運輸密度對團頭魴肌肉特性的影響

彭 玲，尤 娟，汪 蘭，廖 濤，熊善柏，尹 濤

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心(武漢)，武漢 430070；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點實驗室，武漢 430064)

團頭魴(Megalobramaamblycephala)的養(yǎng)殖地主要分布在湖北和江蘇等省份，其以鮮活零售為主。目前，商業(yè)上主要依靠配備氧氣罐、水箱的活魚運輸車來實現(xiàn)鮮活團頭魴的跨地域調(diào)配。運輸過程中活魚會受到環(huán)境脅迫(擁擠脅迫、氨氮脅迫和缺氧脅迫等)，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，進而影響肌肉品質(zhì)[1]。運輸過程中影響應(yīng)激反應(yīng)的因素包括運輸時間、運輸密度和運輸溫度等。

采用高密度運輸(高魚水質(zhì)量比)可提高運輸箱空間利用率，降低運輸成本。但是，當(dāng)魚體處于較高生物密度的環(huán)境中，容易產(chǎn)生密度脅迫(擁擠脅迫)，發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，影響魚體的生理代謝，導(dǎo)致免疫防御功能下降，從而影響魚肌肉品質(zhì)[2]。研究表明，高密度運輸會導(dǎo)致水中總氨氮含量顯著升高，魚體血清皮質(zhì)醇、血糖及乳酸含量顯著升高[3-4]，糖原含量顯著降低[4]，肌肉質(zhì)構(gòu)特性顯著變化[5]。銀鯧(Pampusargenteus)[3]和大黃魚(Larimichthyscrocea)[4]適宜的運輸密度應(yīng)分別低于16 g/L和8 g/L。因此，需要從經(jīng)濟效益和肌肉品質(zhì)兩方面綜合考慮適宜的運輸密度。但是，關(guān)于運輸密度如何影響團頭魴肌肉品質(zhì)的研究還未見報道。因此，本研究模擬團頭魴活魚運輸過程，利用質(zhì)構(gòu)儀、光學(xué)電鏡、超高效液相色譜儀等技術(shù)手段研究運輸密度(魚水質(zhì)量比)對團頭魴肌肉品質(zhì)的影響，以期為維持團頭魴品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

團頭魴40尾，平均體長(34.50±3.01)cm、體質(zhì)量(572.37±25.00)g，購自湖北省武漢市東西湖養(yǎng)殖基地。

1.1.2 實驗試劑

無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅，均為分析純，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。甲醇、乙腈，均為色譜純，均購買自美國Muskegon公司。乳酸、糖原試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。次黃嘌呤(hypoxanthine，Hx)、次黃嘌呤核苷(inosine，HxR)、5′-次黃嘌呤核苷酸(5′-inosinic acid，IMP)、5′-一磷酸腺苷(adenosine-5′-monophosphate，AMP)、 5′-二磷酸腺苷(adenosine-5′-diphosphate，ADP)、5′-三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosphate，ATP)均為色譜純，均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

汽車模擬運輸平臺，星梭智能設(shè)備(廈門)有限公司；氣體匯流排，上海擎煌貿(mào)易有限公司；氧氣，武漢雙龍和商貿(mào)有限責(zé)任公司；TESTO 205 pH測量儀，德圖儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司；分析天平，上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；TGL-16GA臺式高速離心機，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；CR-400型色差儀，日本柯尼卡美能達公司；SD-700魚糜彈性測定儀，日本太陽科學(xué)公司；IKA2000型高速分散均質(zhì)機，德國IKA儀器設(shè)備有限公司；BS210型電子分析天平，德國賽多利斯公司；UPT-I-10/20高純水制備儀，上海向帆儀器有限公司。Acquity UPLC-H Class超高效液相色譜儀，美國Waters公司；EclipseCi光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬運輸實驗

