重癥醫(yī)學(xué)中耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性研究進(jìn)展

李建彪，李 靖

近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii,AB）已成為導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)感染的主要致病菌，被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)，尤其是重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）中爆發(fā)新的院內(nèi)感染的重要原因[1]。 在科學(xué)家們已經(jīng)研發(fā)的所有抗生素產(chǎn)品中，碳青霉烯類作為一種抗菌譜廣、抗菌效力強(qiáng)及毒性低的抗生素，已成為臨床上控制重癥感染的一線藥物， 被醫(yī)生普遍使用，也因此造成AB 對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥率明顯上升。 2016 年中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)CHINET 監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示AB 對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率已經(jīng)達(dá)到70%[2]，人們?cè)絹碓街匾暷吞记嗝瓜╊愼U曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB)的檢出。 目前，臨床上常采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) （real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR） 法檢測(cè)耐藥基因的方法檢出CRAB，以便臨床醫(yī)生可以準(zhǔn)確選擇治療藥物。

1 耐藥菌在重癥醫(yī)學(xué)中的危害

ICU 之所以作為醫(yī)院感染的高危場(chǎng)所，是由于患者病情危急及各種侵入治療導(dǎo)致身體機(jī)能差、自身免疫能力低下，對(duì)外界感染抵抗力低。有研究顯示，ICU 患者醫(yī)院感染發(fā)生率相比普通病房高5 ～10 倍[3]。 ICU內(nèi)一旦發(fā)生醫(yī)院感染，其炎癥控制非常困難，不僅延長(zhǎng)了患者的住院時(shí)間、增加了醫(yī)療費(fèi)用，而且患者的疾病控制及預(yù)后效果也隨之變差[4]。

由于不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的毒力低，其很少能在正常宿主的機(jī)體中引起感染，然而這種病原體在醫(yī)院環(huán)境中可長(zhǎng)時(shí)間存活，并可與土壤、水和食物隔離，可以在健康人和住院患者體內(nèi)定植， 是ICU 感染的最重要原因[5]。 AB 是不動(dòng)桿菌屬中最常見的一種條件致病菌，是醫(yī)院暴發(fā)感染的主要病原菌，一旦感染通常很難控制[6，7]。近年來，這種病原體可引起醫(yī)院內(nèi)肺炎、血液感染、傷口感染和醫(yī)院內(nèi)腦膜炎等，成為導(dǎo)致患者死亡的主要原因[8]。 防控多重耐藥菌是醫(yī)院感染管理工作中的重要內(nèi)容，對(duì)降低患者住院周期、減少住院費(fèi)用、降低患者死亡率有著重要意義。 ICU 的多重耐藥菌防控更是重點(diǎn)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

2 耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制

抗生素的發(fā)展是影響感染治療過程中最重要的因素，自英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素之后，人們逐漸尋找和開發(fā)出更多種類的抗生素及其衍生物，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。在抗細(xì)菌感染治療的進(jìn)程中，抗生素拯救了無數(shù)人的生命，成為中流砥柱[9]。 碳青霉烯類抗生素是抗菌譜廣、效力強(qiáng)，且對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定， 成為臨床醫(yī)生廣泛用于抗感染治療的一線藥物。

碳青霉烯類抗生素主要包括亞胺培南、 美羅培南、帕尼培南等，臨床多用于革蘭陰性菌感染的治療，主要是AB[10]。 近年來廣泛輕率地使用抗生素導(dǎo)致大量耐藥菌的出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”[11]。

2.1 碳青霉烯類抗生素作用機(jī)制

抗生素產(chǎn)生殺菌作用主要有4 種作用機(jī)制：抑制DNA 復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、與細(xì)胞膜相互作用、干擾蛋白質(zhì)合成、抑制細(xì)胞壁合成[12]。 碳青霉烯類抗生素的作用機(jī)制主要是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，通過胞漿滲透壓的變化來加速細(xì)胞溶解[13]。 由于人體細(xì)胞不存在細(xì)胞壁，故而沒有藥物的作用靶點(diǎn)，所以機(jī)體不受此類藥物的作用，其影響小、毒性小，因而抗菌效果較好。

