不同配方培養(yǎng)料對香菇胞外酶活性、產量及品質的影響

楚曉真，崔杏春，劉 格，王保瑞，高 翔

（鄭州市蔬菜研究所 鄭州 450015）

香菇（Lentinula edodes）是一種擔子菌，也是典型的木腐菌，香菇營養(yǎng)價值豐富，脂肪含量低，纖維素、蛋白質含量高，同時還含有B 族維生素、礦物質以及多糖、多糖肽、凝集素等多種功能性代謝產物[1]。前人研究表明，香菇多糖具有抗菌、抗氧化、抗癌和免疫調節(jié)活性，因此也具有一定的藥用價值[2]。食用菌胞外酶是在生長過程中分泌到細胞外的一種物質，能夠降解木質素、纖維素等高分子有機物，為菌絲和子實體生長提供營養(yǎng)物質，目前胞外酶的研究在平菇[3]、秀珍菇[4]、銀耳[5]等多種食用菌中已有廣泛報道。食用菌胞外酶系豐富，目前針對香菇的胞外酶研究主要集中在纖維素酶系、半纖維素酶系、木質素降解酶系和淀粉酶[6]，胞外酶活性的大小和變化規(guī)律受到多種因素的影響，栽培料也是其中之一。

近年來，隨著香菇產業(yè)的不斷發(fā)展壯大，香菇產量不斷增加的同時對原料的需求也隨之增加，櫟木作為廣泛使用的栽培原材料，原料短缺問題也尤為突出[7]。因此，對于替代原料的研究也越來越多，利用桑枝[8]、葡萄木屑[9]的研究表明，添加不同比例的替代木屑對香菇菌絲生長、胞外酶活性和子實體品質具有不同程度的影響。前人利用蘋果木屑作為替代料的研究主要集中在利用單一蘋果木屑作為栽培料[10-11]，而蘋果木與櫟木混合料對于香菇胞外酶活性和品質影響的研究較少。筆者探究了蘋果木、櫟木及其混合料3 種不同培養(yǎng)料對香菇胞外酶活性、產量以及子實體品質，以期為香菇新培養(yǎng)料的開發(fā)和利用以及進行香菇栽培提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種為香菇9608，由鄭州市蔬菜研究所食用菌實驗室保存。該菌株是由西峽縣食用菌科研中心選育，菌株適應性廣、抗霉菌能力強、耐高溫、發(fā)菌速度快，是適宜北方栽培的優(yōu)良高產菌株。供試培養(yǎng)料由鄭州市蔬菜研究所食用菌課題組提供。

1.2 試驗設計

試驗于2021 年3 月至2022 年1 月在鄭州市蔬菜研究發(fā)展中心進行。試驗設置3 種不同的培養(yǎng)料配方（表1）。每個配方100 袋，單袋培養(yǎng)料干質量為1.25 kg，分別在菌絲生長半袋期、滿袋期、轉色期、現(xiàn)蕾期、第一次成熟期檢測香菇的胞外酶活性，在第一潮菇采收后，送至河南省農業(yè)科學院檢測子實體中化學組分。

表1 培養(yǎng)料配方

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備 在香菇生長的不同階段，隨機挑取3 個菌棒，搗碎并混合均勻，稱取5 g，加入25 g 去離子水，40 ℃浸提2 h，5000 r·min-1，4 ℃離心10 min，離心機為日立CR21GⅡ（下同），取上清液即為粗酶液。

1.3.2 胞外酶活性的測定 羧甲基纖維素酶活性[12]：取1.5 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（pH 為4.6，0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液配制）至試管中，加入500 μL 粗酶液，混勻后，50 ℃水浴保溫30 min，水浴鍋為北京科偉永興儀器有限公司HH-S6A（下同）。取出后，加入DNS 試劑1.5 mL，煮沸5 min，取出后冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至20.0 mL，混勻后測定OD540，分光光度計為上海美析儀器有限公司UV-1700PC（下同）。試驗同時以煮沸滅活的粗酶液作為對照。羧甲基纖維素酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶與底物作用30 min 釋放出1 mg 葡萄糖為一個酶活力單位。

半纖維素酶活性：取1.5 mL 0.5%木聚糖溶液（pH 為4.6，0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液配制）至試管中，加入500 μL 粗酶液，混勻后，50 ℃水浴保溫30 min。其后操作同羧甲基纖維素酶活性測定。半纖維素酶活力單位定義：1 g 干培養(yǎng)物中的酶與底物作用30 min 釋放1 mg 木糖為一個酶活力單位。

