基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討淫羊藿苷治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制

周奕良，毛國慶

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是一種由多種原因引起的以骨量減少、骨強度降低及易發(fā)生脆性骨折等為特征的全身性骨骼疾病[1]。據(jù)估計[2]，大于50 歲的一半女性和20%的男性會在余生出現(xiàn)骨折風(fēng)險。骨質(zhì)疏松可導(dǎo)致全身關(guān)節(jié)持續(xù)疼痛，日常生活困難，嚴重影響生活質(zhì)量。在本病的發(fā)展過程中，成骨細胞和破骨細胞的失衡是其發(fā)生的重要原因之一，性激素、炎癥反應(yīng)等多種因素也參與其中[3]。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物以骨吸收抑制劑為主，加少量的骨形成促進劑，但這些藥物也有著許多的副作用[4，5]。因此，制定新的策略來預(yù)防該種疾病至關(guān)重要。淫羊藿又名仙靈脾，是一種臨床常見的中草藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味辛甘，歸肝腎經(jīng)?，F(xiàn)代中藥藥理學(xué)表明[6]，淫羊藿具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕功效。淫羊藿主要含有淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷和淫羊藿多糖等生物活性成分，在免疫系統(tǒng)、骨代謝方面具有良好的臨床應(yīng)用[7]。淫羊藿苷是其中主要活性單體之一，其對骨代謝、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤、炎癥等均具有作用[8]，但關(guān)于淫羊藿苷的分子作用機制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于疾病-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)的新興學(xué)科，基于網(wǎng)絡(luò)相互作用研究中藥的生物學(xué)知識，在生物分子水平上闡明中藥有效成分的藥理作用機制。本研究構(gòu)建了淫羊藿苷的網(wǎng)絡(luò)藥理模型，系統(tǒng)分析淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松的潛在機制，并進行分子對接，預(yù)測結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿苷相關(guān)靶點的篩選 淫羊藿苷的所有靶點通過以下4 個數(shù)據(jù)庫收集：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp -e.com/molecule.php?qn=1164）[9]、毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD，http://ctdbase.org)[10]、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）[11，12]、STITCH 數(shù)據(jù)庫（http://stitch.embl.de）[13]。選擇智人相關(guān)基因，剔除重復(fù)基因。

1.2 骨質(zhì)疏松相關(guān)基因靶點的篩選 以“骨質(zhì)疏松”為搜索關(guān)鍵詞，搜索OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫，挖掘與骨質(zhì)疏松相關(guān)的潛在靶點。訪問DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com）[14]，查找已批準的骨質(zhì)疏松干預(yù)藥物靶點。將3 個疾病數(shù)據(jù)庫靶標組合，刪除重復(fù)值，得到與骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標。

1.3 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用RStudio 軟件，獲得淫羊藿苷靶點與骨質(zhì)疏松靶點的交點，繪制Veen 圖。提取交集靶點，提交STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）[15]，構(gòu)建潛在作用靶點的蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。類型設(shè)置為“智人”，最小交互閾值設(shè)置為“最高置信度”（＞0.9），其余設(shè)置為默認值。最后，將PPI 結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 中心基因分析 利用MCC 算法在Cytoscape 的Cytohubba 插件中計算淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松的PPI基因，得到相關(guān)蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。最后，展示前10名的核心目標。

1.5 GO 富集和KEGG 富集 為了明確與淫羊藿苷相互作用的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用，本研究利用R 軟件對淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松的潛在靶點進行GO 和KEGG 富集分析。保存數(shù)據(jù)結(jié)果，使用R 軟件進行可視化分析。

1.6 分子對接 將骨質(zhì)疏松的10 個潛在靶蛋白與淫羊藿苷進行分子對接。目標蛋白的3D 結(jié)構(gòu)從PDB 數(shù)據(jù)庫下載。然后將目標蛋白導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6 中進行氫化、電荷計算，然后將結(jié)果以PDBQT 格式存儲。最后，使用AutoDock 用于分子對接，保留其結(jié)合能＜-5 kcal/mol 并使用PyMOL 可視化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷的靶點獲得 通過搜索TCMSP、CTD、GeneCards、STITCH，共得到相關(guān)靶點148 個。

2.2 骨質(zhì)疏松的靶點獲得 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，限定Score 值＞5 篩選后得到375 個靶點。在搜索OMIM 數(shù)據(jù)庫后，發(fā)現(xiàn)了605 個相關(guān)基因。DrugBank數(shù)據(jù)庫的搜索進行了補充，獲得了22 個靶點。將結(jié)果合并剔除重復(fù)基因，得到898 個骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點。

