高原耐鎘真菌的分離鑒定及吸附性質(zhì)研究

譚宇軒，李轅成，3*，張哲昊，毛林利，楊 浪

（1.大理大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理；2.云南省高校微生物生態(tài)修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理；3.昆明理工大學(xué) 冶金與能源工程學(xué)院，云南 昆明）

前言

隨著科技的不斷進(jìn)步及工農(nóng)業(yè)和城市化進(jìn)程逐步加快，人類對(duì)水資源的利用需求日益增加，污水排放量也隨之增加[1]，其中重金屬污染是水體污染的主要因素之一。當(dāng)前，我國(guó)正面臨著重金屬污染問(wèn)題[2]，重金屬的污染治理對(duì)人類生產(chǎn)生活和生物多樣性保護(hù)都至關(guān)重要。

然而，目前人們對(duì)排放污水的處理效率依然不高[3]，未經(jīng)過(guò)處理或未達(dá)到規(guī)定處理標(biāo)準(zhǔn)的污水進(jìn)入河流或地下導(dǎo)致水資源破壞加重。當(dāng)前，對(duì)水體重金屬污染的處理常采用化學(xué)沉淀法、離子交換法、光催化法、膜分離法、絮凝與混凝法及吸附法[4]。吸附法因其吸附材料來(lái)源廣泛且操作簡(jiǎn)單、具有較高的重金屬結(jié)合能力和較為寬泛的pH 范圍、對(duì)環(huán)境無(wú)二次污染以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)被人們?cè)诠I(yè)中廣泛使用。其中生物吸附法具有去除率高、處理成本低、生物吸附材料來(lái)源廣泛、吸附劑容易再生和無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因此在重金屬處理方面受到廣泛的關(guān)注[5]。微生物吸附法是通過(guò)某些微生物體本身及其胞外分泌物對(duì)吸附溶液中的金屬離子的方法，其操作相對(duì)簡(jiǎn)單、處理成本較低、對(duì)環(huán)境友好，在處理濃度較低且含多種重金屬?gòu)U水時(shí)具有良好的應(yīng)用前景[6]。因此，篩選具有重金屬吸附能力的微生物很重要。

鎘（Cd）是重金屬中毒性最強(qiáng)的金屬元素之一，工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的含鎘廢水、廢氣和廢渣、含鎘農(nóng)藥的廣泛運(yùn)用都可能造成水體及土壤重金屬污染[7]。鎘對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖具有很強(qiáng)的抑制性，因此高耐鎘的微生物的篩選及其吸附效果的研究相對(duì)較少。真菌相比細(xì)菌和放線菌具有更高的重金屬耐受性，通過(guò)其茂密的菌絲細(xì)胞壁上的大量幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、葡聚糖、甘露聚糖、脂類、多糖、色素等來(lái)吸附水溶液中的重金屬[8]，因此真菌也更具有重金屬吸附菌株開發(fā)潛力。本文通過(guò)篩選及馴化蒼山的土著菌株對(duì)水體重金屬鎘的吸附開展研究，具有重金屬鎘污染環(huán)境的生物修復(fù)提供參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)土壤來(lái)源

研究地點(diǎn)位于大理蒼山世界地質(zhì)公園周邊，海拔高度為2 286 m，地理位置北緯25°40 ′7″，東經(jīng)100°9′10″；在2021 年9 月份，使用土壤采集器采集距地表7～10 cm 的土壤作為樣品，保存至4 ℃冰箱中。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸；氫氧化鈉；瓊脂粉；葡萄糖；無(wú)水乙醇；水合氯化鎘，鎘元素標(biāo)準(zhǔn)溶液；砷元素標(biāo)準(zhǔn)溶液；TreliefTMPlant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP）；智能型光照培養(yǎng)箱；恒溫震蕩器；高速冷凍離心機(jī)；紫外潔凈工作臺(tái)；電子天平；循環(huán)水真空泵；超純水機(jī)；自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋；冷凍干燥機(jī)；微分干涉顯微鏡；數(shù)顯恒溫水浴鍋；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，瓊脂粉7 g，121 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（Potato Dextrose Broth，PDB）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