2.2 鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

碳青霉烯類抗生素是一類高度有效的抗生素，多用于治療多重耐藥（multidrug resistance,MDR）革蘭陰性細(xì)菌感染。 然而，由于碳青霉烯類耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，這些抗生素的有效性正受到嚴(yán)重的威脅[14，15]。到目前為止，關(guān)于AB 對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要有以下4 種，分別是產(chǎn)碳?xì)涿瓜┟浮⑼饽さ鞍妆磉_(dá)的改變、青霉素結(jié)合蛋白的改變和細(xì)菌膜上外排泵表達(dá)的增強(qiáng)。其中碳青霉烯酶的產(chǎn)生被人們認(rèn)為是耐藥的主要機(jī)制[16]。 碳青霉烯酶是一類可以水解滅活碳青霉烯類抗生素的酶類， 這種酶主要編碼在質(zhì)粒上，具有很強(qiáng)的傳播性[17]。

目前在世界范圍內(nèi)廣泛流行碳青霉烯酶按照β-內(nèi)酰胺酶末端氨基酸序列特征的分子生物學(xué)分類法（Ambler 分類法）分為A 類、B 類和D 類酶。A 類酶為絲氨酸酶，主要包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC）、亞胺培南水解β-內(nèi)酰胺酶（imipenem，IMP）等基因型，其中KPC基因型主要見于腸桿菌科細(xì)菌[18]。 B 類酶為金屬酶，又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶 （metallo-beta-lactamase，MBL），它們可以通過水平基因轉(zhuǎn)移機(jī)制（特別是接合作用）在各種細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移[16]。 D 類碳青霉烯酶是苯唑西林酶 （oxacillin- hydrolyzing，OXA）， 主要包括OXA-23、OXA-51、OXA-24、OXA-58 等亞型[19]。

3 耐藥基因檢測(cè)與研究

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法作為細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，是CRAB檢出的主要方法[20]。 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相對(duì)于耐藥基因檢測(cè)，其檢測(cè)準(zhǔn)確度要高，但最大的缺點(diǎn)在于過程復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)，其對(duì)人員和試劑要求均較高，因而臨床應(yīng)用的時(shí)間局限性對(duì)于ICU 患者非常不利[21]。且標(biāo)本是否合格、雜菌抑制、菌齡大小等因素，都會(huì)使得陽(yáng)性檢出率受到很大影響[22]。 而較高級(jí)的二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）或宏基因檢測(cè)等手段[23]，耗費(fèi)昂貴，且所有三級(jí)醫(yī)院開展該項(xiàng)目的能力有限，外送檢測(cè)也存在一系列問題。 而重癥醫(yī)學(xué)及急診、感染等這些科室迫切需要對(duì)感染的病原體有一個(gè)較早的了解[24]。 隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，細(xì)菌DNA 同源性分析技術(shù)，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、DNA 探針雜交及序列分析等方法是目前在分子水平上分析細(xì)菌的主要手段[25]。 RT-qPCR 技術(shù)成為臨床一種潛在的可以發(fā)展為檢測(cè)病原菌的首要方法，特別是耐藥基因的檢測(cè)。其優(yōu)勢(shì)在于周期短，僅需2 ～3 h，且結(jié)果準(zhǔn)確度較高，在重癥醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越引起臨床重視。

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

RT-qPCR 是在PCR 擴(kuò)增的基礎(chǔ)上加入熒光信號(hào)標(biāo)記的探針[26]，這種探針可以與目的檢測(cè)基因特異性雜交，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，通過儀器對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)， 對(duì)樣本中含量較少的目的基因可以準(zhǔn)確檢出，靈敏度較高，現(xiàn)在以TaqMan 探針較為常見[27]。由于該方法簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，已廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)研究[28]。 隨著PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)呈對(duì)數(shù)積累， 可達(dá)到對(duì)目的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[29]。 在PCR 的指數(shù)階段，當(dāng)反應(yīng)的任何成分都不受限制時(shí)， 定量擴(kuò)增的DNA 足以使得靶序列定量的精確度顯著提高[30]。

RT-qPCR 也存在一定的局限性。 DNA 擴(kuò)增是關(guān)鍵步驟，但實(shí)驗(yàn)對(duì)象針對(duì)基因水平DNA，即無法區(qū)分致病菌有無活性，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，是目前所有可用RT-qPCR 方法的主要限制因素之一[31]。

