低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

陳會(huì)琴，胡 青,2，孔令富,2，嚴(yán) 暉,2，趙 耀，畢保良,2

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，高原漁業(yè)學(xué)院，昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)高原漁業(yè)資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201)

鱘作為魚(yú)類中最原始的群體，是迄今為止發(fā)現(xiàn)起源最早的脊椎動(dòng)物之一。目前世界上大約有鱘2科6屬27種，其中大部分野生種類瀕臨滅絕，屬世界性保護(hù)物種[1]。多年來(lái)，鱘被大量捕撈以獲取魚(yú)子，鱘魚(yú)子在國(guó)際市場(chǎng)上享有“黑珍珠”之稱，是國(guó)際上經(jīng)久不衰的名貴高檔食品[2]。但因過(guò)度捕撈、種質(zhì)退化和棲息地的喪失，導(dǎo)致許多鱘產(chǎn)業(yè)的衰退。因此，通過(guò)對(duì)人工鱘養(yǎng)殖條件的研究，能減少人類對(duì)野生資源的開(kāi)發(fā)和利用，進(jìn)而推動(dòng)我國(guó)鱘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

西雜鱘(Acipenserbaerii♀×A.schrenckii♂)作為廣鹽性魚(yú)類，環(huán)境鹽度變化會(huì)引起多種生理應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明鹽度變化會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的血清生化指標(biāo)[3]及血清激素水平[4-5]等造成重要影響，而水產(chǎn)動(dòng)物可以通過(guò)改變血清離子濃度[6-7]以及鰓、腎和腸的Na+-K+-ATP酶活性[8]來(lái)適應(yīng)環(huán)境鹽度的改變，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓的平衡。此外，魚(yú)類的內(nèi)分泌活動(dòng)，包括皮質(zhì)醇、甲狀腺激素(triiodothyronine,T3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulinlike growth factor,igf-Ⅰ)和性腺發(fā)育相關(guān)基因等[9]都在滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要作用。鹽度應(yīng)激對(duì)免疫反應(yīng)也有雙向影響，它可能抑制或增強(qiáng)某些免疫參數(shù)，具體取決于暴露的劑量和持續(xù)時(shí)間[10]。應(yīng)激不僅影響先天免疫反應(yīng)，而且影響炎癥、獲得性免疫相關(guān)基因的表達(dá)。例如，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)在多種內(nèi)源性和外源性化合物的細(xì)胞解毒過(guò)程中起著非常重要的作用，hsp70和hsp27則介導(dǎo)應(yīng)激過(guò)程中變性蛋白的修復(fù)[11]。因此，鹽度是影響廣鹽性魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。然而，目前研究鹽度變化對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育、離子調(diào)節(jié)、應(yīng)激和免疫相關(guān)基因等眾多參數(shù)的聯(lián)合分析仍然缺乏。因此，本研究旨在通過(guò)測(cè)定血清生化指標(biāo)、激素水平、生長(zhǎng)發(fā)育和免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平，研究低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)的影響，以期在低鹽環(huán)境下獲得生長(zhǎng)快、疾病少、適應(yīng)能力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的西雜鱘，同時(shí)豐富西雜鱘的相關(guān)研究數(shù)據(jù)，為西雜鱘生產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的低鹽馴化養(yǎng)殖模式的推廣提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

