p62蛋白在肝臟疾病中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展*

朱 琴 林彬燕

南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省南京市 210023

p62是一種選擇性自噬受體，通過自噬溶酶體途徑招募和遞送細(xì)胞內(nèi)底物以進(jìn)行批量清除[1]。有趣的是，p62還可以作為信號支架，參與多種生理過程的調(diào)節(jié)，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、代謝、炎癥和程序性細(xì)胞死亡。研究表明，p62蛋白在急慢性肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病中異常表達(dá)，可參與調(diào)控多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，且p62是腫瘤預(yù)后生物標(biāo)志物的良好候選者[2]。本綜述將重點(diǎn)關(guān)注p62的結(jié)構(gòu)及功能調(diào)節(jié)，以及在調(diào)節(jié)肝臟生理和疾病中可能發(fā)揮的作用，目的是探索p62作為預(yù)測性生物標(biāo)記物和潛在靶點(diǎn)治療某些肝臟疾病的可能性。

1 p62蛋白的分子結(jié)構(gòu)

p62蛋白由SQSTM1基因編碼，是一種分子量為62kDa的泛素結(jié)合自噬受體。p62包含440個(gè)氨基酸，具有多個(gè)不同功能的結(jié)構(gòu)域：Phox-Bem1p(PB1)結(jié)構(gòu)域、鋅指(Zinc Finger，ZZ)結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factors 6，TRAF6)結(jié)合(TRAF6-Binding，TB)結(jié)構(gòu)域、LC3相互作用區(qū)(LC3-Interacting Region，LIR)、Keap1相互作用區(qū)(Keap1-Interacting Region，KIR)、泛素結(jié)合(Ubiquitin-Associated，UBA)結(jié)構(gòu)域等。除此之外，p62蛋白還含有兩個(gè)核定位信號(Nuclear Localization Signal，NLS)、一個(gè)核輸出信號(Nuclear Export Signal，NES)以及2個(gè)PEST序列，PEST主要促進(jìn)蛋白快速降解。

2 p62蛋白參與調(diào)控多個(gè)信號通路

2.1 p62介導(dǎo)NF-κB信號通路的激活 核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear Factor κ，NF-κB)信號通路通過對下游細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等生理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。p62通過ZZ結(jié)構(gòu)域與RIP結(jié)合，調(diào)節(jié)TNF介導(dǎo)的NF-κB的活化。同時(shí)，RIP還可以通過與IκB激酶(IκB Kinase，IKK)復(fù)合物相互作用，磷酸化IκB，進(jìn)而激活NF-κB通路[3]。p62上的TB結(jié)構(gòu)域結(jié)合TRAF6，通過PB1結(jié)構(gòu)域促進(jìn)TRAF6形成二聚體，發(fā)揮E3泛素連接酶活性，繼而催化63位賴氨酸殘基發(fā)生多聚泛素化，激活蛋白激酶TAK1，TAK1的主要作用是激活I(lǐng)KK，IKK復(fù)合體中的IKKβ激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。此外，在TNF的刺激下，p62通過其PB1結(jié)構(gòu)域與aPKCs結(jié)合，磷酸化IKKβ，促進(jìn)IκB的降解，導(dǎo)致NF-κB的活化[4]。

2.2 p62介導(dǎo)Caspase-8依賴的細(xì)胞凋亡的啟動 Caspase-8是外源性凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白，其激活依賴于Caspase-8自身的寡聚化和切割[5]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)與靶細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合，啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以誘導(dǎo)p62依賴性的Caspase-8激活。TRAIL通過與靶細(xì)胞表面死亡受體相互作用，招募Caspase-8的前體蛋白，進(jìn)而通過死亡誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)復(fù)合物中E3泛素連接酶CUL3的作用，使得Caspase-8被泛素化。p62通過其UBA結(jié)構(gòu)域與泛素化Caspase-8結(jié)合，進(jìn)而通過其PB1結(jié)構(gòu)域促使泛素化Caspase-8形成二聚體，進(jìn)而發(fā)生自磷酸化，自我切割后激活，并啟動細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Caspase-8的激活會促進(jìn)p62蛋白在其Asp329處被切割成2個(gè)片段，其氨基末端片段可以激活mTOR[6]。深入探索p62與Caspase-8的調(diào)節(jié)機(jī)制有助于闡明自噬與凋亡的關(guān)系。

