西瓜蔓枯病菌的分離與鑒定及種質(zhì)資源抗性評價

徐楚臻，劉金鑫，王喜慶，閆 聞，付永凱，李永剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院 哈爾濱 150069）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.]是葫蘆科西瓜屬植物，也被稱為夏瓜、寒瓜等，原產(chǎn)于非洲，自西域傳入中國[1]。西瓜是世界上重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物，而中國是世界上第一大西瓜生產(chǎn)國，占全球總產(chǎn)量的70%左右[2]。近年來，我國種植業(yè)不斷發(fā)展，西瓜栽培面積日漸擴(kuò)大，尤其是隨著設(shè)施瓜類栽培技術(shù)的逐漸推廣，導(dǎo)致許多瓜類病蟲害的大范圍流行，降低了西瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量[3]。西瓜蔓枯?。℅ummy stem blight）是一種真菌性土傳病害，發(fā)生范圍廣，且在整個生育期均可發(fā)病，可危害葉片、莖蔓和果實，其中莖蔓受害最為嚴(yán)重。據(jù)報道，西瓜蔓枯病發(fā)病率一般為15%～25%，嚴(yán)重時在60%～80%，病害流行時可使瓜田減產(chǎn)15%～30%，嚴(yán)重時可達(dá)80%，對西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)以及我國的瓜類產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成極大影響[4-6]。

國際上多認(rèn)為蔓枯病菌有性態(tài)為Didymellabryoniae，無 性 態(tài) 為Stagonosporopsis cucurbitacearum[7]，也有學(xué)者認(rèn)為在大多蔓枯病菌寄主植物上可同時發(fā)現(xiàn)無性孢子與有性子實體，所以劃分有性型和無性型意義不大[3]。2015 年，Stewart 等[7]明確，亞隔孢殼屬病菌由S.cucurbitacearum、S.caricae和S.citrulli3 個親緣關(guān)系相近的種組成，其中危害最廣的病原菌為S.cucurbitacearum。如今國際使用Stagonosporopsisspp.作為蔓枯病菌的學(xué)術(shù)名稱[8-9]。當(dāng)病原菌侵染幼苗的莖部時，起初呈水漬狀斑，迅速向上、下擴(kuò)展，隨后病斑可環(huán)繞莖部，迅速導(dǎo)致幼苗死亡。成株多于莖基部與節(jié)間發(fā)病，初期呈水浸狀灰綠色病斑，形狀多為棱形、橢圓及條形，后發(fā)展成黃白色凹陷病斑，病部龜裂，有時可見分泌形成的黃褐色膠狀物。后期病斑表面散生黑色小顆粒，環(huán)境濕度高時，病部腐爛，維管束外露，呈現(xiàn)麻絲狀[10-11]。

目前，瓜類蔓枯病的防治仍以化學(xué)防治為主，但該病害一般于中后期發(fā)病較重，西瓜是直接入口食物，化學(xué)殺菌劑的使用會對環(huán)境和人體健康造成較大危害，同時也極易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，選育抗病品種是防治瓜類蔓枯病最經(jīng)濟(jì)有效且安全的方法，而抗病種質(zhì)資源的篩選與鑒定是抗病育種工作的基礎(chǔ)。中國抗蔓枯病西瓜品種相對數(shù)量較少[3]。筆者對黑龍江省西瓜蔓枯病菌進(jìn)行了分離與鑒定，并對31 份西瓜種質(zhì)材料接種蔓枯病以鑒定其抗性，以期篩選出較為優(yōu)良的資源，為西瓜蔓枯病的抗病育種提供資源、技術(shù)方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試西瓜品種 供試31 份西瓜種質(zhì)資源以及致病性測定試驗中所選用的西瓜品種龍盛佳星，其中，WG-12、WG-16 和WG-31 為中果型，其他種質(zhì)為大果型，31 份西瓜種質(zhì)均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系哈爾濱試驗站提供。