2.3 Veen 圖和PPI 圖構(gòu)建 取淫羊藿苷與骨質(zhì)疏松疾病靶點的交點，用R 軟件繪制Veen 圖（圖1），得到50 個交點靶點。將與相應(yīng)成分作用的靶點蛋白提交STRING 版本11.5 進行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，選取高置信度的蛋白相互作用數(shù)據(jù)，評分＞0.9。除去不相互作用的自由蛋白，骨質(zhì)疏松和淫羊藿苷之間共有蛋白44 個。PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，在淫羊藿苷和骨質(zhì)疏松的交叉靶點中有44 個蛋白和280 個相互作用邊（圖2）。

圖1 淫羊藿苷和骨質(zhì)疏松的韋恩圖

圖2 針對淫羊藿苷－骨質(zhì)疏松的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 中心基因篩選 基于Cytoscape 的插件Cytohubba，在相互作用網(wǎng)絡(luò)中篩選Hub 基因。使用MCC 算法找到了目標蛋白的前10 個Hub 基因，并構(gòu)建Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），結(jié)果顯示STAT3、MAPK3、JUN、FOS、MAPK1、ESR1、SRC、IL-6、TGFβ1、AKT1 是淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松的重要靶點。

圖3 Hub 基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG 和GO 分析 用R 軟件對淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點進行GO 和KEGG 富集分析，GO功能富集分析得到1224 個生物過程（biological process，BP）、29 個細胞組分（cellular component，CC）及64 個分子功能（molecular function，MF）；KEGG 信號通路富集分析獲得152 條信號通路，并將結(jié)果可視化。篩選出BP、MF、CC 類富集程度最高的前10 個條目，BP 中以靶蛋白為主參與骨化、細胞氧化應(yīng)激、肌肉細胞調(diào)控等；MF 中靶蛋白主要參與受體配體結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子活性；CC 中目標蛋白被分為質(zhì)膜和細胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等。根據(jù)KEGG 分析篩選出前10 個項目，主要集中于TNF 信號通路、IL-17 信號通路、AGE-RAGE 通路等，見圖4。

圖4 淫羊藿苷靶向蛋白基因的GO 和KEGG 分析

圖4 淫羊藿苷靶向蛋白基因的GO 和KEGG 分析（續(xù)）

2.6 分子對接 淫羊藿核心成分淫羊藿苷與關(guān)鍵靶點進行分子對接，結(jié)果顯示淫羊藿苷可以結(jié)合到對接分子中，與目標蛋白之間具有良好的對接活性，見表1。共檢測了以下潛在的靶蛋白：IL-6（Icariin：1ALU）、AKT1（Icariin：1H10）、JUN（Icariin：1A02）、MAPK3（Icariin：7NRB）、SRC（Icariin：7T1U）、STAT3（Icariin：6TLC）、TGFβ1（Icariin：1KLA），它們是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的高度節(jié)點，在淫羊藿治療骨質(zhì)疏松中對淫羊藿苷的應(yīng)答起關(guān)鍵作用，見圖6。淫羊藿苷通過與GLN-414（長度：2.3）、TRP-413（長度：2.6）、MET-403（長度：2.7）和GLY-410（長度：2.3，2.2）形成氫鍵與IL-6 結(jié)合；淫羊藿苷與LYS-67（長度：2.3）、SER-170（長度：2.9）、MET-68（長度：2.1）、PHE-174（長度：2.7）、SER-177（長度：2.7）、GLY-410（長度：2.3、2.2）和GLU-173（長度：2.3）形成氫鍵與AKT1 結(jié)合；淫羊藿苷與JUN 形成5 個氫鍵，分別是TRP-399（長度：2.3）、GLN-457（長度：2.6、2.9）、HIS-549（長度：2.6、2.1）；淫羊藿苷與MAPK3形成6 個氫鍵，分別是GLU-122（長度：2.1）、CYS-120（長度：2.1）、GLN-68（長度：2.8）、GLU-119（長度：2.1、2.7）、LYS-187（長度：2.3）；淫羊藿苷還與SRC 通過PRO-249（長度：2.3、2.3）、GLU-150（長度：2.2）、TYR-152（長度：2.0、2.9）、GLN-147（長度：2.1）形成氫鍵；淫羊藿苷與STAT3 形成7 個氫鍵，分別是GLN-361（長度：2.4）、TYR-446（長度：3.0、2.5）、GLU-444（長度：3.3、2.6、2.6）、LYS-363（長度：2.4）。除此以外，淫羊藿苷還和TGFβ1 通過GLY-46（長度：1.8）、CYS-78（長度：2.1，2.7）、PRO-76（長度：2.2）、ALA-75（長度：2.7）、ALA-72（長度：2.9）形成氫鍵。此外，以上所有蛋白靶點與淫羊藿苷進行分子對接，其結(jié)合能均＜-5 kcal/mol。