2.3 p62介導(dǎo)mTORC1信號通路的激活 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(Mammalian Target of Rapamycin Complex1，mTORC1)由核心組分mTOR、Raptor、mLST8和PRAS40組成。高水平p62可以通過激活mTORC1負(fù)調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生[7]。p62可以直接與mTORC1的關(guān)鍵組成部分Raptor蛋白相互作用，促進(jìn)mTORC1的活化。研究發(fā)現(xiàn)，p62的ZZ結(jié)構(gòu)域與TB結(jié)構(gòu)域中間的區(qū)域(167～230氨基酸)是p62與Raptor相互作用所必需的。當(dāng)細(xì)胞遭受氨基酸刺激時(shí)，p62與激活的Rag異二聚體相互作用，進(jìn)而形成p62-Rag異二聚體-Raptor復(fù)合物，將mTORC1募集到溶酶體膜上，被Rheb蛋白激活，發(fā)揮其抑制自噬的作用[8]。此外，p62將TRAF6引入mTORC1中，催化mTOR的K63連接的多泛素化，進(jìn)一步增強(qiáng)了mTORC1信號通路的激活[9]。自噬抑制會造成p62聚集，可通過激活mTORC1進(jìn)一步抑制細(xì)胞自噬，造成p62積累，進(jìn)而繼續(xù)升高mTORC1水平，形成正反饋調(diào)控。

2.4 p62介導(dǎo)Nrf2信號通路的激活 核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear Factor E2 Related Factor 2，Nrf2)是細(xì)胞保護(hù)和抗應(yīng)激的中心調(diào)節(jié)因子，尤其是抗活性氧和氧化應(yīng)激。正常生理?xiàng)l件下，Keap1與Nrf2相互作用并定位于細(xì)胞質(zhì)中，由于Keap1還結(jié)合E3泛素連接酶復(fù)合物Cul3/Rbx1，這導(dǎo)致Nrf2持續(xù)被泛素化，隨后運(yùn)送至蛋白酶體降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡[10]。p62通過與Keap1相互作用和自噬體降解介導(dǎo)的非典型途徑激活Nrf2。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，p62蛋白通過KIR競爭性結(jié)合Keap1的Kelch區(qū)，使得Nrf2從Keap1解離，Nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與小maf蛋白形成異二聚體，以Nrf2-Maf的形式與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶體/分子伴侶等基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，以抵抗內(nèi)外界的有害刺激。p62-Keap1異二聚體招募LC3并在選擇性自噬途徑中介導(dǎo)Keap1的永久降解。當(dāng)p62蛋白Ser349被磷酸化時(shí)，p62對Keap1的親和力顯著增加。p62誘導(dǎo)Nrf2激活后，不僅誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，而且誘導(dǎo)SQSTM1的轉(zhuǎn)錄，從而形成正反饋回路。然而，Keap1-Cul3-Rbx1復(fù)合物可以在Lys420處泛素化p62，從而導(dǎo)致p62通過自噬降解[11]。

3 p62蛋白在肝臟疾病中的作用及作用機(jī)制

3.1 p62在原發(fā)性肝癌中的作用 原發(fā)性肝癌是2020年全球第六大最常被診斷出的癌癥和第三大癌癥死亡原因，在全球發(fā)病率方面排名第五。肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要病理類型(占75%～85%的病例)，簡稱肝癌，嚴(yán)重危害人類健康[12]。自噬失調(diào)被認(rèn)為在肝癌中起著關(guān)鍵的致病作用。p62作為關(guān)鍵的自噬銜接蛋白，被發(fā)現(xiàn)在許多肝癌和肝臟疾病癌變前期患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，且p62表達(dá)高的患者一般預(yù)后較差[13]。p62的蓄積會增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、活性氧生成增多以及基因組損傷。