1.1.2 供試病原菌 于2022 年7－8 月從黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院試驗地發(fā)病嚴(yán)重的地塊采集癥狀典型的西瓜蔓枯病病樣。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 采用組織分離法[12]，于病健交界處切取組織塊，依次用70%乙醇消毒30 s、1.5%次氯酸鈉處理5 min，無菌水漂洗3 次后置于無菌濾紙吸干水分。隨后將組織塊擺放于加入50 μg?mL-1鏈霉素的PDA 培養(yǎng)基平板上，26 ℃培養(yǎng)2～3 d 后挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化，使用純化后的菌株進(jìn)行單孢分離，將所獲菌株轉(zhuǎn)移至試管斜面培養(yǎng)，于4 ℃保存?zhèn)溆?。通過觀察菌落形態(tài)和孢子形態(tài)特征等方式對獲得的單孢株進(jìn)行初步鑒定。

為了進(jìn)一步明確病原菌的種類，將所有單孢株于PDA 平板上培養(yǎng)5 d，刮取適量病原菌菌絲，利用真菌基因組DNA 提取試劑盒（上海生工有限公司）提取DNA，采用通用引物細(xì)胞核核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed space，ITS）進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。使用PCR 擴(kuò)增儀（GeneAmpPCRSystem9700）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（50 μL）為：2×TaqMaster Mix 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工有限公司進(jìn)行純化及測序，使用Blast 對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比對，使用MEGA 7.0 通過Neighbor-joining 法構(gòu)建ITS 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，校驗參數(shù)設(shè)置為Bootstrap1000 次重復(fù)[13]。

表1 所用引物序列

1.2.2 病原菌的致病性測定 遵循柯赫氏法則[14]進(jìn)行致病性測定，參照Li 等[15]的方法，將單孢株在25 ℃培養(yǎng)7 d，誘導(dǎo)S.cucurbitacearum產(chǎn)生分生孢子并將其刮到無菌水中，經(jīng)3 層滅菌紗布過濾，通過血球計數(shù)板將濾液稀釋為1×106個孢子·mL-1的菌懸液，備用。

選取健康且生長一致的西瓜幼苗（3 片真葉期），采用孢子懸浮液噴霧法接種幼苗至植株飽和狀態(tài)，對照組用無菌水代替。接種后置于溫室（23±3）℃用塑料布保濕培養(yǎng)，每個處理15 株幼苗，3 次重復(fù)，采用完全隨機(jī)區(qū)組的試驗設(shè)計。接種后觀察發(fā)病情況，待植株發(fā)病充分且相對穩(wěn)定后進(jìn)行調(diào)查，參照張學(xué)軍等[16]的病害分級標(biāo)準(zhǔn)，并稍作調(diào)整。分級如下：0 級，無病斑；1 級，零星的小病斑；3 級，連續(xù)的小病斑或大病斑（沒有繞莖）；5 級，大病斑（繞莖）；7 級，莖部失水萎縮但植株并未死亡；9 級，莖部失水萎縮且全株死亡。

病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)査總株數(shù)×最高級代表值）×100。

致病力評價指標(biāo)：強(qiáng)致病力菌株（S），病情指數(shù)>60；中等致病力菌株（M），50<病情指數(shù)≤60；弱致病力菌株（W），病情指數(shù)≤50。

1.2.3 西瓜種質(zhì)資源的蔓枯病抗性評價 選取31份西瓜育種資源，在溫室內(nèi)利用育苗缽（8 cm×8 cm×5 cm）培養(yǎng)至3 片真葉期，選用1.2.2 中致病力最強(qiáng)的菌株作為接種的目標(biāo)病原菌，依據(jù)1.2.2的方法配制孢子懸浮液，采用噴霧接種法對31 種不同的種質(zhì)資源進(jìn)行病原菌接種，對照組采用無菌水代替孢子懸浮液。接種后置于溫室（23±3）℃用塑料布保濕培養(yǎng)，每個處理15 株幼苗，3 次重復(fù)，采用完全隨機(jī)區(qū)組的試驗設(shè)計。待植株充分發(fā)病且相對穩(wěn)定后調(diào)查，病害分級標(biāo)準(zhǔn)同上。