3.2 耐藥基因種類及臨床意義

產(chǎn)苯唑西林酶（AmpC、OXA-23、OXA-24、OXA-51、IMP-1、IMP-2、VIM-1 和VIM-2 等） 和主動(dòng)外排系統(tǒng)（adeA、adeB、adeC、adeJ 和adeG 等）是CRAB 對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的主要耐藥基因[32]。這些耐藥基因通過細(xì)菌基因組中的整合子作用，可整合到其他細(xì)菌基因組或通過插入序列共同區(qū)移動(dòng)DNA 序列，為耐藥性傳播提供媒介[33]。 目前，臨床上針對(duì)CRAB 的耐藥基因檢測(cè)主要為OXA-51 基因與OXA-23 基因。其中OXA-51 基因只在AB 中檢測(cè)到，其他細(xì)菌擴(kuò)增結(jié)果為陰性，也因此人們將OXA-51 基因作為AB 的特有基因；OXA-23、OXA-24、OXA-58 基因?qū)儆贏B獲得性耐藥基因。 據(jù)報(bào)道，OXA-23 基因在CRAB 中檢出率較高， 所以目前臨床上通過檢測(cè)OXA-23 基因來判斷CRAB[34]。

通過檢測(cè)OXA-51 基因可以快速判斷是否為AB 感染，陽(yáng)性則代表標(biāo)本中存在AB；通過耐藥基因OXA-23 來判斷AB 是否對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，即是否為CRAB 感染。利用OXA-51 基因和OXA-23基因可及時(shí)有效監(jiān)測(cè)重癥醫(yī)學(xué)科CRAB 感染情況，為臨床用藥提供參考，避免抗生素濫用，緩解CRAB耐藥性居高不下的現(xiàn)狀。 耐藥基因檢測(cè)雖然能夠滿足臨床快速檢測(cè)的要求， 為臨床的經(jīng)驗(yàn)性用藥提供依據(jù)，但是臨床開展的耐藥基因檢測(cè)項(xiàng)目并沒有完全覆蓋，且有一定的局限性，可與細(xì)菌培養(yǎng)的方法有效互補(bǔ)。

耐藥基因檢測(cè)假陽(yáng)性原因： ①OXA-51 基因陽(yáng)性，而AB 在培養(yǎng)時(shí)并非優(yōu)勢(shì)菌；②耐藥基因的檢測(cè)無法判斷細(xì)菌的死亡情況；③OXA-51 基因可能存在于其他革蘭陰性菌，如黏質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中，但在上述細(xì)菌中OXA-51 基因的檢出率極低[35]。 耐藥基因檢測(cè)假陰性可能與耐藥基因檢測(cè)項(xiàng)目未完全覆蓋有關(guān)， 如OXA-23 基因是CRAB 耐藥的主要機(jī)制，AB 中還可能攜帶OXA-24 和OXA-58基因。 高通量多基因檢測(cè)有望提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，更好地提高重癥患者的臨床決策。 但價(jià)格和時(shí)效等問題制約了更多檢測(cè)項(xiàng)目的廣泛普及，未來仍有很多進(jìn)步空間。

4 總結(jié)

近年來AB 的耐藥率逐漸增高， 特別是ICU 患者，CRAB 黏附力極強(qiáng)， 易在ICU 環(huán)境中的物體表面黏附而成為貯菌源[10]，引起院內(nèi)感染，導(dǎo)致患者住院時(shí)間延長(zhǎng)、醫(yī)療費(fèi)用增加、病死率升高[36，37]。 CRAB 對(duì)常用消毒劑耐受， 容易造成ICU 環(huán)境及物體表面污染且很難被清除，同時(shí)可通過污染的環(huán)境、醫(yī)務(wù)人員的手和各種診療用品導(dǎo)致院內(nèi)感染暴發(fā)，是醫(yī)院最常見、最難控制的病原菌之一[38，39]。 陶紅英等分析了2016 年至2019 年CRAB 的檢出率， 并得出結(jié)論：各ICU 的CRAB 總檢出率為93.23%，綜合ICU 的CRAB檢出率均>95%，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[40，41]。 因此快速準(zhǔn)確診斷AB 感染及耐藥性是重癥醫(yī)學(xué)耐藥菌防控的重中之重。 RT-qPCR 耐藥基因檢測(cè)能夠及時(shí)有效地提供患者感染細(xì)菌及耐藥情況，應(yīng)在重癥醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。 因此，加強(qiáng)CRAB 監(jiān)測(cè)并提早采取院內(nèi)感染防控措施，優(yōu)化抗生素的合理應(yīng)用，才能有效遏制臨床治療將面臨的無藥可用境地。