團頭魴捕撈后，隨機分成4組，每組10尾，轉(zhuǎn)入塑料保溫箱(54.5 cm×37 cm×34.5 cm)中，按照其重量加入1.0、1.5、2.0、2.5倍重量的水，設(shè)置運輸密度(魚質(zhì)量：水質(zhì)量)為1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5，加入冰袋。團頭魴在2 h內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇遥俎D(zhuǎn)置到模擬運輸平臺上繼續(xù)運輸，在該過程中保持振動頻率為120 r/min。在全程運輸過程中(運輸時間從捕撈后開始算起，共運輸6 h)，保持水溫(12±3)℃，溶氧>10 mg/L。實驗中運輸程序和條件參考中國運輸團頭魴的商業(yè)化模式[1]。

1.3.2 取樣

從4個運輸箱中分別取運輸密度(魚質(zhì)量：水質(zhì)量)為1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5的魚各3尾。將魚體分割后，取自背鰭以下、側(cè)線以上的背部肌肉。魚肉切成20 mm×20 mm×10 mm小塊，用于色度、質(zhì)構(gòu)分析；剩余背部肌肉一部分用于測pH、持水性、細胞結(jié)構(gòu)，一部分-80 ℃冷凍，后面用于測乳酸、肌糖原、ATP及其代謝關(guān)聯(lián)產(chǎn)物。

1.3.3 肌肉pH值測定

參考文獻[6]的方法，略有改動。將插入式pH計(TESTO 205)的電極插入魚背部肌肉中，顯示屏讀數(shù)即為團頭魴背部肌肉的pH值。

1.3.4 色度測定

參考文獻[6]的方法，略有改動。采用CR-400便攜式色彩色差計，標(biāo)準(zhǔn)白板校準(zhǔn)，記錄下L*、a*、b*。

式中：W表示樣品的白度；L*值表示樣品的亮度；a*值為正表示樣品偏紅，為負表示樣品偏綠；b*值為正表示樣品偏黃，為負表示樣品偏藍。

1.3.5 剪切力測定

參考文獻[6]的剪切力測定方法，略有改動。團頭魴用配有刀片(直徑15 mm)的小型質(zhì)構(gòu)儀以60 mm/min的速度，垂直肌纖維的方向切割團頭魴魚塊。將剪切力記錄為測量過程中的最大力(g)。

1.3.6 持水性測定

參考文獻[7]的方法，略有改動。稱取約3 g樣品用雙層定性濾紙包裹，4 000 r/min離心15 min。以離心前后樣品質(zhì)量的比值表示持水性(water holding capacity，WHC)。

1.3.7 乳酸和肌糖原測定

采用南京建成生物工程研究所的乳酸和肌糖原試劑盒，按照其說明書進行測定。糖原測定波長為620 nm，乳酸測定波長為530 nm。

1.3.8 ATP及其代謝關(guān)聯(lián)產(chǎn)物測定

樣品采用超高效液相色譜儀(UPLC)進行分離鑒定，參考文獻[8]的方法。在ACQUITY UPLC BEH Amide(1.7 μm，2.1 mm×100 mm，Waters)的色譜柱上進行分離。流動相組成A：乙腈，B：10 mmol/L 磷酸二氫鈉，C：0.1%(V/V)磷酸水溶液；梯度體系由按A、B、C流動相不同濃度配比組成(0～6 min，88%～80% A，7%～17.5% B；6～8 min，80%～77% A，17.5%～22% B；8～9 min，77%～65% A，22%～35% B；9～10.7 min，65%～55% A，35%～45% B；10.7～10.80 min，55%～88% A，45%～7% B；10.8～23 min，88% A，7% B)。色譜分離條件設(shè)置如下：柱溫50 ℃；流速0.5 mL/min；進樣量5 μL。

1.3.9 細胞結(jié)構(gòu)觀察

參考文獻[6]的測定方法，略有改動。團頭魴背部肌肉切成約10 mm×10 mm×10 mm，用4%多聚甲醛溶液固定過夜后進行石蠟切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色、脫水封片。用光學(xué)顯微鏡對處理好的樣品進行全景掃描，并使用Pannoramic Viewer顯示。采集圖像的放大倍數(shù)為100倍。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2021軟件作圖，用SAS V8軟件進行分析，顯著性方法為最小顯著性差異法LSD(Least Significant Difference)，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 肌肉糖原、乳酸和pH值

