膀胱尿路上皮癌蛋白組學(xué)相關(guān)個(gè)體化預(yù)后特征的推導(dǎo)與驗(yàn)證

黃永勝 黃彩娜 董學(xué)嶺 卓秀麗 房娟娟 宋文霞 張雨露 閻 磊 陳 剛 呂仁廣

1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿外科，山東 濟(jì)南 250012； 2.青島市市立醫(yī)院急診科，山東 青島 266000； 3.濟(jì)南市第七人民醫(yī)院泌尿外科，山東 濟(jì)南 250012； 4.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院德州醫(yī)院日間手術(shù)科，山東 德州 254300； 5.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院外科門(mén)診部，山東 濟(jì)南 250012； 6.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250117

膀胱癌在我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第1 位，是全球第10 大常見(jiàn)惡性腫瘤［1］。據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年約有573 278 例膀胱癌新發(fā)病例和212 536 例死亡病例［2］。95%的膀胱癌病理類型為尿路上皮癌（urothelial carcinoma，UC），其中30%為浸潤(rùn)型，70%為淺表型［3］。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的發(fā)病主要與長(zhǎng)期接觸化學(xué)物質(zhì)有關(guān)［4］。目前，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率極高［5］；對(duì)于晚期浸潤(rùn)性膀胱癌，根治性膀胱切除術(shù)和尿流改道術(shù)后患者的生存質(zhì)量不高［6］。高復(fù)發(fā)性及持續(xù)的化療使UC成為人均治療費(fèi)用最高的癌癥［7］。因此尋求新的腫瘤標(biāo)志物預(yù)測(cè)患者的生存率尤為重要。

蛋白質(zhì)組學(xué)是在特定條件下研究蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的科學(xué)［8］，癌癥蛋白質(zhì)組學(xué)研究旨在識(shí)別驅(qū)動(dòng)惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的功能性蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物以檢測(cè)早期癌癥、預(yù)測(cè)預(yù)后、確定治療方式、確定新的藥物靶點(diǎn)，并最終開(kāi)發(fā)個(gè)性化醫(yī)療［9］。相比于基因組學(xué)，蛋白質(zhì)能夠更直接的反映細(xì)胞表型，蛋白質(zhì)在癌癥發(fā)展的全程提供生物學(xué)信息［10］，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)可以直接檢查基因組畸變的后果［11］。癌癥蛋白組學(xué)已在三陰乳腺癌［12］、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移［13］、胃腸癌［14］、肝內(nèi)膽管癌［15］的預(yù)后中取得了進(jìn)展。目前關(guān)于公共數(shù)據(jù)庫(kù)提取UC預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)的研究較少，本研究通過(guò)癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas， TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)提取UC的蛋白組學(xué)、基因組學(xué)、臨床性狀、泛癌的數(shù)據(jù)，確定出蛋白組學(xué)相關(guān)預(yù)后特征（proteomics-related prognostic signatures，PRPS）并構(gòu)建預(yù)后模型，以期為尋找UC新的生物標(biāo)志物提供新思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

UC 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)（tsv 格式，343 例腫瘤樣本）、基因組學(xué)數(shù)據(jù)（RNA-seq，正常樣本19 例；腫瘤樣本411例）、患者的臨床性狀數(shù)據(jù)來(lái)自于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）。

1.2 PRPS的篩選及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（risk score， RS）預(yù)后模型和列線圖的構(gòu)建

根據(jù)多因素Cox 回歸模型PRPS 的回歸系數(shù)與表達(dá)值計(jì)算UC 患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（risk score， RS）。RS 表 達(dá) 式：βprotein1× EXPprotein1+βprotein2× EXPprotein2+ …… +βprotein6× EXPprotein6（EXP：蛋白的表達(dá)水平，β：回歸相關(guān)系數(shù)）。以RS 的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)將樣本分為高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組。在構(gòu)建RS預(yù)后模型后，將總體樣本隨機(jī)均分成訓(xùn)練集與測(cè)試集互為驗(yàn)證，以訓(xùn)練集RS 的中位值為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測(cè)試集進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分組，并分別進(jìn)行生存（Kaplan-Meier， KM）分析。采用主成分（principal componet analysis， PCA）分析對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分組進(jìn)行可視化；繪制預(yù)測(cè)患者生存率的臨床列線圖，并通過(guò)校準(zhǔn)曲線、受試者工作特征（receive operating characteristic， ROC）曲線與決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）評(píng)估其可靠性。

