高原低氧環(huán)境對C57BL/6雌性小鼠卵巢功能的影響*

袁 月 蒲雯婕 何毅剛 王 玲

1 甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床學院，甘肅省蘭州市 730000； 2 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室；3 蘭州市婦幼保健院； 4 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院

高原是一個特殊的低壓低氧環(huán)境，其大氣物理、地球化學生態(tài)結構與平原相差十分顯著[1]。當人體急進高原，短時間內機體會因缺氧做出應激反應，而缺氧對體內物質代謝具有顯著的影響進而發(fā)生各種臨床癥候群，稱為急性高原病(Acute mountain sickness，AMS)。全世界高海拔地區(qū)常住人口約占世界總人口的 2%，缺氧是高原居民不得不面臨的自然因素[2]。由于我國對高原地區(qū)基建和國家軍事需求的增加等因素，使得從平原進駐高原的人群正在不斷增加，因此近些年來，關于如何減輕高原缺氧對機體的損傷成為關注的熱點。目前國內已有研究證實[3]，高原會使女性性激素水平出現(xiàn)明顯變化，但具體機制尚不完全明確，因此構建高原低壓低氧卵巢組織損傷的模型，是進行高原相關女性生殖系統(tǒng)疾病研究的關鍵環(huán)節(jié)之一。本研究旨在探索6 500m海拔時，不同留置時長對小鼠卵巢組織結構形態(tài)的影響，為選擇合適時長進行高原低壓低氧雌性小鼠卵巢功能損傷模型的建立，以及為在平原地區(qū)進行模擬高原女性生殖系統(tǒng)疾病預防治療的機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 60只SPF級19～23g雌性C57BL/6J小鼠[購自斯貝福(北京)公司]，合格證號：SCXK(京)2019-0010 ，隨機分為高原5d、10d、15d和20d組及對應的對照組(當?shù)睾０?，每組12只。高原各組小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室內的低壓高原艙中，溫度控制在21～24℃，濕度約50%，升降速度為5～10m/s達到模擬海拔6 500m高度，每2d開艙打掃衛(wèi)生、更換食水約30min，其余時間均連續(xù)模擬高原環(huán)境，晝夜12h，自由進食進水。對照組于SPF級動物室內同高原組進食方式飼養(yǎng)。本研究所有動物方案均符合倫理標準(科研倫理審批編號：2021KYLL124)。

1.2 主要試劑與儀器 模擬高原低壓高原動物實驗艙(中航工業(yè)貴州風雷航空機械有限責任公司)；TG16-WS 臺式高速離心(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；多聚甲醛固定液(北京索萊寶公司)；電鏡固定液(北京索萊寶公司)；光學顯微鏡(日本Olympus 公司)；透視電鏡顯微鏡(Hitachi)臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 生理同步化：成功分組的小鼠，先飼養(yǎng)于同一平原環(huán)境下進行生理同步化。給予左炔諾孕酮炔雌醚片灌胃，藥物濃度為人體的2倍，根據(jù)小鼠動情周期每5d灌胃1次，本次實驗共灌胃2次。每日上午8—10點行陰道涂片觀察小鼠動情周期的變化。

1.3.2 標本采集:分別于0d及入低壓氧艙5d、10d、15d和20d后出艙稱重，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠雙側卵巢稱重;右側卵巢置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制備連續(xù)切片；左側卵巢置于電鏡固定液4℃保存，待做透視電鏡制片。

1.3.3 計算小鼠卵巢指數(shù):取小鼠左右兩側卵巢，稱濕重，計算卵巢指數(shù)(卵巢指數(shù)=雙側卵巢重量/體重×100%)。

1.3.4 HE染色觀察小鼠卵巢形態(tài):摘除小鼠右側卵巢組織，清洗干凈放置在 4%多聚甲醛中固定48h，取出卵巢組織行石蠟包埋，切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，分化，氨水反藍后伊紅染色，脫蠟脫水，最后中性樹膠封片觀察。

1.3.5 透視電鏡觀察卵巢超微結構:取小鼠右側卵巢組織，置于電鏡固定液4℃保存，磷酸緩沖液PB漂洗3次固定。取出卵巢組織繼續(xù)磷酸緩沖液PB進行后固定、乙醇梯度脫水、丙酮滲透包埋、切片、鈾鉛雙染色，最后透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布運用單因素方差分析，非正態(tài)分布進行K 個獨立樣本非參數(shù)檢驗，多組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計用one-way ANOVA進行對比分析，P< 0.05(95%置信區(qū)間)為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠生理同步化 用左炔諾孕酮炔雌醚片灌胃前的小鼠陰道涂片結果顯示：處于動情期27只、動情前期10只、動情后期7只、動情間期16只。1次灌胃后每日涂片，第4天涂片結果顯示：處于動情期42只、動情前期6只、動情后期3只、動情間期9只；2次灌胃后繼續(xù)每天涂片，在第4天涂片結果顯示小鼠均處于動情期，完成生理同步。