西雜鱘幼魚(yú)購(gòu)自云南省會(huì)澤縣滇澤水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d，水溫10～12 ℃，每天定時(shí)投喂，日投餌量為魚(yú)體質(zhì)量的2%～3%，日換水率為50%。選擇90條體質(zhì)量為(8.1±0.1) g、健康活潑的個(gè)體用于低鹽馴化實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)鹽度組(0‰、4‰、8‰)，分別記為S0、S4、S8，每個(gè)鹽度組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行10條魚(yú)。S0為對(duì)照組，S4處理組,每1d增加1個(gè)鹽度，S8處理組每1d增加2個(gè)鹽度，逐漸升高水體鹽度，在同一時(shí)間內(nèi)升到最終設(shè)定鹽度，并馴養(yǎng)15 d。每日10：00和19：00飼喂商品日糧(粗蛋白質(zhì)42%，粗脂肪12%，粗纖維6.0%，由昆明恒大飼料有限公司提供)2次，每天喂食前換1/3～2/3水，并補(bǔ)充相應(yīng)鹽度的水。S4和S8處理組用水由實(shí)驗(yàn)用水與海水晶配置而成，并用鹽度計(jì)(LYT-610，上海淋譽(yù)貿(mào)易有限公司)進(jìn)行校正和檢測(cè)水體鹽度。水質(zhì)參數(shù)：pH值(7～8.5)，氨氮<0.5 mg/L，亞硝酸鹽<0.1 mg/L，溶解氧>6 mg/L。實(shí)驗(yàn)期間，觀察和記錄實(shí)驗(yàn)魚(yú)的日常行為，并用鹽度計(jì)監(jiān)測(cè)水體，使鹽度始終維持在設(shè)定的范圍內(nèi)。

1.3 樣本采集

采樣前禁食24 h，MS222(100 mg/L)麻醉后稱重(g)、測(cè)量體長(zhǎng)(cm)和全長(zhǎng)(cm)。用一次性無(wú)菌注射器從尾動(dòng)脈取血，置于1.5 mL離心管中，靜置一段時(shí)間后，離心(1 500 r/min，30 min)取上清，于-80 ℃保存，用于血清生化指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)及激素的測(cè)定。打開(kāi)腹腔及鰓蓋，采集鰓、腎、腸組織，于-80 ℃保存，用于Na+-K+-ATP酶活性的測(cè)定。另外，采集肝臟和腦組織，放入2.0 mL RNase-free離心管中，于-80 ℃保存，用于基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、血糖(GLU)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)的測(cè)定根據(jù)北京盒子生工科技有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。總蛋白(TP)的測(cè)定根據(jù)北京酷來(lái)博科技有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血清Na+、Cl-的測(cè)定根據(jù)南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。甲狀腺激素分別為三碘甲腺原氨酸(T3)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)的測(cè)定根據(jù)北京北方生物技術(shù)研究所有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。皮質(zhì)醇的測(cè)定根據(jù)上海酶聯(lián)生物科技有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 Na+-K+-ATP酶活性的測(cè)定

稱取西雜鱘幼魚(yú)鰓、腎、腸組織各0.1 g，生理鹽水潤(rùn)洗后，測(cè)定步驟根據(jù)北京盒子生工科技有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 基因表達(dá)量的測(cè)定

按照Total RNA Isolation Reagent Kit(biosharp)說(shuō)明書(shū)提取肝臟和腦組織總RNA。用超微量分光光度計(jì)(NanoPhotometer NP 80 Touch，德國(guó))檢測(cè)總RNA濃度和純度，D260 nm/D280 nm處于1.8～2.0之間。采用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(擎科生物科技有限公司)將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存，用于基因表達(dá)量的測(cè)定。

實(shí)時(shí)熒光定量在CFX ConnectTM Optics Module(Bio-Rad，美國(guó))下進(jìn)行，以18S RNA為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：2×T5 Fast qPCR mix(SYBP Green I)(擎科生物科技有限公司)10 μL，正、反引物各1 μL，cDNA模板2 μL，無(wú)菌水6 μL。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)基因均設(shè)陰性對(duì)照(不含cDNA)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性20 s，退火20 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸10 min。用2-△△Ct計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量[12]。

表1 本試驗(yàn)所用引物

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行分析，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)Tukey法檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。根據(jù)結(jié)果使用Prism軟件繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響如圖1所示，鱘幼魚(yú)在3個(gè)不同鹽度水體中馴養(yǎng)15 d后其體質(zhì)量(g)，體長(zhǎng)(cm)和全長(zhǎng)(cm)，組間均無(wú)顯著差異。

圖1 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)體長(zhǎng)、全長(zhǎng)、體質(zhì)量的影響

2.2 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)的影響

低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)的影響如表2所示，3個(gè)鹽度組西雜鱘幼魚(yú)其血糖、總蛋白、總膽固醇、甘油三酯、過(guò)氧化氫酶、還原型谷胱甘肽、總抗氧化能力和丙二醛，均無(wú)顯著差異。