淀粉酶活性[13]：取1.5 mL 0.5%的可溶性淀粉溶液（pH 為5.8，0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液配制）至試管中，加入500 μL 粗酶液，混勻后，38 ℃水浴保溫30 min。取出后，加入DNS 試劑1.5 mL，煮沸5 min，取出后冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至20.0 mL，混勻后測定OD520。試驗同時以煮沸滅活的粗酶液作為對照。淀粉酶活力單位定義：1 g 干培養(yǎng)物中的酶與底物作用30 min 后釋放1 mg 葡萄糖為一個酶活力單位。

漆酶活性[14]：取3.4 mL 醋酸鹽緩沖液（pH 為4.6）、0.5 mL 3.36 mmol·L-1鄰聯(lián)甲苯胺溶液和0.1 mL 粗酶液，混勻后，28 ℃水浴30 min，取出后定容至20.0 mL，混勻后檢測OD600。漆酶活性單位定義：1 g 干培養(yǎng)物中的酶每1 min 使OD600改變0.01 為一個酶活力單位。

1.3.3 產量測定 香菇成熟時進行采收，第一潮菇于2021 年11 月20－29 日采收，最后一潮菇于2022年1 月20－27 日采收，不同配方的菌棒隨機抽取10棒稱量第一潮菇產量和總產量，取其平均值，并用以下公式計算生物學效率。

生物學效率/%=子實體鮮質量/培養(yǎng)料干質量×100。（1）

1.3.4 品質指標分析 香菇收獲后，不同配方的菌棒每組隨機挑選5 袋，稱取2 kg 子實體進行子實體化學組分檢測。采用GB 5009.5－2016[15]測定蛋白質含量；采用GB 5009.86－2016[16]測定維生素C 含量；采用NY/T 1676－2008[17]測定粗多糖含量；采用GB 5009.3－2016[18]測定水分含量；采用GB 5009.124－2016[19]測定氨基酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析比較其顯著性，采用Excel 2017 制作圖表。

2 結果與分析

2.1 不同栽培料香菇菌絲胞外酶活性的變化

由圖1 可以看出，在3 種不同的配方中，羧甲基纖維素酶活性均呈現(xiàn)出隨著香菇的生長逐漸增強趨勢。轉色期和現(xiàn)蕾期配方2 的酶活性均高于配方1 和配方3。轉色后，酶活性繼續(xù)上升，在第一潮菇成熟時，3 種配方中羧甲基纖維素酶活性均達到最大值，分別為6.41、6.79、7.38 U·g-1·min-1，配方3 酶活性高于配方1 和2。

圖1 羧甲基纖維素酶活性的變化

由圖2 可以看出，在3 種配方中，半纖維素酶活性的變化趨勢一致，均呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢。菌絲半袋和滿袋時期，酶活性較低，之后轉色期和現(xiàn)蕾期酶活性升高，在轉色期半纖維素酶活性表現(xiàn)為配方3＞配方2＞配方1。在現(xiàn)蕾期，配方2和配方3 酶活性基本持平且均高于配方1。隨后，在子實體成熟后，半纖維素酶活性下降。

圖2 半纖維素酶活性的變化

由圖3 可以看出，香菇淀粉酶活性變化規(guī)律配方1 和3 隨生育進程呈先上升后下降的趨勢，配方2 滿袋期后也呈先上升后下降的趨勢。在香菇營養(yǎng)生長階段，淀粉酶活性逐漸升高，在轉色期酶活性達到最大，酶活性大小依次為配方2>配方3>配方1。隨后，在子實體成熟期，淀粉酶活性下降。這表明在香菇子實體成熟前，淀粉酶對淀粉的分解為菌絲生長提供了大量碳源。

圖3 淀粉酶酶活性的變化

從圖4 可以看出，配方1 除轉色期漆酶活性略有升高，在其他生育期均呈下降趨勢，配方2 和3 漆酶活性均隨生育進程逐漸降低，但不同時期酶活性大小有差異。菌絲半袋期時，漆酶活性最高，酶活性高低依次為配方1>配方2>配方3，滿袋后，漆酶活性降低，轉色期配方1 中漆酶有小幅度的升高，之后隨著原基的出現(xiàn)和子實體的成熟，漆酶活性急劇下降，在子實體成熟期，3 種配方漆酶活性均最低。