2.2 小鼠體重及卵巢指數(shù)的變化 高原各組小鼠入出艙前后體重對比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其中高原5d、10d、20d組有高度統(tǒng)計學差異(P<0.000 1)；高原15d組有顯著高度統(tǒng)計學差異(P<0.001)。對于卵巢指數(shù)高原組與對照組相比：對照組與高原5d、10d、15d、20d組組間有高度統(tǒng)計學差異(P<0.000 1)，其中高原5d組與高原15d、20d組有高度統(tǒng)計學差異(P<0.000 1)；高原10d組與高原20d組間有高度統(tǒng)計學差異(P<0.01)；高原15d組與高原20d組間差異性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1～2。

圖1 高原組小鼠體重對比

圖2 各組小鼠卵巢指數(shù)

2.3 小鼠卵巢形態(tài)的變化

2.3.1 HE染色觀察小鼠卵巢形態(tài)：見表1、圖3。取材時見對照組卵巢外觀呈均勻粉紅色，而高原各組卵巢外觀可見部分紫紺，以高原15、20d組最為明顯，且高原各組較對照組的卵巢體積減小。與對照組相比：高原5d、10d、15d、20d組的HE染色顯示光鏡下卵巢髓質內血管增生擴張充血、水腫，部分區(qū)域有均勻紅染的滲出液及紅細胞碎片，卵泡及黃體內也見壞死的細胞碎片；高原各組卵巢髓質內原始卵泡和成熟卵泡數(shù)量有不同程度的減少，但閉鎖卵泡數(shù)量增加。

表1 各組HE染色結果

對照組 高原5d組 高原10d組 高原15d組 高原20d組

2.3.2 透視電鏡下觀察卵巢超微結構：見表2、圖4。觀察卵巢超微結構可見對照組的卵母細胞整體結構尚可，細胞膜未見明顯破損，且細胞器均勻分布，皮質顆粒(CG)數(shù)量較多，結構致密，分布細胞膜周圍；線粒體(M)膜完整，嵴存在；粗面內質網(wǎng)(RER)膜完整；高爾基體(Go)未見明顯增生肥大，自噬溶酶體(ASS)個別存在。與對照組相比：高原5d、10d、15d、20d組的電鏡結果示卵母細胞、CG、M、RER、Go均隨著在高海拔留置時間的延長，損傷程度呈遞進式增加；ASS數(shù)量也是呈遞進式增加。

表2 各組電鏡結果

對照組 高原5d組 高原10d組 高原15d組 高原20d組

3 討論

高原地區(qū)是指地勢較為遼闊，且能使人體產(chǎn)生顯著生物學效應、海拔3 000m以上的地區(qū)，約占地球表面積的1/5[4]。據(jù)報道近1/4平原人在進入高原后會發(fā)生AMS，癥狀主要包括頭痛、惡心、疲倦及睡眠障礙等，其中約1%可發(fā)展為高原性腦水腫[5]。因有著低壓低氧、強紫外線、低氣溫等特點，高原是作為一個獨立的生態(tài)系統(tǒng)存在。這獨特環(huán)境影響機體正常的生理機能，其中低氧是最主要的影響因素。已有相關實驗驗證[6]，低氧與小鼠卵泡發(fā)育減少有關。為解決因高原低氧環(huán)境所導致的疾病問題，建立動物模型是主要研究手段。對于實驗動物的選擇是建立模型的重要前提之一。本實驗選擇體內雜質少常用于在生殖、遺傳領域的C57BL/6小鼠，鼠齡為8周齡，已達到性成熟期，生殖系統(tǒng)發(fā)育完善，可以完成自主交配，相當于人年齡階段18～20歲。根據(jù)實驗研究[7]，雄鼠的高原生殖系統(tǒng)損傷模型的建立選擇海拔高度為6 000m。在前期預實驗做海拔6 000m及7 000m，結果6 000m海拔需要28d高原組與對照組才能達到較為明顯的差異；而低壓氧艙高度升7 000m時，小鼠無法耐受缺氧環(huán)境，約70%鼠在第2天死亡。故本研究采用低壓氧艙模擬海拔6 500m高原低壓低氧環(huán)境，動態(tài)研究低壓低氧對C57BL/6小鼠卵巢組織的影響，對于高原環(huán)境對人機體的影響開展高原生殖損傷研究。