表2 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清激素水平的影響

2.3.1 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清T3、FT3含量的影響

低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清T3、FT3含量的影響如圖2所示，隨著鹽度的升高，西雜鱘血清T3、FT3含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，但不同處理組與對(duì)照組之間均無(wú)顯著性差異。

圖2 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清T3、FT3含量的影響

2.3.2 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響

低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響如圖3所示，隨著鹽度的升高，西雜鱘血清皮質(zhì)醇含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，但不同處理組與對(duì)照組之間血清皮質(zhì)醇含量無(wú)顯著性差異。

圖3 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血漿皮質(zhì)醇含量的影響

2.4 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)Na+-K+-ATP酶活性的影響

低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)鰓Na+-K+-ATP酶活性的影響見(jiàn)圖4a，隨著鹽度的升高，西雜鱘幼魚(yú)鰓Na+-K+-ATP酶活性呈現(xiàn)波動(dòng)式的上升，S8處理組鰓Na+-K+-ATP酶活性達(dá)到最高，顯著高于S4處理組，但不同鹽度處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)腎Na+-K+-ATP酶活性的影響見(jiàn)圖4b，隨鹽度的升高，西雜鱘幼魚(yú)腎Na+-K+-ATP酶活性在不同鹽度處理組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)腸Na+-K+-ATP酶活性的影響見(jiàn)圖4c，隨鹽度的升高，西雜鱘幼魚(yú)腸Na+-K+-ATP酶活性逐漸上升，但不同處理組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。

圖4 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)鰓、腎、腸Na+-K+-ATP酶活性的影響

2.5 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清Na+、Cl-含量的影響

低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清Na+、Cl-含量的影響如圖5所示，隨著鹽度的升高，血清Na+含量變化差異不顯著；西雜鱘幼魚(yú)血清Cl-含量先下降后升高，S4處理組血清Cl-含量顯著低于對(duì)照組，當(dāng)鹽度升高到8時(shí)，血清Cl-含量恢復(fù)至對(duì)照組水平。

圖5 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清Na+、Cl-含量的影響

2.5 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)、免疫及性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

2.5.1 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響

隨著鹽度升高，西雜鱘幼魚(yú)igf-Ⅰ基因的表達(dá)水平呈先上升后下降的趨勢(shì)，igf-Ⅱ基因的表達(dá)水平呈先下降后上升趨勢(shì)，但均無(wú)顯著差異(圖6)。

圖6 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)肝臟中igf-Ⅰ、igf-Ⅱ基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5.2 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

隨著鹽度升高，西雜鱘幼魚(yú)hsp70、hsp90基因的表達(dá)水平呈先下降后升高的趨勢(shì)(圖7a和b)；tnf-α基因的表達(dá)水平先升高后下降(圖7c)；gst、lysozyme基因的表達(dá)水平有緩慢上升的趨勢(shì)(圖7d和e)，但低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平均無(wú)顯著影響。

圖7 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)肝臟中hsp70、hsp90、tnf-α、gst和lysozyme基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5.3 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

隨著鹽度升高，fsh、lh基因的表達(dá)水平逐漸下降(圖8a和b)，lh基因的表達(dá)水平在S8處理組顯著低于對(duì)照組，但fsh基因的表達(dá)水平在不同處理組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。fshr、erα基因的表達(dá)水平先下降后上升，而lhr、erβ基因的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，但不同處理組與對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異(圖8c-f)。vtg基因的表達(dá)水平呈先升高后下降的趨勢(shì)，但不同處理組與對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異(圖8g)。

圖8 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)肝臟和腦中性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)Na+-K+-ATP酶活性和血清Na+、Cl-含量的影響