1.3 PRPS的基因組學(xué)分析及免疫組化驗(yàn)證

基因組學(xué)與蛋白組學(xué)在癌癥的生物學(xué)行為上互為補(bǔ)充，通過(guò)PubMed 中的Gene 模塊檢索出表達(dá)PRPS 的基因，對(duì)這些基因進(jìn)行泛癌分析、免疫組化分析及KM 分析。PRPS 的免疫組化結(jié)果來(lái)自于人類蛋白圖譜（Human Protein Atlas， HPA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.proteinatlas.org/）。

1.4 基因集富集分析

通過(guò)基因本體（gene ontology，GO）與KEGG 富集分析，分析PRPS在UC中的生物學(xué)功能。首先以P ＜0.05，logFC = 1，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR） ＜ 1為過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)得到在高、低風(fēng)險(xiǎn)分組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因。應(yīng)用C5 GO（c5.go.symbols.gmt）和C2 KEGG（c2.cp.kegg.symbols.gmt）基因集進(jìn)行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）（https：//www. gsea-msigdb. org/gsea/msigdb/index.jsp）。GO、KEGG 及GSEA分析的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜ 0.05，F(xiàn)DR ＜ 0.05。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)性分析

采用免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析探索UC患者TME的變化，計(jì)算UC 患者TME 中免疫細(xì)胞的含量。采用R語(yǔ)言“corrplot”包繪制免疫細(xì)胞相關(guān)性圖、“l(fā)imma”包分析免疫細(xì)胞在高、低風(fēng)險(xiǎn)分組的差異性、“fmsb”包繪制雷達(dá)圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析與圖表繪制均使用R 語(yǔ)言（4.2.1 版本）。Cox回歸模型通過(guò)“glmnet”包進(jìn)行；KM分析通過(guò)“survival、survminer”包 進(jìn)行；PCA 分析通過(guò)“scatterplot3d”包進(jìn)行；列線圖通過(guò)“survival”“regplot”和“rms”包繪制；ROC 曲線通過(guò)“timeROC”包進(jìn)行；用來(lái)進(jìn)行GSEA富集分析的數(shù)據(jù)集C5和C2來(lái) 自 于GSEA 富集分析網(wǎng)站（https：//www.gseamsigdb. org/gsea/msigdb/index. jsp）；UC 腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的含量通過(guò)“MCPcounter”包與CIBERSORT算法提取。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 PRPS的篩選

將患者的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)與生存數(shù)據(jù)合并得到用來(lái)進(jìn)行分析的總樣本，通過(guò)構(gòu)建單因素Cox 回歸模型得到差異蛋白共469個(gè)。再對(duì)單因素Cox回歸結(jié)果構(gòu)建多因素Cox回歸模型確定6個(gè)具有獨(dú)立預(yù)后意義的蛋白質(zhì)（EMA、‘PKA-a’、MCT4、ANNEXIN1、Atg4B、‘4EBP1_pT70’）作為PRPS，詳見(jiàn)表1。

表1 膀胱尿路上皮癌患者總樣本的單因素與多因素Cox回歸分析

2.2 RS預(yù)后模型及列線圖的構(gòu)建

在計(jì)算RS并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分組后，按照1∶1的比例隨機(jī)將樣本分為訓(xùn)練集與測(cè)試集。訓(xùn)練集與測(cè)試集臨床性狀相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)表2。對(duì)差異蛋白進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分組的差異分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化（圖1A）。PCA分析可見(jiàn)，根據(jù)PRPS的風(fēng)險(xiǎn)分組聚類（圖1B）比總樣本（圖1C）明顯增多。