以病情指數(shù)作為評價依據(jù)，將不同品種劃分為6 個抗性等級[17]，分別為：免疫（IM），DI=0；高抗（HR），080。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0 軟件，通過Duncan 法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜蔓枯病菌的分離與鑒定

2022 年7－8 月在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院西瓜試驗地中發(fā)現(xiàn)較多莖蔓上疑似蔓枯病癥狀的西瓜植株（圖1）。采用組織分離法，從16 個西瓜植株上分離得到16 株形態(tài)學(xué)一致的真菌分離物，菌落正面呈灰白色，邊緣稀疏中間稠密，老化后出現(xiàn)不同層次的同心輪紋，菌落背面可見墨綠色輪圈，打開培養(yǎng)皿時可聞到“灰土味”（圖2）。分生孢子呈圓柱形或橢圓形，大小為（2.45～8.02）μm×（1.35～3.60）μm，大部分無隔膜，少數(shù)單隔膜（圖3-A，箭頭1）和雙隔膜（圖3-A，箭頭2）。依據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定16 株分離物為S.cucurbitacearum。

圖1 西瓜蔓枯病田間發(fā)病癥狀

圖2 16 株來自西瓜莖部真菌分離物的菌落形態(tài)

選取代表性菌株XG2，提取DNA，對內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所得片段大小為535 bp。將序列上傳 Genebank 數(shù)據(jù)庫，登錄號為OP930948，利用Blast 進(jìn)行同源性比較，顯示菌株XG2 與S.cucurbitacearumS2-5（MZ057819.1，ITS）的同源性為99.80%。使用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖3-B 所示，XG2 與S.cucurbitacearumR-J10（GU045303.1）、S.cucurbitacearumLHG-8（KM216012.1）、S.cucurbitacearumS2- 5（MZ057819.1）、S.cucurbitacearumZE（HQ914649.1）的親緣關(guān)系接近，相似性達(dá)99.00%，屬于同一進(jìn)化枝，同為S.cucurbitacearum。

圖3 來自西瓜莖部真菌分離物代表性菌株XG2 的分生孢子及系統(tǒng)發(fā)育樹

基于形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果表明，分離得到的代表性菌株XG2 為力強(qiáng)弱分為3 個等級。由表2 可以看出，菌株XG2、XG8、XG26、XG28 為強(qiáng)致病力菌株（S），4 個強(qiáng)致病力菌株的病情指數(shù)間均存在顯著差異，其中XG2 致病力最強(qiáng)，為96.00%；XG29、XG9、XG1、XG5、XG30、XG10、XG7、XG15 為中等致病力菌株（M），其中XG29 致病力最強(qiáng)，且病情指數(shù)僅與XG9、XG1 無顯著差異，與其他5 個菌株均存在顯著差異；XG11、XG21、XG12、XG13 為弱致病力菌S.cucurbitacearum。

表2 16 株西瓜蔓枯病菌的致病力測定

2.2 分離物的致病力測定

將得到的16 株真菌分離株，采用噴霧法接種至3 片真葉的西瓜幼苗上，發(fā)病幼苗均顯示出與田間發(fā)病株相同的癥狀，且從病斑上均能再次分離純化出相同的真菌分離物，根據(jù)柯赫氏法則明確了16株真菌分離物均為西瓜蔓枯病菌。依據(jù)病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)（圖4）進(jìn)行調(diào)查，將真菌分離物按照致病株（W），其中XG13 致病力最弱，病情指數(shù)為37.33%，與其他3 個菌株間存在顯著差異。

圖4 西瓜蔓枯病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)