鱘具有特殊的滲透和離子調(diào)節(jié)機(jī)制以適應(yīng)不同的鹽度環(huán)境。但鱘幼魚(yú)對(duì)鹽度變化的反應(yīng)與成魚(yú)不同，這一點(diǎn)已在許多關(guān)于鱘滲透調(diào)節(jié)能力的試驗(yàn)中得到證實(shí)[14]。鰓和腎作為滲透調(diào)節(jié)的重要器官，鹽度變化會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體滲透壓發(fā)生改變，從而產(chǎn)生一系列的生理反應(yīng)，如血清激素水平、能量代謝和抗氧化酶發(fā)生異常等。因此，鰓和腎中的Na+-K+-ATP酶被激活以維持滲透壓的平衡。有研究表明，在鹽度為10、20、25的條件下馴養(yǎng)史氏鱘，鰓Na+-K+-ATP酶活顯著高于對(duì)照組，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)受到抑制而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨后被重新激活逐漸上升，在適應(yīng)鹽度脅迫后，鰓Na+-K+-ATP酶活性趨于平穩(wěn)[15]。王曉雯等[16]研究表明，雜交鱘幼魚(yú)在鹽度5的條件下脅迫后，鰓Na+-K+-ATP酶活會(huì)極顯著高于對(duì)照組，而后下降至對(duì)照組水平。銀鯧幼魚(yú)(Pampusargenteus)在低鹽脅迫下，隨著鹽度的下降，鰓和腎中Na+-K+-ATP酶活呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)[17]。而本研究發(fā)現(xiàn)，低鹽馴化西雜鱘幼魚(yú)后，鰓Na+-K+-ATP酶活隨鹽度的升高呈現(xiàn)出“U”型變化，但無(wú)顯著差異。另外，腸、腎和膀胱等器官對(duì)保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)都起到重要作用。但本研究發(fā)現(xiàn)，西雜鱘幼魚(yú)在鹽度的適應(yīng)過(guò)程中，腎和腸Na+-K+-ATP酶活并沒(méi)有顯著變化，表明在低鹽環(huán)境下馴化西雜鱘幼魚(yú)15 d后，鰓Na+-K+-ATP酶參與血清滲透壓的調(diào)節(jié)以適應(yīng)新的環(huán)境，而腸和腎參與血清滲透壓調(diào)節(jié)的作用不明顯。

魚(yú)類也可通過(guò)調(diào)節(jié)離子吸收和排泄能力維持滲透壓平衡，以適應(yīng)不同的鹽度環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，中華鱘(Acipensersinensis)在不同鹽度下馴化24h后，血清滲透壓和離子濃度(Na+、Cl-)均有不同程度的升高。此后，滲透壓和離子濃度開(kāi)始下降，并趨于一個(gè)新的穩(wěn)態(tài)[18]，說(shuō)明血清中Na+和Cl-是血清滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程的主要參與者，但在本研究中，低鹽馴化15 d后，西雜鱘幼魚(yú)血清Na+濃度并未出現(xiàn)顯著性變化，Cl-濃度同鰓Na+-K+-ATP酶活呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，先降低后升高，表明西雜鱘幼魚(yú)血清Cl-的濃度受鰓Na+-K+-ATP酶活的調(diào)控。

3.2 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清生化指標(biāo)及抗氧化酶的影響

魚(yú)體內(nèi)血糖處于動(dòng)態(tài)平衡，但極易受環(huán)境因素的影響。前期研究表明，棲息于急流中的魚(yú)類相比靜水或底棲性的魚(yú)類血糖值偏高[19]，表明運(yùn)動(dòng)量增加會(huì)引起血糖的升高。雖然滲透機(jī)制調(diào)節(jié)中的高能量需求會(huì)使組織糖元異生作用增強(qiáng)，從而引起血糖濃度的變化，但本研究發(fā)現(xiàn)，低鹽馴化15 d后，西雜鱘幼魚(yú)血糖含量未受鹽度影響，表明其逐漸適應(yīng)低鹽環(huán)境，未使糖代謝產(chǎn)生較大差異。