在機(jī)制上，p62招募并競爭性結(jié)合Keap1，從而將Nrf2從CUL3-Keap1介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中釋放出來，使得Nrf2免于被降解。這有利于Nrf2的穩(wěn)定，進(jìn)而Nrf2激活下游抗氧化反應(yīng)元件和代謝重編程，為肝癌起始細(xì)胞創(chuàng)造適應(yīng)性條件[13]。與此同時(shí)，p62通過與mTOR結(jié)合，介導(dǎo)其在營養(yǎng)充足條件下的激活。隨后，p62通過mTORC1依賴性磷酸化增強(qiáng)了其激活Nrf2信號的功能，在p62和mTORC1之間形成了一個(gè)正反饋環(huán)，從而過度激活Nrf2[14]。此外，在肝癌的發(fā)展過程中，p62還促進(jìn)了c-Myc癌基因的活性，該癌基因通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和代謝重編程對腫瘤生長至關(guān)重要。c-Myc的致癌功能似乎高度依賴于mTORC1信號[15]。綜上所述，p62通過介導(dǎo)肝細(xì)胞中Nrf2、mTORC1和c-Myc通路的激活，以增強(qiáng)抗氧化防御、代謝重編程、細(xì)胞生長和增殖，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

3.2 p62在肝纖維化中的作用 肝纖維化是慢性肝損傷的結(jié)果，其主要特征是肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)的激活以及細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積。過度激活HSC可通過分泌促炎細(xì)胞因子加劇纖維化并促進(jìn)肝癌的發(fā)生。有研究者發(fā)現(xiàn)，p62在肝癌患者的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高，但在HSC中表達(dá)下調(diào)。研究者將p62缺陷小鼠與致癌物二乙基亞硝胺和高脂飲食相結(jié)合，證明p62缺陷促進(jìn)非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH)和肝癌。在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中，與野生型小鼠相比，全身敲除p62或HSC特異性敲除p62小鼠的纖維化反應(yīng)增強(qiáng)，包括a-SMA和Col1a1表達(dá)增強(qiáng)，以及促炎細(xì)胞因子分泌增加，從而加速肝癌的進(jìn)展。上述結(jié)果表明，p62可以負(fù)性調(diào)節(jié)HSC的激活，在肝臟中作為非細(xì)胞自主性腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[16]。

在機(jī)制上，p62直接與維生素D受體(Vitamin D Receptor，VDR)和維甲酸受體α結(jié)合，以促進(jìn)它們的異源二聚，這對于激活其靶基因以抑制HSC激活進(jìn)而抑制纖維化至關(guān)重要。在p62缺失的情況下，VDR無法結(jié)合其啟動子，導(dǎo)致SMAD3的募集和HSC的過度激活。因此，與p62在肝實(shí)質(zhì)中的促瘤作用相反，p62似乎通過抑制HSC的激活在肝基質(zhì)中發(fā)揮腫瘤抑制功能[17]。

3.3 p62在非酒精性脂肪性肝病中的作用 非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)指由肝臟脂肪堆積引起的肝臟異常，包括非酒精性脂肪性肝炎和單純性脂肪肝。NASH是一種以脂肪變性、炎癥和纖維化為特征的進(jìn)行性肝病，可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。p62聚集體存在于人類NASH和小鼠NASH模型中。在NASH患者肝臟內(nèi)，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平過高會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，p62作為應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的一部分被上調(diào)。研究表明，氧化應(yīng)激可通過凋亡或壞死導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，這是NASH炎癥和纖維化的重要驅(qū)動因素[18]；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝參與NAFLD的進(jìn)展。

在機(jī)制上，一方面p62通過與AMPK和ULK1相互作用，促進(jìn)ULK1的磷酸化，進(jìn)而激活自噬和Keap1的降解，最終導(dǎo)致Nrf2的激活。Nrf2信號通過抗氧化反應(yīng)和抑制脂肪酸合成過程中的代謝酶等多種途徑，減輕NAFLD和NASH。但是，另一方面，在NAFLD患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，p62包涵體的水平與發(fā)揮促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān)。因此，富含p62的包涵體被認(rèn)為可以通過促炎反應(yīng)，促進(jìn)NASH的病理進(jìn)程以及促進(jìn)NAFLD向晚期發(fā)展[19]。

