基于TCGA 及Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘TMEM164 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

馮 豆，張 洪，宋 玲，譚佳杰，向玉玲

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在全球持續(xù) 上升，其中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是威脅人類生命的重要疾病之一， 在全球范圍內(nèi)HCC 的發(fā)病率位居第6 位， 而死亡率更是位居第3位。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，2020 年全球有90.6 萬例新增HCC 患者，83.0 萬例死亡患者，且男性的發(fā)病率顯著高于女性[1]。 HCC 的發(fā)病因素較為復(fù)雜，具有發(fā)病隱匿、病程短、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，臨床上多采用手術(shù)切除聯(lián)合放射療法、化學(xué)療法、介入療法等手段綜合治療，近年來逐漸興起的分子靶向療法和免疫療法也為HCC 的治療提供了新的選擇[2]，但由于多數(shù)HCC 患者被診斷時(shí)便處于晚期，預(yù)后效果仍然不佳。因此尋找新的影響HCC 分子診斷和預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物，進(jìn)一步闡明HCC 發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重大意義。

跨膜蛋白（transmembrane protein，TMEM）是一類橫跨整個(gè)脂質(zhì)雙分子層的蛋白家族， 許多TMEM 允許特定物質(zhì)通過生物膜運(yùn)輸而發(fā)揮通道的作用，但由于提純的困難性，該家族大部分蛋白的生物學(xué)功能仍然是未知的[3]。最近越來越多的研究表明，TMEM 在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，可能作為原癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并進(jìn)一步提出TMEM蛋白可作為不同類型癌癥的預(yù)后標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)[4]。 如TMEM16A 在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[5]、乳腺癌[6]、胰腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]等腫瘤中高表達(dá)，與患者的總生存率（overall survival rate，OSR）顯著相關(guān)。 TMEM17在乳腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，可通過激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 （protein kinase B，Akt）/糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展[9]。 TMEM100 在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，是其潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物[10]。

TMEM164 作為TMEM 家族的一員，與HCC 的關(guān)系仍然未知，故筆者基于腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA） 和Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)首次探討TMEM164 在HCC 中的表達(dá)情況，并分析TMEM164 表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后效果之間的相關(guān)性， 以期為HCC 預(yù)后評(píng)估及治療靶點(diǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)是目前世界上最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)。 實(shí)驗(yàn)研究從GDC Data Portal 網(wǎng)站（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載424 例HCC 的RNA 表達(dá)譜和臨床病理特征資料。其中HCC 組織374 例，癌旁正常組織50 例。

Oncomine （https://www.oncomine.org/resource/login.html） 是一個(gè)大型基因芯片集合的數(shù)據(jù)在線分析平臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)研究借助Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

1.2 方法

1.2.1 TMEM164 在肝細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織表達(dá)分析

對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC 組織和癌旁正常組織TMEM164 mRNA 表達(dá)量， 分析不同組織的差異性和臨床病理參數(shù)相關(guān)性。

借助Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果是否正確。 設(shè)置篩選條件為：①Gene TMEM164；②Analysis Type，cancer vs normal analysis； ③Cancer Type，liver cancer；④Data Type，mRNA；⑤臨界值設(shè)定為P ＜10-4，fold change ＞2，gene rank=top 10%。 最后共計(jì)納入5 項(xiàng)研究，875 個(gè)樣本[11~14]。

1.2.2 TMEM164 與肝細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)性分析

采用Kaplan-Meier 法分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中TMEM164 表達(dá)與HCC 患者OSR 的關(guān)系， 并對(duì)影響HCC 患者預(yù)后效果的多種因素進(jìn)行評(píng)估。