圖6 淫羊藿苷與預(yù)測蛋白靶結(jié)合的分子模型

圖6 淫羊藿苷與預(yù)測蛋白靶結(jié)合的分子模型（續(xù)）

表1 淫羊藿苷核心靶點的結(jié)合能

3 討論

本研究通過整合公共數(shù)據(jù)庫中關(guān)于骨質(zhì)疏松的信息來預(yù)測淫羊藿苷與其潛在蛋白靶標之間的相互作用，并闡明淫羊藿苷參與的眾多信號通路。此外，通過分子對接研究，以預(yù)測淫羊藿苷與其預(yù)測的靶蛋白之間的特定相互作用。

淫羊藿苷的分子對接結(jié)果表明，氫鍵是相互作用的主要形式。通路分析表明，淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松中的TNF 信號通路、IL-17 信號通路、Prolactin 通路，AGE-RAGE 通路等具有調(diào)控作用。同時，淫羊藿苷可通過多靶點、多通路干預(yù)骨質(zhì)疏松的過程。其中，排名前10 位的靶點分別為STAT3、MAPK3、JUN、FOS、MAPK1、ESR1、SRC、IL-6、TGFβ1、AKT1，以上可能是藥物發(fā)揮治療作用的核心靶點。

淫羊藿苷治療骨質(zhì)疏松的潛在原因可能歸于以下方面：首先，這些潛在靶點與成骨細胞、破骨細胞密切相關(guān)。STAT3 參與多種細胞因子的信號傳導(dǎo)過程，在骨髓細胞分化中發(fā)揮重大作用[16]。李常虹等[17]研究表明，STAT3 在小鼠破骨細胞前體細胞模型中被證實通過降低NFATc1 的表達，進而抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細胞生成。TGFβ1 是一種廣泛分布的骨基質(zhì)蛋白，影響破骨細胞和成骨細胞的功能、形成和細胞間相互作用，以調(diào)節(jié)骨重塑和維持足夠的骨量[18]。MAPK3（ERK1）和MAPK1（ERK2）可以通過激活Runx2 基因來促進成骨細胞發(fā)育，進而促進抗骨質(zhì)疏松[19]。Kim HK 等[20]研究表明，MAPK3 和MAPK1可以受膠原蛋白水解物的刺激產(chǎn)生磷酸化，最終導(dǎo)致成骨細胞的增值和分化。破骨細胞分化因子RANKL 依賴于c-FOS 的基因轉(zhuǎn)錄，此外受外界刺激的c-JUN 細胞信號分子，可以進一步磷酸化，通過MAPKs 信號通路，在破骨細胞的分化過程中發(fā)揮作用。有研究表明[21]，c-FOS 和c-JUN 形成的異源二聚體刺激破骨前體細胞的成熟，誘導(dǎo)破骨細胞的分化。程琳燕[22]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以明顯抑制c-FOS和NFATc1 的表達，進而參與破骨細胞的生成。IL-6是一種多功能細胞因子，可調(diào)節(jié)破骨細胞祖細胞，并通過調(diào)控MAPK 磷酸酶和泛素途徑相關(guān)的特定基因的轉(zhuǎn)錄來抑制其分化骨穩(wěn)態(tài)[23]。其次，這些潛在靶點能通過影響炎癥因子、激素來調(diào)節(jié)骨形成與骨吸收。有研究表明[24，25]，ESR1 是通過TGFβ 途徑和抑制IL-6 的活動來調(diào)節(jié)骨代謝。AKT 是骨穩(wěn)態(tài)的是重要一環(huán)，在AKT1 敲除的模型小鼠中，小鼠變得骨化延遲[26]、骨骼變短[27]、骨量減少[28]。另SRC 能調(diào)節(jié)雌激素依賴的ERα 靶基因的表達，有研究表明[29]，SRC 通過雌激素對骨形成起到調(diào)控作用。

綜上所述，淫羊藿苷可通過多靶點、多途徑調(diào)節(jié)骨代謝穩(wěn)態(tài)平衡，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。