分生孢子，制備分生孢子懸浮液，并調(diào)節(jié)濃度為1×106個/mL。選取長勢一致的健康多花黃精苗，用75%乙醇對葉片進行表面消毒后，用無菌水沖洗干凈。將配制好的分生孢子懸浮液噴灑于葉片上，每株噴灑10 mL。以無菌水接種作為空白對照。接種后，所有處理植株用塑料袋覆蓋2 d保濕，然后在25 ℃、L/D=16 h/8 h的溫室中培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況。為完成柯赫氏法則，待植株發(fā)病后，按上述1.1中方法對發(fā)病葉片進行病原菌再次分離，并通過形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定確認(rèn)分離的病原菌與接種病原菌的一致性。

1.5 殺菌劑對病菌的室內(nèi)毒力測定

利用菌絲生長速率法測定病原菌對5種常用殺菌劑(97%甲基硫菌靈、97.17%多菌靈、96%戊唑醇、95%咪鮮胺和97%吡唑菌酯)的敏感性。在PDA培養(yǎng)基中溶解相應(yīng)質(zhì)量的原藥，制備出不同濃度的藥劑。每個培養(yǎng)皿中倒入15 mL含殺菌劑的PDA，接種直徑為8 mm的病原菌菌餅于培養(yǎng)基中央。以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基礎(chǔ)作為對照，27 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3次，計算抑制率。抑制率計算公式為：抑制率=[(Gc-Gt)/Gc]×100%，其中,Gc和Gt分別代表對照菌落和藥劑處理菌落的直徑。取各處理殺菌劑濃度的對數(shù)值為自變量(X)，對應(yīng)處理菌絲生長抑制率為因變量(Y)，用統(tǒng)計回歸法進行毒力回歸分析。通過各毒力回歸曲線計算各殺菌劑的抑制中濃度EC50，比較不同殺菌劑對病原菌的抑制活性。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀特點與病原菌分離

在湖南省多花黃精種植園中出現(xiàn)的炭疽病主要危害葉片。癥狀表現(xiàn)為葉尖或葉外緣有褐色壞死病斑，外圍有黃色暈圈。發(fā)病后期，病斑變得不規(guī)則，在葉片上迅速擴展，導(dǎo)致葉片卷縮或枯萎(圖1-A)。從湖南省4個市(長沙、邵陽、張家界、株洲)的4個多花黃精種植園采集癥狀相似的病葉采用組織分離法進行病原菌分離。共獲得16株菌落形態(tài)一致的菌株，并隨機選擇其中7株進行形態(tài)學(xué)分析。

2.2 形態(tài)和培養(yǎng)特征

將病原菌置于PDA培養(yǎng)基上，27 ℃培養(yǎng)形成圓形、邊緣整齊的菌落。病原菌最初產(chǎn)生白色至橙色菌絲體，后來變?yōu)闇\灰色，菌絲平均生長速率為7.07 mm/d(表2)。培養(yǎng)7 d后，菌落表面產(chǎn)生黑色的分生孢子堆。15 d后，菌落表面產(chǎn)生大量黑色菌核樣顆粒結(jié)構(gòu)(圖1D～E)。在SNA培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d，產(chǎn)生灰白色棉質(zhì)氣生菌絲(圖1F～G)。PDA和SNA上產(chǎn)生的分生孢子均為透明、無裂片、鐮刀形或微彎曲，頂端圓形，基部截形，內(nèi)部含油球。分生孢子大小為(18.4～25.0)μm×(3.9～5.3)μm(表2)。剛毛散生，數(shù)量較多且直，深褐色，具有2～3隔，基部平齊，頂端較尖，長度為79～107 μm(圖1B～C)。附著胞形狀不規(guī)則，有多或少的裂紋(圖1-H)。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，該真菌可確認(rèn)為炭疽菌[16]。