注：配置含重金屬培養(yǎng)基時(shí)，稱取適量水合氯化鎘固體粉末，在500 mL 容量瓶中溶解并定容后加入液體PDA 培養(yǎng)基中并于115 ℃滅菌30 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐鎘真菌的土壤采集

實(shí)驗(yàn)選取大理蒼山地質(zhì)公園周邊土壤，選取4 個(gè)樣方（0.5 m×0.5 m），樣方與樣方之間相隔10 m 以上；將土壤表層雜物和浮土去掉后，利用五點(diǎn)采樣法采集距地表7～10 cm 的土壤，采集后土壤混合均勻后用聚乙烯采樣袋收集并封口，保存于5 ℃的冰箱備用。

1.2.2 耐鎘真菌的篩選

稱取5 g 采集的土壤，與100 mL 無(wú)菌水充分混合后靜置1 h，用滅菌后的移液管吸取1mL 上清液加入到含鎘15 mg/L 的PDA 固體培養(yǎng)基中涂布，在27℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5 d，將其中生長(zhǎng)狀況好的單菌落逐步接種至更高濃度的平板中繼續(xù)馴化，最后將得到的單菌落轉(zhuǎn)接3 次以上進(jìn)行菌種純化，并保存于4 ℃的冰箱中。

利用平板劃線法篩選出一批生長(zhǎng)良好且耐低濃度重金屬鎘的微生物菌株，平板劃線純化后從中優(yōu)選出一株編號(hào)為H1 的真菌。通過(guò)水壓片觀察其菌絲形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊(cè)》（菌種初步鑒定依據(jù)的參考書）對(duì)H1 菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。將純化后的菌株接種到PDA 固體培養(yǎng)基上，27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，并于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 菌株的重金屬耐受性馴化

菌株H1 從初始含鎘濃度為15 mg/L 的平板中分離純化，并接種于含鎘濃度30 mg/L 的固體PDA 培養(yǎng)基中27 ℃生長(zhǎng)4 d 后，移接至鎘濃度為45 mg/L 的固體PDA 培養(yǎng)基中。以每次重金屬鎘濃度增加量15 mg/L 為周期，于27 ℃下恒溫培養(yǎng)，每隔4 d 轉(zhuǎn)接至下一濃度梯度，增加至固體PDA 培養(yǎng)基內(nèi)鎘濃度為150 mg/L，直至完成本輪重金屬耐受性馴化。再以鎘濃度增加量50 mg/L 為周期，27 ℃下培養(yǎng)5 d 后轉(zhuǎn)接至下一濃度梯度，并逐步增加濃度至培養(yǎng)基內(nèi)鎘濃度為450 mg/L，上述馴化過(guò)程每組均做3 次以上轉(zhuǎn)接。將馴化后的菌株H1 接種到不含鎘的固體培養(yǎng)基上，27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行保種，并于5 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 菌株的分子鑒定

將菌株H1 接種于固體PDA 培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)后，利用TreliefTMPlant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒提取總DNA，分子鑒定由上海生工生物工程股份有限公司完成。通用引物擴(kuò)增ITS 序列：正向引物ITS1-TCCGTA-GTGAACCTGGGG，反向引物ITS4-TCCTC-CGCTTATTGATATGC。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94℃，30 s；54 ℃，30 s；72℃，50 s；循環(huán)35 次；72 ℃，10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果，通過(guò)Blast 軟件在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比較，選取相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITSrDNA 基因序列，利用Clustal X 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用Saitou 和Nei 的鄰接法（Neighbor Joining）用MEGA 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.5 不同重金屬濃度脅迫下菌株的生長(zhǎng)曲線

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的耐鎘真菌分別接種至含鎘濃度為0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、300 mg/L 的固體PDA 培養(yǎng)基中，并選取10 mg/L 的含砷培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，置于室溫25 ℃下培養(yǎng)數(shù)日，每組濃度梯度均接種3 個(gè)平板以上，每隔12 h 用直尺測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，繪制不同濃度鎘脅迫下的微生物生長(zhǎng)曲線。