圖4 漆酶活性的變化

2.2 不同培養(yǎng)料配方對香菇子實體產量和生物學效率的影響

從表2 中可以看出，配方2 和配方3 第一潮菇產量顯著高于配方1，總產量和生物學效率均表現(xiàn)為配方2＞配方1＞配方3。這表明配方3 出菇主要集中在第一潮，但總產量較低。配方1 雖然第一潮菇產量低，但總產量和生物學效率顯著高于配方3。配方2 為櫟木和蘋果木混合基質，不僅第一潮菇產量高且總產量和生物學效率也較單一木料有所提高。

表2 不同配方香菇子實體產量和生物學效率

2.3 不同培養(yǎng)料配方對香菇子實體化學組分的影響

由表3 可以看出，配方2 子實體氨基酸總量（29.51 g·kg-1）顯著高于配方1（25.80 g·kg-1）和3（24.34 g·kg-1），在檢測的16 種氨基酸中，配方2 有10 種氨基酸含量顯著高于配方1，有13 種氨基酸含量顯著高于配方3。

表3 不同配方對香菇子實體氨基酸含量的影響 （g·kg-1）

從表4 可以看出，3 種配方子實體含水量、粗多糖含量均無顯著差異，配方2 香菇子實體中蛋白質含量比配方1 和配方3 分別顯著提高12.63%和18.89%；配方2 子實體的維生素C 含量也顯著高于其他2 種配方。

表4 不同配方對香菇子實體水分、蛋白質、粗多糖和維生素C 含量的影響

3 討論與結論

香菇胞外酶活性的變化規(guī)律反映了香菇生長發(fā)育過程中對營養(yǎng)的利用情況，潘迎捷等[20]研究表明，香菇在生長的不同階段對底物的降解程度不同，香菇菌絲營養(yǎng)生長階段主要利用木質素，在生殖生長階段主要利用纖維素，漆酶主要降解木質素，因此在營養(yǎng)生長階段漆酶活性較高，而羧甲基纖維素酶和半纖維素酶活性在生殖生長階段較高，筆者的試驗結果與此結論基本一致。培養(yǎng)料也是影響食用菌胞外酶活性的因素之一，筆者試驗研究表明，在不同基質中食用菌胞外酶活性存在一定差異，但并不影響酶活性變化規(guī)律，這與吳周斌等[21]，胡素娟等[22]研究結果一致。筆者的試驗中，配方2的羧甲基纖維素酶和淀粉酶活性在轉色期和現(xiàn)蕾期高于配方1 和配方3，但半纖維素酶活性在轉色期配方3 高于配方1 和配方2，這可能是由不同培養(yǎng)料配方中碳氮比不同以及櫟木、蘋果木化學成分含量不同導致的[23-24]。

不同的培養(yǎng)料配方對香菇產量和子實體品質也有不同程度的影響。胡桂萍等[25]用桑枝替代雜木的試驗表明，隨著桑枝替代比例的升高，香菇產量和生物學效率先升高后降低。筆者的試驗結果表明，配方3 用單一蘋果木作為基質，雖然第一潮菇產量較配方1 高，但總產量較低，配方2 將櫟木和蘋果木混合作為基質，其第一潮菇產量、總產量和品質較單一櫟木和單一蘋果木都有提高，這可能是由于混合后基質綜合了櫟木和蘋果木的特點，第一潮菇產量高的同時，也有一定出菇后勁，保證了產量，因此生產上可采用蘋果木與櫟木混合的方式作為香菇生產基質。另外基于蘋果木的特性，用其制作香菇菌棒可用于對第一潮菇產量需求較高的地區(qū)，例如出口國外[26]。對香菇子實體內化學組分的檢測表明，櫟木和蘋果木混合基質能提高香菇子實體氨基酸、蛋白質和維生素C 含量，這可能是由于不同栽培基質條件下香菇氮、磷、鉀利用效率不同[27]。

綜上所述，櫟木和蘋果混合后的培養(yǎng)料對香菇生長有一定促進作用，尤其在提升香菇產量和子實體品質方面，而櫟木和蘋果木混合作為基質是否還有最優(yōu)比例，以及蘋果木基質對子實體品質作用的機制都有待進一步研究，下一步可增加配方種類，并檢測菌棒中營養(yǎng)元素的變化，從而篩選出菌棒最優(yōu)配方，為提高香菇品質奠定理論基礎。