1.2.3 預(yù)測(cè)TMEM164 的潛在分子機(jī)制

為了探究TMEM164 表達(dá)對(duì)HCC 影響的潛在機(jī)制，采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）4.0.2 軟件， 先根據(jù)所有基因與TMEM164表達(dá)的相關(guān)性生成一個(gè)有序的基因列表， 接著對(duì)TMEM164 高、低表達(dá)組進(jìn)行GSEA，計(jì)算各基因集的富集分?jǐn)?shù)（enrichment score，ES），并對(duì)基因集的ES 值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行校正，每個(gè)分析進(jìn)行1 000 次檢驗(yàn)，最后依據(jù)名義P 值（nominal P-value，NOM P）<0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.25 篩選出顯著富集的基因集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的統(tǒng)計(jì)分析均使用Perl 和R 3.5.1 軟件進(jìn)行。 以TMEM164 mRNA 表達(dá)的中位值為界，將患者分為高、低表達(dá)兩組，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較癌組織與癌旁正常組織中TMEM164 表達(dá)量的差異；利用R 中“Survival”包含有的Log-rank 檢驗(yàn)計(jì)算TMEM164的表達(dá)與HCC 患者OSR 關(guān)系的P 值； 采用單因素Cox 回歸分析影響HCC 患者預(yù)后的因素，多因素Cox回歸分析TMEM164 是否可以作為HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。 P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM164 在肝細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織表達(dá)比較

通過對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC 組織和癌旁正常組織中TMEM164 mRNA 水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TMEM164在HCC 中表達(dá)量顯著升高（P<0.001。 圖1A）；此外，對(duì)同一患者癌組織與癌旁正常組織中TMEM164 表達(dá)水平進(jìn)行配對(duì)差異分析，可以看出每個(gè)樣本的癌組織和癌旁正常組織間的配對(duì)關(guān)系， 進(jìn)一步說明HCC組織中TMEM164 表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.001。 圖1B）。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中TMEM164 在HCC 組織和癌旁正常組織中表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of TMEM164 expression in HCC tissues and adjacent normal tissues in TCGA database

通過挖掘Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)涉及的5 項(xiàng)研究（分別 發(fā) 表 于Molecular Biology of the Cell、Cancer Research、Hepatology 和Molecular Medicine）， 擴(kuò)大研究樣本量進(jìn)行Meta 分析。結(jié)果表明，TMEM164 基因（即為TMEM164）在所有差異表達(dá)基因中的中位數(shù)值排名為666.0，P=4.63×10-6（圖2）， 且在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中，HCC 組織中TMEM164 表達(dá)水平均高于正常肝組織（P<0.001。 圖3），與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。

圖2 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中TMEM164 在HCC 中高表達(dá)的Meta 分析結(jié)果Fig.2 Meta-analysis of TMEM164 high expression in HCC in the Oncomine database

圖3 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中TMEM164 在5 項(xiàng)不同HCC 研究數(shù)據(jù)集中的表達(dá)Fig.3 Expression of Oncomine database TMEM164 in 5 different HCC research datasets

2.2 TMEM164 的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了424 例HCC 患者的臨床資料， 排除臨床病理參數(shù)和生存信息缺失的病例后，最后得到含有完整臨床病理參數(shù)和生存信息的病例377 例（表1）。對(duì)TMEM164 表達(dá)與HCC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TMEM164 表達(dá)水平與HCC 患者的年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、N 分期、M 分期不相關(guān)（P>0.05），與患者Stage 分期（P=0.028）、T分期（P=0.036）相關(guān)（圖4）。

圖4 TMEM164 表達(dá)水平與HCC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Fig.4 Relationship between TMEM164 expression and clinicopathologic characteristics of HCC patient

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC 患者的臨床病理參數(shù)Tab.1 Clinicopathological parameters of HCC patients in TCGA database

2.3 TMEM164 表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后關(guān)系

Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果表明，TMEM164表達(dá)水平與HCC 患者OSR 顯著相關(guān)（P<0.01。圖5），TMEM164 高表達(dá)的患者OSR 顯著低于低表達(dá)患者，提示TMEM164 高表達(dá)與HCC 患者較差的預(yù)后效果存在相關(guān)性。此外，單因素Cox 回歸分析結(jié)果表明（表2），Stage 分期[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR） = 1.67，P <0.001]、T 分期（HR=1.65，P<0.001）、TMEM164 表達(dá)水平（HR=1.15，P<0.001）與HCC 患者預(yù)后顯著相關(guān)； 而多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示（表2、 圖6），TMEM164 表達(dá)水平可能成為影響HCC 患者預(yù)后效果的獨(dú)立指標(biāo)。