表2 具有代表性的分離菌株菌落形態(tài)特征

A.采集到的帶病斑的多花黃精葉片；D～G.病原菌在PDA和SNA上分別培養(yǎng)6和15 d的菌落形態(tài)；B、C、H.分生孢子、剛毛和附著胞。

2.3 分子鑒定

將代表菌株CLHJY4-3的ITS、ACT、CHS-1和GPDH基因片段測序后提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號分別為MH453905、MH456881、MH456882和MH456883。在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTn搜索顯示，測得的ITS、ACT、CHS-1和GPDH序列與白蠟樹炭疽菌對應(yīng)序列有99%～100%的同源性。

將獲得的ITS、ACT、CHS-1和GPDH序列與NCBI中檢索到的炭疽菌序列構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹，發(fā)現(xiàn)CLHJY4-3與白蠟樹炭疽菌聚集在一起，形成一個明顯的分支(圖2)。因此，基于同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析可證明多花黃精炭疽病病原菌為白蠟樹炭疽菌。

圖2 分離自多花黃精炭疽病菌和其他炭疽菌屬基于ITS、ACT、CHS-1和GPDH串聯(lián)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 致病性試驗

為確定致病性，將3個代表性菌株的分生孢子懸浮液噴灑接種于健康的活體盆栽多花黃精葉片上。接種4 d后，接種葉片上出現(xiàn)了與田間自然感染相似的炭疽病癥狀。接種6 d后，病斑壞死區(qū)擴大，病斑上可見同心紋排列的小黑點，為分生孢子盤。對照接種植株未觀察到癥狀(圖3)。利用組織分離法從接種發(fā)病的葉片中重新分離病原菌，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定證明其與原始接種菌株為同一種病原菌。因此，根據(jù)柯赫氏法則，試驗中接種菌株為多花黃精炭疽病的病原菌。

A～B.分生孢子懸浮液接種癥狀

2.5 病原菌對不同殺菌劑的敏感性

室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，各個殺菌劑對病原菌均有一定的抑制作用。根據(jù)EC50可知，不同藥劑之間的抑制作用差異較大。其中咪鮮胺的抑制作用最強，EC50為0.031 μg/mL，其次為吡唑醚菌酯，EC50為0.048 μg/mL。再次為戊唑醇，EC50為0.252 μg/mL?；胁冀蚝投嗑`的抑制作用相對較差，EC50分別為2.911和1.763 μg/mL(表3)。

表3 5種殺菌劑對C. spaethianum菌絲生長的抑制作用

3 討 論

本研究對采自湖南省的多花黃精炭疽病樣品進行組織分離、純化、科赫氏法則驗證獲得病原菌菌株。根據(jù)病原菌株培養(yǎng)形態(tài)、顯微觀察形態(tài)、多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析和致病性試驗，鑒定引起該多花黃精炭疽病的病原菌為白蠟樹炭疽菌(C.spaethianum)。炭疽病是多花黃精的重要經(jīng)濟病害。以往研究表明，蔥炭疽菌(C.circinans)是多花黃精炭疽病的致病菌。然而，對于炭疽病菌，僅通過形態(tài)和致病性分析不足以區(qū)分到種。本研究基于ITS、ACT、CHS-1和GPDH進行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)所分離病原菌與典型白蠟樹炭疽菌聚在一起。此外，分離出的病原菌形態(tài)特征也與白蠟樹炭疽菌的一致。因此，本研究為白蠟樹炭疽菌是造成湖南省多花黃精炭疽病的病因提供了證據(jù)，為該病害的田間防治提供了依據(jù)。