下丘腦—腺垂體—性腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis，HPA)可調節(jié)子宮內膜的周期性變化。為避免生理周期的不同對實驗結果造成影響，使用雌孕激素藥物，抑制丘腦下部—垂體—卵巢軸來抑制卵巢排卵，對小鼠進行生理同步化[8]。體重變化可以反映高原低氧環(huán)境對于小鼠攝食功能的影響[9]。對于機體的正常生長發(fā)育，每個階段都必須有足夠的食物熱量提供，體重的減輕嚴重時會引起機體功能器官的體積改變。本次實驗中，高原各組體重較對照組均下降，且相對應的高原組卵巢指數(shù)較對照組也下降。即在6 500m海拔，留置時間越長，使得小鼠體重減輕及卵巢組織部分萎縮。卵巢指數(shù)是指雙卵巢重量與體重之比，正常時卵巢與體重的比值比較恒定。受損組織的重量可以發(fā)生改變，故指數(shù)也隨之而改變。卵巢指數(shù)增加，表示組織充血、水腫等；指數(shù)減小，表示組織萎縮或其他退行性改變。據(jù)本次試驗結果來說，雖高原各組較對照組均有改變，但高原15d組與20d組間無統(tǒng)計學價值，說明高原留置達15d時卵巢萎縮與20d組無差異。因此，建立6 500m高原低氧的小鼠卵巢損傷模型時長，最少需要15d。

卵巢組織病理檢查是診斷卵巢儲備功能的金標準。本次研究發(fā)現(xiàn)高原5d組小鼠卵巢體積略萎縮，雖各級生長卵泡均有分布，但卵母細胞有輕度損傷；M輕度腫脹，嵴減少；RER輕度擴張，少量脫顆粒；Go輕度肥大；ASS少量存在；髓質血管擴張，且見大量壞死紅細胞。高原10d組的卵母細胞與M改變同高原5d組，但ASS數(shù)量增多；且卵巢髓質血管增生擴張明顯，次級卵泡內顆粒細胞分布不均勻并有部分凋亡，閉鎖卵泡增加。對于高原15d組可見卵巢組織結構已有破壞，卵母細胞重度損傷，細胞器部分崩解，M腫脹明顯、基質局部稀疏、嵴減少，RER部分膜破損，ASS存在；髓質內血管增生明顯、卵泡數(shù)量減少。而高原20d組同高原15d組的病理結果相似，無明顯差異性。上述結果表明，模擬6 500m高原環(huán)境建立小鼠卵巢損傷模型在留置時長15d時，對小鼠卵巢組織形態(tài)影響最為明顯。

哺乳動物性成熟后每個月經(jīng)周期只有1個優(yōu)勢卵泡發(fā)育成熟并排卵，其余卵泡發(fā)育到一定程度通過細胞凋亡機制而退化，稱為卵泡閉鎖[10]。卵泡閉鎖增多意味卵巢儲備功能的下降，是導致某些無排卵性疾病的主要原因，例如多囊卵巢綜合征(PCOS)和卵巢早衰(POF)。已有文獻記載[11]，顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因。卵巢是一個代謝活躍的器官，能產(chǎn)生大量的活性氧。由于卵泡體積大，卵泡卵母細胞更容易缺氧[12]。線粒體是主要供能的細胞器，可以為卵泡發(fā)育提供所需能量，促使卵巢排出健康的卵子，發(fā)揮其生殖功能。當線粒體結構破壞，能量供應不足是誘發(fā)顆粒細胞凋亡，最終造成卵子質量低下、卵泡閉鎖增多的重要原因[13-14]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著留置高原的時間延長，在高原15d組與高原20d組的卵巢生殖細胞內，線粒體腫脹明顯、體積變大，且基質局部稀疏，嵴減少。因此線粒體結構破壞是導致這兩組卵巢內卵泡數(shù)量減少、閉鎖卵泡增加的主要原因。

綜上所述，對于高原低壓低氧C57BL/6雌性小鼠卵巢功能損傷模型評價指標的探索，體重變化、卵巢指數(shù)、卵巢組織病理學形態(tài)在高原5d組，已經(jīng)發(fā)生變化，而高原15d和20d組時更為明顯，提示在模擬海拔6 500m高原環(huán)境下，留置時長在15d已經(jīng)對小鼠卵巢功能產(chǎn)生較為嚴重的損害影響。本次研究制造模型的方法:模擬6 500m海拔，分別留置時長為5d、10d、15d、20d，15℃/5℃的晝夜溫差，可以更加接近高原低氧暴露環(huán)境，對于反映出低壓低氧暴露對雌性小鼠卵巢功能的損傷可能更為有利，并檢測得此模型具有一定的良好重現(xiàn)性。