不同運輸密度下肌肉中糖原、乳酸和pH值含量變化如表1所示。運輸密度的魚水比從1∶2.5升高至1∶1.5時，肌糖原含量從0.85 mg/g顯著減少為0.44 mg/g，乳酸從2.40 mg/g prot顯著增加為3.76 mg/g prot，肌肉pH值從6.65顯著下降為6.48。當(dāng)運輸密度繼續(xù)增加至1∶1.0時，肌糖原、乳酸、pH分別增加到0.87 mg/g、4.00 mg/g port、6.54。

表1 運輸密度對團頭魴背部肌肉糖原、乳酸和pH值的影響

2.2 色度

隨著運輸密度的升高(1∶2.5～1∶1.0)，團頭魴背部肌肉的亮度值(L*)、白度(W)先下降再增加。紅度值(a*)無顯著變化，藍度值(b*)先下降后升高(表2)。當(dāng)運輸密度的魚水比為1∶1.5時，團頭魴的L*值、W值最低，分別為47.24、47.20。而當(dāng)運輸密度的魚水比升高至1∶1.0時，團頭魴的L*值、W值分別顯著升高至50.13、50.09。

表2 運輸密度對團頭魴背部肌肉色度的影響

2.3 剪切力

如圖1所示，當(dāng)運輸密度的魚水比為1∶2.5時，團頭魴肌肉的剪切力為398.75 g，魚水比為1∶2.0時升高至412.78 g，但二者無顯著性差異。當(dāng)運輸密度的魚水比為1∶1.5時，剪切力顯著下降，為348.14 g，與運輸密度的魚水比為1∶2.0時相比下降了15%。然而當(dāng)運輸密度繼續(xù)增加到魚水比為1∶1.0時，剪切力增加到378.50 g。結(jié)果顯示剪切力隨著運輸密度的升高，呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢。

圖1 運輸密度對團頭魴背部肌肉剪切力的影響

2.4 持水性

如圖2所示，當(dāng)運輸密度為1∶2.5時，團頭魴肌肉的持水性為73.03%；1∶2.0時下降為72.51%，但二者無顯著性差異。當(dāng)運輸密度為1∶1.5時，持水性為66.29%，與運輸密度1∶2.0時相比持水性顯著下降。運輸密度繼續(xù)增加至1∶1.0時，持水性顯著上升為69.66%。結(jié)果顯示，持水性隨著運輸密度的升高，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。

圖2 運輸密度對團頭魴背部肌肉持水性的影響

2.5 ATP及其代謝關(guān)聯(lián)產(chǎn)物

如表3可知，隨著運輸密度的增加，ATP、ADP、AMP的含量均無顯著性變化。當(dāng)魚水比為1∶2.5時，IMP的含量為 626.46 mg/100 g。運輸密度增加后，IMP的含量顯著下降。魚水比為1∶2.0、1∶1.5和1∶1.0時，IMP的含量分別為554.56、578.38、576.97 mg/100 g。HxR和Hx含量在運輸密度的魚水比為1∶2.5分別為55.22 mg/100 g和9.94 mg/100 g，它們的總量為65.16 mg/100 g。隨著運輸密度的增加，HxR和Hx的總量先增加后降低。在1∶1.5時，HxR和Hx總含量值最高，為153.16 mg/100 g。

表3 運輸密度對團頭魴背部肌肉ATP及其關(guān)聯(lián)代謝產(chǎn)物的影響

2.6 細胞結(jié)構(gòu)

圖3所示，隨著運輸密度的魚水比從1∶2.5增加到1∶1.5，團頭魴肌肉細胞外間隙逐漸增大、破碎率逐漸增加。當(dāng)運輸密度繼續(xù)增加至1∶1.0時，其細胞外間隙較1∶1.5時小，破碎率也較低。