圖6 多因素Cox 回歸分析的森林圖Fig.6 Forest plot of multivariate Cox regression analysis

表2 單因素和多因素Cox 回歸分析TMEM164 表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of relationship between TMEM164 expression and prognosis

圖5 不同TMEM164 表達(dá)水平的HCC 患者OS 曲線Fig.5 OS curves of HCC patients with different TMEM164 expression levels

2.4 與TMEM164 高表達(dá)相關(guān)的信號(hào)通路基因富集分析

在TMEM164 高、 低表達(dá)的數(shù)據(jù)集之間進(jìn)行了GSEA， 根據(jù)它們的歸一化富集評(píng)分（normalized enrichment score，NES）選擇TMEM164 高表達(dá)表型中最顯著富集的信號(hào)通路（NOM P<0.05，F(xiàn)DR<0.25）。富集結(jié)果所示，在TMEM164 高表達(dá)表型中磷脂酰肌醇信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路、細(xì)胞周期、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、ERBB （erythroblastic oncogene B）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路、凋亡、NOTCH信號(hào)通路、自噬調(diào)控、RNA 降解及B 細(xì)胞受體信號(hào)通路差異性富集。 見表3 和圖7。

圖7 GSEA 富集圖譜Fig.7 Enrichment plots of GSEA

3 討論

TMEM 蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與免疫及腫瘤等疾病密切相關(guān)的跨膜蛋白，參與了構(gòu)成質(zhì)膜的離子通道、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等多種生理過程[15~17]。最近的一些研究表明TMEM 蛋白可發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，與多種類型癌癥的惡性進(jìn)展及化學(xué)治療耐藥性顯著相關(guān)，是潛在的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。 由于TMEM 蛋白家族成員的特征和定位存在較大差異， 因此不同TMEM 蛋白在腫瘤的作用值得深入探究[18]。

TMEM164 蛋白是TMEM 蛋白家族的一員，其編碼基因位于Xq23 染色體上，含有14 個(gè)外顯子。 目前TMEM164 發(fā)揮的功能報(bào)道較少， 僅有一項(xiàng)研究表明TMEM164 通過維持自噬體的形成在促進(jìn)自噬依賴性鐵死亡中起關(guān)鍵作用[19]，TMEM164 的其他分子功能有待進(jìn)一步挖掘。筆者所在課題組借助生信分析手段首次發(fā)現(xiàn)TMEM164 mRNA 在HCC 患者的腫瘤組織中顯著高表達(dá)， 且TMEM164 表達(dá)水平與HCC 患者的Stage 分期和T 分期均顯著相關(guān)（P<0.05），Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示TMEM164 高表達(dá)的患者OSR 顯著低于低表達(dá)患者， 隨后進(jìn)行的單因素及多因素Cox 回歸分析結(jié)果表明TMEM164 高表達(dá)可能作為影響HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

從GSEA 富集結(jié)果可以看出，在HCC 中TMEM164很可能通過調(diào)控磷脂酰肌醇信號(hào)通路、mTOR 通路、ERBB 通路、VEGF 通路和NOTCH 通路等幾種常見的癌癥信號(hào)通路參與腫瘤的進(jìn)程，TMEM164 可能還參與了細(xì)胞周期、凋亡、自噬及RNA 降解等生理過程的調(diào)控。此外TMEM164 可能作用于T 細(xì)胞和B 細(xì)胞受體信號(hào)通路，與免疫相關(guān)疾病有關(guān)。 以上結(jié)果為探索TMEM164 調(diào)控HCC 發(fā)展的分子機(jī)制提供了線索。

綜上， 筆者研究基于TCGA 和Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行大樣本分析，提示TMEM164 在HCC 中高表達(dá)，且與患者的預(yù)后效果密切相關(guān)， 有可能成為HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)； 為進(jìn)一步開發(fā)HCC 早期診斷的生物標(biāo)志物、術(shù)前評(píng)估患者的風(fēng)險(xiǎn)狀況及預(yù)后價(jià)值提供了新思路， 同時(shí)TMEM164 有望成為HCC 的潛在治療靶點(diǎn)，為臨床藥物的研發(fā)指明了方向。