1.3 菌株對(duì)鎘的吸附特性研究

1.3.1 菌株生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)鎘的吸附

取100 mL 液體PDA 培養(yǎng)基移至250 mL 錐形瓶中加入Cd2+鎘溶液，使最終錐形瓶?jī)?nèi)鎘溶液濃度為50 mg/L 后滅菌，從菌落中切出接種基塊（5 mm×5 mm）將其加入到100 mL 液體PDA 培養(yǎng)基中，于室溫下每隔48 h 取樣，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，以只添加CdCl2而不接種菌株的PDA 液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，定期取樣。收集樣品后，5 000 r/min 離心10 min，取上清液抽濾后用ICP 測(cè)定Cd2+濃度。用吸附量（q）和吸附率（R）表征微生物對(duì)鎘的吸附，其計(jì)算方法如下[9-10]

式中，ρ0為溶液中Cd2+的初始質(zhì)量濃度；ρt為吸附t 時(shí)間后溶液中Cd2+的質(zhì)量濃度。

1.3.2 不同pH 下菌株對(duì)鎘的吸附

分別選擇pH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 作為液體PDA 培養(yǎng)基初始的pH，加入鎘溶液，使最終錐形瓶?jī)?nèi)鎘溶液濃度為50 mg/L 后滅菌，從菌落中切出接種基塊（5 mm×5 mm）將其加入到100 mL 液體PDA培養(yǎng)基中，180 r/min、25 ℃搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)至11 d 取菌懸液5 000 r/min 離心10 min 去除菌體，收集上清液后抽濾，用ICP 測(cè)定上清液的Cd2+濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)特征

圖1 為菌株H1 菌落形態(tài)圖，在PDA 平板上，培養(yǎng)初期H1 菌落為純白色，絨毛狀，生長(zhǎng)較慢。5 d 后菌體表面呈粉白色，菌落邊緣呈現(xiàn)粉色，有色素產(chǎn)生，背面逐漸變?yōu)楹旨t色且隨培養(yǎng)時(shí)間增加而顏色加深。在培養(yǎng)基表面逐漸形成絲束交織的厚膜，呈片狀且具有一定粘性，用接種針不易挑下。

圖1 菌株H1 的菌落形態(tài)(a)和微分干涉顯微鏡下的形態(tài)（放大倍數(shù)10×40）(b)

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)ITS 基因同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果得出，H1 與Epicoccum sorghinum 聚類在一起，且分支置信度為100%，因此H1 為Epicoccum sorghinum。

2.3 不同重金屬濃度脅迫下真菌的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖3

圖3 不同重金屬濃度下菌株H1 的生長(zhǎng)曲線

重金屬鎘的生物毒性較強(qiáng)，會(huì)隨著鎘濃度上升對(duì)馴化后菌株H1 菌絲生長(zhǎng)繁殖起抑制作用。菌株H1受重金屬Cd2+脅迫的程度隨著Cd2+添加濃度的不同而有一定差異。在不含Cd2+的培養(yǎng)基中，菌株H1 于5 d 達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在Cd2+濃度為50 mg/L 時(shí)，經(jīng)馴化后的菌株H1 的菌絲生長(zhǎng)速度明顯大于另外3 組高濃度中的菌株。而Cd2+濃度為100 mg/L 以上時(shí)會(huì)起一定刺激作用，在60～144 h 尤為明顯。

圖2 菌株H1 的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

這表明經(jīng)馴化后的菌株H1 可以耐一定量的重金屬鎘，在鎘濃度相對(duì)較低的條件時(shí)，菌株H1 生長(zhǎng)雖受到重金屬的生物毒性而被抑制，但細(xì)胞仍有活性，其用于吸附重金屬鎘的菌絲在固體條件下仍能以相對(duì)較快的速度完成正常的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)比10 mg/L 砷離子對(duì)菌株H1 的脅迫作用，低濃度砷離子相較高濃度的鎘離子對(duì)該菌株的生長(zhǎng)抑制不大，菌株H1 可以在較低濃度砷的條件下正常生長(zhǎng)。因此可將H1 接種于含鎘的液體PDA 培養(yǎng)基中進(jìn)一步測(cè)定其生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)鎘離子的吸附效果。