3 討論

3.1 肌肉糖原、乳酸和pH值

本研究結(jié)果表明，隨著運輸密度的增加，團頭魴肌肉糖原和pH呈下降趨勢，而乳酸含量呈現(xiàn)增加的趨勢，其原因與魚體應(yīng)激有關(guān)[1,9]。這和彭士明等[3]報道的銀鯧魚在受到更高魚密度的擁擠脅迫后肌肉中乳酸含量升高的結(jié)果一致。乳酸、肌糖原和pH變化的原因可能是：(1)在運輸過程中，魚體之間為了空間、溶氧等競爭，導(dǎo)致魚鱗脫落、魚體損傷，并且魚體在高密度運輸過程中受到更高的擁擠脅迫后應(yīng)激反應(yīng)繼續(xù)加劇，肌肉中儲備的能量快速被消耗，厭氧糖酵解反應(yīng)加快，生成乳酸后在肌肉中積累[10,11]；(2)有水活運過程中的運輸箱中水質(zhì)氨氮濃度上升，導(dǎo)致魚體發(fā)生氨氮脅迫，肌肉pH值下降[12]；(3)由于擁擠脅迫可能會改變魚肌肉中賴氨酸受體(RyR)的活性，使得鈣大量釋放到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致肌肉收縮加快，厭氧糖酵解加速，乳酸積累，pH下降[13]。

本研究中隨著魚水比從1∶2.5增加至1∶1.5，氨氮濃度升高速率更快、擠壓碰撞頻率更高，使得魚體應(yīng)激反應(yīng)更強烈。并且運輸過程中魚體呼吸產(chǎn)生大量CO2，降低肌紅蛋白和氧的結(jié)合能力，無氧消耗糖原和ATP等能量物質(zhì)加劇，造成乳酸積累，從而pH下降。運輸密度持續(xù)增加，能量物質(zhì)消耗加快(表1)，乳酸含量繼續(xù)增加[2]。在當(dāng)運輸密度的魚水比從1∶1.5增加至1∶1.0時，pH有所增加?？赡苁怯捎谶\輸密度進一步增加，雖然碰撞頻率增加，但是魚體間距離縮短導(dǎo)致碰撞動量降低，可能減緩魚體應(yīng)激反應(yīng)。另一方面，魚體呼吸產(chǎn)生大量的CO2，導(dǎo)致水體中CO2濃度過高。高濃度CO2對魚類有麻醉作用，可能使魚體處于半休眠或休眠狀態(tài)[14]，此時魚體應(yīng)激反應(yīng)可能減弱。所以肌糖原含量在運輸密度的魚水比為1∶1.5時最低，可能與魚體在此條件下受到的應(yīng)激強度最大有關(guān)。肌糖原的消耗與應(yīng)激反應(yīng)強度正相關(guān)。運輸密度增加，應(yīng)激反應(yīng)增強，所以肌糖原的消耗量增加。而運輸密度增加到魚水比1∶1.0時，碰撞動量小、CO2濃度高，魚體應(yīng)激反應(yīng)可能減弱，導(dǎo)致肌糖原的消耗量減少。

3.2 色度

魚肌肉主要是以白肌為主，高品質(zhì)的魚肉潔白并具有光澤。從整體而言，隨著運輸密度升高，團頭魴肌肉的亮度值(L*)、白度(W)呈現(xiàn)下降趨勢，表明高密度運輸后，肌肉存在雜色和光澤度降低，并逐漸變暗。VAN等[15]研究表明，密度脅迫導(dǎo)致高密度的真鯛(Pagruspagrus)肌肉亮度低于低密度組，這與本研究的結(jié)果相似。高密度運輸導(dǎo)致團頭魴色度變化可能是由于肌肉中的低pH值和ATP缺乏導(dǎo)致高鐵肌紅蛋白快速增長[16]。