表2 膀胱尿路上皮癌患者訓(xùn)練集與測(cè)試集臨床性狀差異分析［n（%）］

圖1 差異蛋白在風(fēng)險(xiǎn)分組的差異分析及風(fēng)險(xiǎn)分組的PCA結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)總樣本、訓(xùn)練集與測(cè)試集進(jìn)行生存分析?？倶颖綩S 與PFS 分析（圖2A，B）、訓(xùn)練集與訓(xùn)練集的OS 分析（圖2C，D）均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明高風(fēng)險(xiǎn)分組患者的生存時(shí)間明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)分組患者。

圖2 膀胱尿路上皮癌患者總樣本、訓(xùn)練集、測(cè)試集的KM分析結(jié)果

而后對(duì)總樣本（圖3A）、訓(xùn)練集（圖3B）、測(cè)試集（圖3C）分別構(gòu)建RS 預(yù)后模型，ROC 曲線顯示預(yù)測(cè)患者1 年、2 年、3 年生存率的AUC 值分別為0.710、0.709、0.719（總樣本），0.684、0.760、0.791（訓(xùn)練集），0.740、0.658、0.663（測(cè)試集）。

圖3 膀胱尿路上皮癌患者總樣本、訓(xùn)練集、測(cè)試集的RS預(yù)后模型與ROC曲線分析結(jié)果

臨床性狀的單因素與多因素Cox 回歸（表3）被用來(lái)確定UC 中起獨(dú)立預(yù)后作用的臨床性 狀（independent prognostic of clinical traits，IPCT）。

表3 膀胱尿路上皮癌患者臨床性狀的單因素與多因素Cox回歸分析

最后，開(kāi)發(fā)一個(gè)包括風(fēng)險(xiǎn)分組與IPCT的臨床列線圖，協(xié)助臨床醫(yī)生對(duì)UC患者的生存率進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。臨床性狀與風(fēng)險(xiǎn)分組的ROC 曲線與DCA 曲線表明，根據(jù)PRPS構(gòu)建的模型其預(yù)測(cè)能力是可靠的，另外，校準(zhǔn)曲線展現(xiàn)出列線圖對(duì)患者生存率的預(yù)測(cè)值與實(shí)際情況之間具有良好的一致性（圖4A ～ C）。

圖4 膀胱尿路上皮癌患者總樣本、訓(xùn)練集、測(cè)試集的列線圖、ROC曲線與DCA曲線、校準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.3 PRPS的基因組學(xué)驗(yàn)證

通過(guò)PubMed 檢索出表達(dá)PRPS 的基因（表4）。對(duì)這6 個(gè)基因分別進(jìn)行泛癌分析、免疫組化分析、KM 分析（圖5A ～ F）。發(fā)現(xiàn)PRPS 并非完全在基因組學(xué)及蛋白組學(xué)中表現(xiàn)一致，這也證實(shí)了二者在時(shí)間上的不平行，蛋白質(zhì)表達(dá)則更加接近細(xì)胞表型。