總膽固醇和甘油三酯是魚(yú)體內(nèi)代謝的重要物質(zhì)，也是反應(yīng)機(jī)體攝取和合成蛋白的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，西雜鱘幼魚(yú)血清總膽固醇的濃度與鹽度呈正相關(guān)趨勢(shì)，甘油三酯濃度隨鹽度的上升呈下降趨勢(shì)，但各組間差異不顯著，表明鹽度變化會(huì)導(dǎo)致西雜鱘幼魚(yú)血清總膽固醇與甘油三酯的含量產(chǎn)生一定的波動(dòng)，但影響不顯著。膽固醇是肝臟合成的一種類脂，在血液中以不同的脂蛋白形式存在，而甘油三酯是脂肪代謝的中間代謝物質(zhì)。當(dāng)鹽度上升時(shí)，西雜鱘幼魚(yú)血清中的總膽固醇逐漸上升，據(jù)此推測(cè)，此時(shí)總膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂類的吸收，因此血清中的總膽固醇有所升高，而甘油三脂的含量下降，但在低鹽條件下馴化西雜鱘幼魚(yú)15 d后，并不會(huì)對(duì)這個(gè)過(guò)程造成顯著的影響。血清蛋白是組織蛋白質(zhì)合成的原料，但低鹽馴化15 d后，對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清總蛋白濃度無(wú)顯著影響，說(shuō)明鹽度變化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)肝臟合成蛋白的能力無(wú)明顯影響。

環(huán)境鹽度變化引起魚(yú)體生理應(yīng)激而產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，為避免氧化損傷，機(jī)體調(diào)動(dòng)抗氧化防御體系來(lái)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡[16]，使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激以適應(yīng)環(huán)境的改變。但長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致免疫機(jī)能下降，影響魚(yú)體的生長(zhǎng)。楊靜雯等[20]在研究鹽度對(duì)虹鱒和硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)抗氧化酶活性影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，馴化時(shí)間在4～8 d內(nèi)，各鹽度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)活性均有不同程度的下降，表明魚(yú)類在受到鹽度脅迫時(shí)會(huì)充分調(diào)動(dòng)機(jī)體防御機(jī)制應(yīng)對(duì)鹽度變化產(chǎn)生的活性氧，使機(jī)體產(chǎn)生的活性氧含量降低，而抗氧化酶活力也隨之下降。海水馴化對(duì)中華鱘(A.sinensis)血清抗氧化能力影響的研究中發(fā)現(xiàn)，每天鹽度增加1，達(dá)到25后繼續(xù)養(yǎng)殖3個(gè)月，海水養(yǎng)殖的中華鱘血清總抗氧化能力明顯高于淡水組，表明鹽度刺激增強(qiáng)了中華鱘的抗氧化酶活力[21]。而趙峰等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在水體鹽度為10的條件下，對(duì)鱘仍未產(chǎn)生氧化脅迫反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，西雜鱘幼魚(yú)馴化15 d后，鹽度對(duì)CAT、MDA、GSH、T-AOC等抗氧化指標(biāo)均無(wú)顯著影響，說(shuō)明低鹽環(huán)境下產(chǎn)生的應(yīng)激未能激活機(jī)體相關(guān)抗氧化酶清除氧自由基的能力。

3.3 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)血清激素水平的影響

神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)是滲透調(diào)節(jié)的重要組成部分，但鹽度變化破壞離子平衡后，甚至?xí)饾B透調(diào)節(jié)中激素水平的變化。其中性腺激素、皮質(zhì)醇、胰島素樣生長(zhǎng)因子1和甲狀腺激素在滲透調(diào)節(jié)中起著重要作用，能夠控制參與滲透調(diào)節(jié)器官的活動(dòng)以及維持滲透壓的平衡。前期研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽度脅迫下，能夠改變血漿的滲透壓，引起甲狀腺激素水平升高。同時(shí)，甲狀腺激素常與皮質(zhì)醇和生長(zhǎng)激素等其他激素一起參與魚(yú)類的發(fā)育、生長(zhǎng)、新陳代謝和滲透調(diào)節(jié)[23]。裸腹鱘(A.nudiventris)在鹽度(0、4、8、12)馴化10 d后，血漿皮質(zhì)醇的水平升高[24]。另外，將塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)從海水(38)轉(zhuǎn)移到不同的鹽度(5，15，38和55)中馴化17 d，血漿皮質(zhì)醇水平升高，而血漿甲狀腺激素FT4水平降低，表明在滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程中，這兩種激素之間存在相互作用[25]。但本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度為4和8的條件下馴化西雜鱘幼魚(yú)15 d后，皮質(zhì)醇和甲狀腺激素(T3、FT3)水平無(wú)顯著變化，其體重、體長(zhǎng)、全長(zhǎng)也均無(wú)顯著差異，表明15 d的低鹽馴化可以提高其耐鹽性，進(jìn)而未對(duì)甲狀腺功能和生長(zhǎng)造成影響。