3.4 p62在慢性肝病中的作用 數(shù)據(jù)顯示，80%的肥胖人群和約50%～60%的2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)患者被診斷患有NAFLD。在NAFLD、肥胖癥和T2DM的患者體內(nèi)，可檢測到其肝臟、脂肪組織、β-胰腺細(xì)胞和其他調(diào)控全身代謝的相關(guān)器官中，p62的蛋白水平發(fā)生變化。有研究人員發(fā)現(xiàn)，全身性p62敲除小鼠在正常飲食下會發(fā)展為成熟期肥胖和胰島素抵抗。在這些小鼠體中，可觀察到ERK信號通路在白色脂肪組織(一種專門的脂質(zhì)儲存組織)中過度激活。與野生型小鼠相比，還檢測到p62缺陷型白色脂肪細(xì)胞的分化能力增強(qiáng)。因此推測p62是通過抑制ERK活性，在脂肪生成中發(fā)揮抑制作用。此外，p62可以通過促進(jìn)p38 MAPK介導(dǎo)棕色脂肪組織(將能量轉(zhuǎn)化為熱量)內(nèi)線粒體功能和產(chǎn)熱作用，調(diào)控能量代謝[20]。因此，p62可能通過抑制脂肪合成和促進(jìn)能量代謝減少肥胖患者的肝臟疾病進(jìn)展。

胰島素抵抗通常是T2DM的標(biāo)志，同時(shí)可以成為促成NAFLD發(fā)展的一個(gè)重要因素，它可由多種因素引起，包括胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的缺陷、長期過量的葡萄糖和脂質(zhì)的代謝、炎癥反應(yīng)的過度激活以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等。研究表明，小鼠p62基因的缺失會導(dǎo)致成熟期肥胖，進(jìn)而發(fā)展為胰島素和瘦素抵抗，并最終發(fā)展為T2DM。胰島素受體底物-1(Insulin Receptor Substrate-1，IRS-1)可以通過磷酸化、蛋白—蛋白間相互作用以及蛋白質(zhì)修飾在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮核心作用。在胰島素刺激下，p62氨基末端的SH2結(jié)構(gòu)域與IRS-1相互作用。此外，IRS-1通過其在Tyr-608、Tyr-628和/或Tyr-658處的YMXM基序與p62相互作用。p62過表達(dá)增加了Akt的磷酸化、GLUT4易位和葡萄糖攝取，進(jìn)一步為p62通過與IRS-1相互作用參與胰島素信號通路提供證據(jù)[21]。研究者發(fā)現(xiàn)，p62在作為瘦素作用部位的下丘腦神經(jīng)元中高度表達(dá)。在p62缺陷的下丘腦神經(jīng)元中，STAT3的磷酸化和核轉(zhuǎn)位受到影響，從而抑制瘦素信號傳導(dǎo)[22]。因此，p62可能通過胰島素和瘦素信號通路抑制T2MD患者向NAFLD的進(jìn)展。

4 展望

綜上所述，p62由于其多結(jié)構(gòu)域特性，在肝癌、肝纖維化、非酒精性脂肪性肝病以及慢性肝病中發(fā)揮重要作用，但在不同的背景下得出的結(jié)論存在矛盾。雖然這個(gè)難題可能源于p62的組織和細(xì)胞類型特異性功能，但也可能是由于小鼠品系的遺傳背景、治療方案和研究中使用的其他可能影響結(jié)果的實(shí)驗(yàn)條件的差異。對于NAFLD，仍需要進(jìn)一步研究以充分了解p62在其發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展為NASH過程中的作用。p62是否可以作為一種新的肝臟相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物和預(yù)后評估分子以及能否成為慢性肝病的治療靶點(diǎn)，還需要使用疾病相關(guān)模型從臨床和臨床前研究中獲得進(jìn)一步的驗(yàn)證。p62的靶向治療已成為肝臟疾病的研究熱點(diǎn)，開發(fā)與p62特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小分子化合物，在未來可為某些慢性肝病的治療提供新的思路和潛在治療方法。