3.3 剪切力

團頭魴肌肉剪切力隨運輸密度變化的趨勢，與LEFEVRE等[17]報道的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在擁擠脅迫增加后肉質(zhì)變軟的結(jié)果基本一致。剪切力下降的原因可能主要是與肌肉結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)[18,19]。當(dāng)運輸密度的魚水比從1∶2.5增加至1∶1.5時，團頭魴肌肉細胞破裂加劇，細胞間隙變大(圖3)。有研究表明在肌肉纖維細胞中表達的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是與魚肉質(zhì)變化有關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其活化水平與肉質(zhì)呈顯著正相關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化水平易受到氨氮濃度影響[20]。因此，運輸密度增加，可能增強氨氮應(yīng)激對肌肉核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性的損害，進而引起魚肉品質(zhì)劣變。

3.4 持水性

高密度運輸后團頭魴肌肉處于低pH值狀態(tài)，導(dǎo)致肌原纖維蛋白表面上凈電荷數(shù)量減少，喪失肌肉部分保水能力[21]。持水性還與細胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，一般完整、均勻的細胞結(jié)構(gòu)具有較高的持水性[22]。肌肉細胞結(jié)構(gòu)破裂，會造成組織液流失，持水性將會下降[23]。運輸密度為1∶1.5時，魚體應(yīng)激反應(yīng)最激烈，造成魚肌肉的pH最低和細胞結(jié)構(gòu)顯著破壞，所以此條件下持水性最低。

3.5 ATP及其代謝關(guān)聯(lián)產(chǎn)物

實驗結(jié)果中，IMP含量占最大的比重，表明該物質(zhì)是魚肉中主要核苷酸類滋味物質(zhì)，與曹杰等[24]的研究結(jié)果一致。運輸過程中魚體優(yōu)先消耗ATP 、ADP、AMP供能量。當(dāng)這些能量中間物質(zhì)含量不足時，儲存的糖原逐漸降解為ATP等能量物質(zhì)，以保持能量持續(xù)供應(yīng)。在不同運輸密度下，ATP、ADP、AMP 的消耗和合成可能處于平衡狀態(tài)，因此它們含量之間并沒顯著性變化。隨著運輸密度的增加，由于應(yīng)激反應(yīng)加劇，更多ATP、ADP、AMP降解，造成HxR和Hx積累。HxR和Hx是苦味物質(zhì)[25]，當(dāng)運輸密度的魚水比為1∶1.5時，HxR和Hx的含量最高，可能是與該運輸密度下應(yīng)激反應(yīng)最強烈有關(guān)。

3.6 細胞結(jié)構(gòu)

隨著運輸密度的增加團頭魴肌肉細胞外間隙逐漸增大、破碎率逐漸增加。此實驗現(xiàn)象與LEFEVRE等[17]觀察到的更高魚體密度下?lián)頂D脅迫造成虹鱒肌纖維直徑下降的結(jié)果相似。在團頭魴運輸過程中，在各種環(huán)境因素的刺激下會導(dǎo)致魚類產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進而發(fā)生脂質(zhì)過氧化，細胞會釋放溶酶體酶來破壞細胞膜，引起細胞破裂、組織損傷[26]，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡或自噬[27]。隨著運輸密度增加，魚體的擠壓脅迫作用增強，可能增強魚體應(yīng)激反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，運輸密度的魚水比1∶1.5時細胞受到的損傷最大，其原因可能與該條件下受到的氧化應(yīng)激行為最為強烈有關(guān)。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明運輸密度會顯著影響魚肉的質(zhì)構(gòu)、色澤和滋味等品質(zhì)。隨著運輸密度的魚水比增加，團頭魴肌肉的剪切力和持水性先降低后升高，乳酸含量逐漸增加，苦味物質(zhì)HxR和Hx的總含量先增加后降低，鮮味物質(zhì)IMP先降低然后無顯著性變化，說明肌肉品質(zhì)先降低后升高。品質(zhì)的變化原因可能主要與擠壓脅迫應(yīng)激對能量物質(zhì)和細胞結(jié)構(gòu)的影響有關(guān)。綜合肌肉品質(zhì)和運輸成本，魚水比為1∶1.0是較適宜的運輸條件，這也與實際商業(yè)運輸中采用的條件相一致。