2.4 菌株生長(zhǎng)過(guò)程中及不同pH 條件下對(duì)鎘的吸附性研究

在吸附溫度為27 ℃，自然pH 下、Cd2+質(zhì)量濃度為50 mg/L 的100 mL 液體PDA 培養(yǎng)基中，菌株H1對(duì)于Cd2+的吸附量如圖4（a）所示。菌株H1 對(duì)重金屬鎘的吸附量會(huì)隨著菌株的穩(wěn)定生長(zhǎng)而增加，在第12 d時(shí)菌株H1 的生長(zhǎng)達(dá)到飽和，在14 d 時(shí)溶液內(nèi)重金屬鎘的濃度小幅上升。這充分說(shuō)明，Cd2+的濃度變化對(duì)菌株的生長(zhǎng)具有重要影響；隨著菌株H1 對(duì)Cd2+吸附量的增加，細(xì)胞表面對(duì)Cd2+的吸附逐漸達(dá)到飽和，細(xì)胞壁上對(duì)其產(chǎn)生的斥力也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)，造成金屬離子進(jìn)一步進(jìn)入到細(xì)胞表面的阻力增大，最后達(dá)到相對(duì)平衡階段。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株H1 對(duì)Cd2+的吸附量略有降低，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到14 d 時(shí)，表明隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，部分菌體開始老化死亡，甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，打破固液吸附的平衡，引起菌體吸附量下降且部分菌體吸附的鎘離子又重新溶解至液體中，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)溶液中鎘離子濃度小幅度上升。

圖4 菌株H1 生長(zhǎng)過(guò)程中及pH 環(huán)境下對(duì)Cd2+的吸附變化

真菌的生存生長(zhǎng)等所有的細(xì)胞代謝活動(dòng)與環(huán)境pH 息息相關(guān)。酸性環(huán)境雖然有利于金屬陽(yáng)離子的溶出和交換吸附，但是過(guò)低的環(huán)境pH 會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，影響最終的菌體量[11]。不同pH 下菌株H1 對(duì)Cd2+的吸附量見(jiàn)圖4（b）。過(guò)酸過(guò)堿對(duì)菌株H1 生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間有一定抑制作用。pH 在7.0～9.0 時(shí)，菌株H1 對(duì)Cd2+的吸附量較高（圖4（b））。這些結(jié)果表明雖然菌株H1 可以耐受一定的堿性環(huán)境，但堿性環(huán)境下細(xì)胞表面的活性官能基團(tuán)減少，吸附率也會(huì)受到影響。如圖4 所示，菌株H1 在pH=4.0～9.0 范圍內(nèi)均能吸附Cd2+，最適宜pH 為8.0。

3 結(jié)論

大理蒼山地質(zhì)公園周邊土壤分離純化出的土著耐鎘真菌H1 為Epicoccum sorghinum，該菌可在濃度為300 mg/L 的鎘污染環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)。

在初始Cd2+濃度為50 mg/L、溫度為25 ℃、自然pH、振蕩培養(yǎng)條件下，菌體對(duì)鎘的最大吸附量為41.73 mg/L，最大吸附率為83.4%；菌株H1 在pH 范圍4.0～9.0 內(nèi)均可吸附溶液中的重金屬鎘，其最適吸附pH 為8.0，該pH 下吸附量為39.59 mg/L，吸附效率為79.1%。

本研究結(jié)果充分說(shuō)明菌株H1 可在鎘污染濃度較高的條件下存活，并且具備較高的重金屬吸附量，在不同pH 的環(huán)境下仍能發(fā)揮作用，因此菌株H1 具有一定的重金屬鎘污染環(huán)境下的修復(fù)應(yīng)用潛能。