表4 PRPS及對(duì)應(yīng)的基因

2.4 PRPS的分子學(xué)機(jī)制探討

差異分析得到在高風(fēng)險(xiǎn)組中上調(diào)的基因721 個(gè)，低風(fēng)險(xiǎn)組中上調(diào)的基因319 個(gè)。GO 富集分析表明，體液免疫反應(yīng)等生物過(guò)程、膠原蛋白分子組成、信號(hào)受體激活劑活性的分子功能在高風(fēng)險(xiǎn)分組中高表達(dá)（圖6A）；KEGG富集分析表明，細(xì)胞因子與受體之間的相互作用、趨化因子信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等在高風(fēng)險(xiǎn)分組中高表達(dá)（圖6B）。對(duì)風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行GCEA富集分析發(fā)現(xiàn)，粒細(xì)胞、白細(xì)胞趨化性、髓系白細(xì)胞遷移、T細(xì)胞受體復(fù)合體等細(xì)胞功能在高風(fēng)險(xiǎn)組高表達(dá)（圖6C）；ATP合成耦合的電子運(yùn)輸、胞質(zhì)核糖體、呼吸系統(tǒng)、核糖體亞基及結(jié)構(gòu)成分等細(xì)胞功能在低風(fēng)險(xiǎn)組高表達(dá)（圖6D）。趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子及受體間的相互作用、焦點(diǎn)粘附、造血細(xì)胞系、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控等功能通路在高風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)（圖6E）；藥物代謝細(xì)胞色素p450、卟啉和葉綠素的代謝、視黃醇代謝、核糖體等功能通路在低風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)（圖6F）。

圖6 PRPS的GO、KEGG、GSEA富集分析結(jié)果

2.5 風(fēng)險(xiǎn)模型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性如圖7A 所示；雷達(dá)圖展現(xiàn)了風(fēng)險(xiǎn)分組中免疫細(xì)胞的表達(dá)（圖7B），并對(duì)表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的中性粒細(xì)胞與NK細(xì)胞進(jìn)行了可視化（圖7C，D）。

圖7 PRPS的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析結(jié)果

3 討 論

膀胱癌的發(fā)病率占全球癌癥的3%，五年生存率為77%，但發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者五年生存率僅5%［16］。自首次發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)可作為疾病風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物后［17］，生物標(biāo)志物便開(kāi)始在蛋白組學(xué)領(lǐng)域被深入研究［18］。目前臨床上組織和血漿［19］、體液［20］、藥物及代謝物檢測(cè)［21-22］是蛋白組學(xué)在疾病診斷中應(yīng)用的典型案例。蛋白組學(xué)和基因組學(xué)存在著時(shí)間差異性，結(jié)合基因組學(xué)與蛋白組學(xué)分析可以幫助人們更深入地了解UC發(fā)病機(jī)制。

蛋白組學(xué)作為表征生物系統(tǒng)的最相關(guān)數(shù)據(jù)集［23］，與基因組學(xué)互為補(bǔ)充［24］，這也在本研究方法中得到了體現(xiàn)。本研究使用Cox回歸模型確定出6個(gè)PRPS（EMA、`PKA-a`、MCT4、ANNEXIN1、Atg4B、`4EBP1_pT70`）。根據(jù)多因素Cox 回歸結(jié)果計(jì)算RS［25-26］，高風(fēng)險(xiǎn)組的OS 及PFS 要明顯比低風(fēng)險(xiǎn)組低。ROC曲線表明，本研究的風(fēng)險(xiǎn)模型相比于其他臨床性狀而言，具有較高的準(zhǔn)確性（AUC為0.710），提示本研究根據(jù)PRPS 構(gòu)建的模型在UC 患者的生存預(yù)后中具有指導(dǎo)意義。功能富集分析揭示了患病高風(fēng)險(xiǎn)人群分組中活躍的生物學(xué)功能與通路，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析進(jìn)一步探索了UC患者免疫治療的可能性與新思路。而基因組學(xué)分析結(jié)果印證了基因和蛋白時(shí)間表達(dá)的差異性，二者的臨床意義并非保持前后一致。

目前尚無(wú)通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出UC患者的PRPS 作為新的腫瘤標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者生存預(yù)后的報(bào)道。本蛋白組學(xué)研究在患者的生存預(yù)后中具有一定指導(dǎo)意義，識(shí)別出的PRPS 為在蛋白組學(xué)層面上尋找癌癥預(yù)后相關(guān)的新標(biāo)志物及對(duì)患者的精準(zhǔn)治療提供了新思路。但本研究具有一定的局限性，數(shù)據(jù)樣本來(lái)自于單一數(shù)據(jù)庫(kù)，尚未進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及人類樣本的驗(yàn)證和隨訪，其外部有效性仍需進(jìn)一步探究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突