炭疽病菌是一種重要的植物病原菌，可以感染許多木本和草本植物、農(nóng)作物、果樹和觀賞植物，包括近年來在中國報道的墨蘭(CymbidiumsinenseWilld.)[19]、番木瓜(Caricapapaya)[20]、紅楠(MachilusthunbergiiSieb.et Zucc.)[21]等，在世界范圍內(nèi)造成重大的產(chǎn)量損失[22-23]。炭疽病菌不僅可侵染果蔬的葉片、莖、塊莖和幼苗，同時也是導(dǎo)致果蔬采摘后病害的重要病原菌。此外，炭疽菌也是重要的腐生菌和內(nèi)生菌，在不同的寄主植物上表現(xiàn)出不同的生活方式[24]。到目前為止，炭疽病菌屬的分類十分復(fù)雜。鑒定炭疽病菌通?；谛螒B(tài)特征觀察和分子鑒定，而包括ITS，ACT，TUB2，CHS-1和GAPDH等基因的多基因序列比較分析則優(yōu)于形態(tài)學(xué)鑒定和基于單基因的進化樹分析方法，可解決炭疽菌屬不同種之間的親緣關(guān)系[25]。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察，并結(jié)合ITS、ACT、CHS-1和GPDH進行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析將分離的病原菌鑒定為白蠟樹炭疽菌。

白蠟樹炭疽菌屬于白蠟樹炭疽復(fù)合種，經(jīng)鑒定可作為植物病原菌和腐生菌。形態(tài)特征為：剛毛的形狀表現(xiàn)為圓錐形，附著胞形狀不規(guī)則，有多或少的裂紋[26-27]。在國內(nèi)外被報道，其可引起許多植物病害，如韓國的玉簪(Fragrantplantainlily)[28]、巴西的萱草(Hemerocallisflava)[29]、印度的硬皮蔥(Alliumledebourianum)[7]。在中國也有報道該真菌對關(guān)蒼術(shù)(Atractylodesjaponica)[4]、前胡(Peucedanumpraeruptorum)[30]、知母(Anemarrhenaasphodeloides)[30]、菜豆(Phaseolusvulgaris)[31]、卷丹百合(Liliumlancifolium)[32]等植物造成病害。本研究中發(fā)現(xiàn)引起多花黃精炭疽病的病原為白蠟樹炭疽菌，與Ma等[33]報道的安徽多花黃精炭疽病病原一致，但由白蠟樹炭疽菌引起的多花黃精炭疽病在湖南省屬于首次發(fā)現(xiàn)。

目前，殺菌劑仍是植物病害防治的主要手段。例如，多菌靈、代森錳鋅、百菌清已被有效用于防治炭疽病[34]。本研究對5種常用殺菌劑的體外抑菌能力進行測定，咪鮮胺和吡唑醚菌酯對病原菌菌絲生長的抑制能力較好，可作為潛在的殺菌劑，用于防治白蠟樹炭疽菌引起的黃精炭疽病病害。雖然這5種殺菌劑在田間的防治效果尚不清楚，但本試驗結(jié)果可為黃精炭疽病的防治提供理論依據(jù)。本研究中，炭疽病主要發(fā)生在多花黃精葉片上。雖然多花黃精的藥用采收部位是塊莖，但對其地上部分的危害嚴(yán)重影響了多花黃精植株的生長，也使多花黃精失去了觀賞價值。此外，白蠟樹炭疽菌宿主范圍廣泛，還可侵染多種植物，其發(fā)生不僅可能威脅到多花黃精的生產(chǎn)，還可能威脅到其他與多花黃精伴生栽培的中藥材種植。因此，應(yīng)進一步研究有效的防治策略，包括篩選高效防治藥劑以減少該病害的危害。由于沒有發(fā)現(xiàn)病原菌向塊莖和根組織的侵染，而多花黃精是一種多年生草本植物，其地上部分在每一個新的生長季節(jié)都能生長出來。因此，類似于其他木本植物病害的防治方法，有針對性地修剪受感染的枝葉對防治該多花黃精病害具有積極意義[35]。

4 結(jié) 論

本研究確定了湖南多花黃精炭疽病的病原為白蠟樹炭疽菌。殺菌劑抑菌實驗中，5種藥劑中，咪鮮胺對該菌菌絲生長的抑制作用最強，EC50為0.031 μg/mL，其次為吡唑醚菌酯，EC50為0.049 μg/mL，可作為防治該多花黃精炭疽病的潛在藥劑。