2.3 31份西瓜種質(zhì)資源的蔓枯病抗性評價

由表3 可以看出，31 份西瓜種質(zhì)資源對西瓜蔓枯病菌的抗性表現(xiàn)為高感（HS）至抗病（R）水平。抗病 材 料 有5 份（16.13%）：PI 189225、WG-15、WG-27、PI 482307、WG-7，其中PI 189225 的抗性最強(qiáng)，病情指數(shù)為39.26，5 份抗病材料間病情指數(shù)無顯著差異；中抗材料有6 份（19.35%）：PI 271775、WG-31、龍盛619、WG-23、WG-20、雷首，其中PI 271775 抗性為中抗材料中最強(qiáng)，病情指數(shù)為51.11，且與WG-31、龍盛619 間差異不顯著，但與WG-23、WG-20、雷首間差異顯著；感病材料有10份（32.26%）：WG-8、Calhoun Gray、WG-4、WG-14、WG-1、中野2 號、WG-12、WG-21、WG-3、W22-59，其中感病最弱的材料為WG-8，病情指數(shù)為64.44，與其他9 份材料間均存在顯著差異；高感材料有10份（32.26%）：PI 299379、PI 635712、WG-6、WG-30、WG-22、WG-29、WG-26、WG-16、WG-28、WG-24，其中WG-24 病情指數(shù)為97.04，感病性最強(qiáng)，與同級別材料中WG-28 差異不顯著，與其他8 份材料均差異顯著。

表3 31 份西瓜種質(zhì)資源抗蔓枯病菌的評價

3 討論與結(jié)論

蔓枯病菌是危害葫蘆科作物的重要真菌病原物，主要危害西瓜、甜瓜、黃瓜、苦瓜、絲瓜等作物。近年來隨著氣候條件的改變，蔓枯病在全國范圍內(nèi)迅速流行起來，發(fā)病速度之快導(dǎo)致該病害極難防治，嚴(yán)重影響了我國乃至世界的瓜類產(chǎn)業(yè)。西瓜蔓枯病的致病菌為S.cucurbitacearum、S.citrulli和S.caricae3 種[18]，因形態(tài)學(xué)特征相似，難以將它們區(qū)分，所以需要借助分子生物學(xué)方法來準(zhǔn)確鑒定蔓枯致病菌[7-8]。因此，筆者采用真菌鑒定通用引物ITS，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育樹分析最終確定分離得到的西瓜蔓枯病致病菌均為S.cucurbitacearum。

西瓜蔓枯病是世界范圍內(nèi)西瓜栽培中發(fā)生最為嚴(yán)重的病害之一，解決該病害最安全、經(jīng)濟(jì)有效的途徑是選育并栽培抗病品種，抗性評價是抗性種質(zhì)資源篩選以及創(chuàng)新工作中的關(guān)鍵一環(huán)。我國西瓜種植區(qū)域廣，且各地區(qū)氣候差異極大，而環(huán)境條件突變可導(dǎo)致西瓜品種抗病性的喪失，因此選育適宜在當(dāng)?shù)卦耘喾N植且綜合性狀優(yōu)良的抗蔓枯病品種仍是今后的研究重點與難題[9,19]。

針對西瓜種質(zhì)資源抗蔓枯病的評價工作開展得較少，徐彥剛等[2]對不同地域來源的80 份西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行抗亞隔孢殼菌（S.citrulli）鑒定，沒有發(fā)現(xiàn)免疫資源，篩選到高抗材料2 份，抗性材料19份，中抗材料21 份，感病材料24 份，高感材料14份，抗性材料的占比達(dá)到33.34%。宋榮浩等[20]對收集引進(jìn)的42 份西瓜品種資源進(jìn)行了大田成株期及室內(nèi)苗期蔓枯病抗性的人工接種鑒定，沒有發(fā)現(xiàn)免疫和高抗品種，篩選出了8 個蔓枯病抗性較強(qiáng)同時兼具優(yōu)良農(nóng)藝性狀的品種材料。

總的說來，西瓜種質(zhì)資源缺乏對蔓枯病免疫和高抗的材料，但存在一定數(shù)量的中等抗性資源。通過對這些資源的抗性評價，為下一步抗病品種的培育及抗病機(jī)制的研究等提供了良好的材料和理論依據(jù)。筆者選取黑龍江地區(qū)分離得到的強(qiáng)致病力菌株XG2 作為接種真菌，對供試種質(zhì)資源進(jìn)行西瓜蔓枯病的抗性評價。從31 份西瓜種質(zhì)資源中篩選到5 份抗病材料和6 份中抗材料，10 份感病材料和10 份高感病材料，抗病與中抗材料的總占比為35.48%，其中抗性最強(qiáng)的西瓜材料為PI 189225。