3.4 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響

鹽度脅迫除了影響滲透壓外，還可能影響免疫功能，改變免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平。低鹽脅迫銀鯧(Pampusargenteus)引起的免疫相關(guān)基因表達(dá)變化比高鹽脅迫更明顯[26]。因此，本研究測(cè)定了低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)免疫相關(guān)基因(hsp70、hsp90、tnf-α、gst、lysozyme)表達(dá)水平的影響。其中，熱休克蛋白(HSPs)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。在鹽度為12‰時(shí)，黑鯛(Myliomacrocephalus)hsp90在肝臟中表達(dá)水平最低，在鹽度為6和50時(shí)升高[27]。為了適應(yīng)高鹽(12、33和50鹽度濃度)脅迫，真鯛(Sparussarba)hsp70在肝臟中表達(dá)上調(diào)[28]。因此，鹽度脅迫會(huì)增加滲透調(diào)節(jié)器官的代謝活性，從而導(dǎo)致組織中hsp70表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，hsp70、hsp90表達(dá)水平呈先下降后升高的趨勢(shì)，但各組間差異不顯著。tnf-α是免疫反應(yīng)中吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的主要促炎因子之一。銀鯧在低鹽(12)脅迫下，肌肉組織中tnf-α表達(dá)水平降低[26]。但本研究發(fā)現(xiàn)，西雜鱘幼魚(yú)肝臟中tnf-α表達(dá)水平先升高后降低，且各組之間無(wú)顯著變化。溶菌酶活性與先天免疫反應(yīng)密切相關(guān)，它對(duì)外來(lái)物質(zhì)的入侵反應(yīng)敏感。暗紋東方鲀(Takifugufasciatus)肝臟溶菌酶活性在鹽度為15時(shí)顯著升高，并在鹽度為30時(shí)仍維持較高水平[29]。與本研究結(jié)果相似，西雜鱘幼魚(yú)在低鹽馴化下，lysozyme基因表達(dá)水平逐漸升高，但各組之間無(wú)顯著變化，因此，溶菌酶的升高表明在病原體入侵期間可以保護(hù)宿主的各種體液因子免受干擾。另外，尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)在鹽度為16時(shí)，鰓和肝臟中g(shù)st表達(dá)上調(diào)[11]，說(shuō)明鹽度增加使得魚(yú)體代謝活性增強(qiáng)，從而引起氧化應(yīng)激產(chǎn)生更多的活性氧物質(zhì)(ROS)，刺激gst表達(dá)上調(diào)，來(lái)維持魚(yú)體的動(dòng)態(tài)平衡。本研究中，隨著鹽度升高，gst表達(dá)水平逐漸升高，但各組間無(wú)顯著變化。綜上所述，低鹽馴化15 d后，對(duì)西雜鱘幼魚(yú)免疫相關(guān)基因(hsp70、hsp90、tnf-α、lysozyme、gst)沒(méi)有顯著影響。

3.5 低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

溫度、光周期和鹽度等環(huán)境因子都會(huì)對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。環(huán)境鹽度是影響魚(yú)類生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一，特別是在羅非魚(yú)、鱘這類廣鹽性魚(yú)類中。與脊椎動(dòng)物類似，魚(yú)類的生長(zhǎng)很大程度上受生長(zhǎng)激素(GH)/胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)軸的控制，通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌信號(hào)機(jī)制發(fā)揮作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類igf-Ⅰ的表達(dá)對(duì)鹽度變化高度敏感。隨著鹽度的增加，羅非魚(yú)(O.mossambicus)、大西洋白姑魚(yú)(Argyrosomusregius)、大西洋鮭魚(yú)(Salmosalar)和黑鯛igf-Ⅰ的表達(dá)水平升高[9,30-31]。S4和S8處理組igf-Ⅰ表達(dá)水平與對(duì)照組相比有所升高，但無(wú)顯著差異，表明在不同魚(yú)類中，igf-Ⅰ可能在不同程度上參與了滲透壓調(diào)節(jié)，從而使魚(yú)類能夠適應(yīng)不同的鹽度環(huán)境。另外，尼羅羅非魚(yú)igf-Ⅱ的表達(dá)水平隨著鹽度的增加呈遞減趨勢(shì)，但鹽度為0、4和8g/L時(shí)，igf-Ⅱ的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異[32]。與本研究類似，在鹽度為4和8的條件下馴化西雜鱘幼魚(yú)15 d后，igf-Ⅱ表達(dá)水平與對(duì)照組相比也無(wú)顯著差異。

溫度、光周期和鹽度等也作為重要的環(huán)境因子參與魚(yú)類性腺發(fā)育的調(diào)節(jié)。對(duì)于洄游性繁殖的魚(yú)類，鹽度是影響性腺成熟的重要因子之一。黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)和尼羅羅非魚(yú)，隨著環(huán)境鹽度的增加，性腺發(fā)育和生殖均受到了抑制[33]。大麻哈魚(yú)(Oncorhynchusketa)在產(chǎn)卵季節(jié)處于鹽度低于0.5的環(huán)境中，才能正常發(fā)育成熟并完成繁殖活動(dòng)[34]。在魚(yú)類性腺發(fā)育過(guò)程中，卵泡刺激素(FSH)刺激性腺分泌雌二醇和睪酮等性類固醇激素，調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育和配子的生成，促黃體激素(LH)則主要刺激產(chǎn)生17α，20β-二羥黃體酮，促使卵母細(xì)胞和精子的最后成熟并刺激排精和排卵。因此，為了闡明低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)早期性腺發(fā)育的影響，本研究測(cè)定了腦和肝臟中fsh、lh、fshr、lhr的表達(dá)水平，隨著鹽度的增加，腦中fsh和lh的表達(dá)水平呈遞減趨勢(shì)，lh的表達(dá)水平在鹽度8與對(duì)照組之間有顯著差異，但肝臟中fshr、lhr和腦中fsh在各組間的表達(dá)無(wú)顯著變化，通過(guò)15 d的低鹽馴化，對(duì)西雜鱘幼魚(yú)早期性腺發(fā)育沒(méi)有直接的影響。另外，雌激素主要調(diào)節(jié)卵巢的發(fā)育、分化、維持以及卵子發(fā)生，這些作用主要通過(guò)核激素受體超家族中的受體(ers)介導(dǎo)[35]。但本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)15 d的低鹽馴化，雌激素核受體基因(erα、erβ)的表達(dá)水平在各組間無(wú)顯著差異。卵黃蛋白原(VTG)受到雌激素的調(diào)控刺激其表達(dá)，本研究中vtg的表達(dá)水平也無(wú)顯著差異。綜上所述，通過(guò)15 d的鹽度馴化，對(duì)西雜鱘幼魚(yú)早期性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)沒(méi)有顯著影響，具體的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地分析了西雜鱘幼魚(yú)在低鹽馴化后，鰓、腎、腸Na+-K+-ATP酶活和血清Na+、Cl-含量、抗氧化指標(biāo)、生化指標(biāo)、激素水平及性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的變化情況。研究結(jié)果表明，為適應(yīng)低鹽環(huán)境，西雜鱘幼魚(yú)鰓Na+-K+-ATP酶在不同程度上參與了滲透壓的調(diào)節(jié)，但低鹽馴化對(duì)西雜鱘幼魚(yú)生理狀態(tài)及早期性腺發(fā)育均無(wú)顯著影響。因此，為了促進(jìn)西雜鱘的健康養(yǎng)殖，還要兼顧其他環(huán)境因素，如溫度、光照、光周期等，適合西雜鱘幼魚(yú)的最佳養(yǎng)殖環(huán)境還需進(jìn)一步研究。