Wnt/β-catenin 信號通路在牙損傷修復中的作用

史聰翀，謝 濤，田婧君，楊 雁

外傷、齲損等可造成牙損傷繼而引起牙髓壞死甚至牙松動脫落， 嚴重影響患者的面部美觀和身心健康，甚至誘發(fā)醫(yī)療糾紛。據(jù)統(tǒng)計，中國約有5 億人患有不同程度的牙缺失[1]，但有限的修復方式及諸多副作用難以滿足臨床需求， 因此如何有效實現(xiàn)或加快牙組織損傷修復成為亟待解決的問題。 牙本質(zhì)既是保護牙髓的有力屏障，又具有再生修復的生理基礎，因此誘導牙本質(zhì)再生是重建完整牙結(jié)構的重要內(nèi)容，也是實現(xiàn)全牙器官再生的突破口。 牙間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）定向分化為成牙本質(zhì)細胞的過程，伴隨一系列與增殖分化相關基因的時空表達及精密的程序性調(diào)控機制，是研究牙本質(zhì)發(fā)育及修復再生的關鍵內(nèi)容。 Wnt/β-catenin 信號通路是一條在不同物種間相似、在進化上相對保守的信號通路之一，目前認為Wnt 通路主要有3 種途徑。 經(jīng)典Wnt通路在牙發(fā)育的多個階段發(fā)揮重要作用[2~4]。 前期研究證實Wnt/β-catenin 信號通路在調(diào)控成年小鼠切牙MSC[5，6]的增殖及分化中發(fā)揮非常重要的作用，但該通路對牙損傷后的修復作用卻鮮有報道[7~10]。 故筆者研究旨在通過建立切牙損傷小鼠模型， 并通過Wnt/βcatenin 信號通路激活劑氯化鋰（LiCl）及其抑制劑Dickkopf 相關蛋白1（Dickkopf 1，DKK1）干預小鼠切牙損傷模型[11，12]，采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法從大體形態(tài)學觀察切牙損傷修復情況；蛋白免疫印跡（Western blot）和定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應 （quantificational reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測Wnt10a、人體內(nèi)有AXIN2 編碼的蛋白（Axis inhibition protein 2，Axin2）[13]、βcatenin 及牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）的表達；在Wnt/β-catenin 信號通路激活與抑制狀態(tài)下觀察牙本質(zhì)形成相關因子的變化，分析牙本質(zhì)形成與Wnt/β-catenin 信號通路被激活或抑制之間是否存在相關性；同時明確在Wnt 家族中Wnt10a 與牙損傷后牙本質(zhì)修復密切相關；通過小鼠切牙損傷實驗初步研究Wnt/β-catenin 信號通路在牙損傷修復中的作用，為臨床應用及優(yōu)化牙再生策略等組織工程技術領域的發(fā)展提供更多的動物體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選擇雌性昆明小鼠40 只，鼠齡6 ～8 周，體質(zhì)量18 ～22 g。由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供，動物使用許可證號SYXK（滇）K2015-0002。按照常規(guī)方法飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及器材

DKK1 重組蛋白（H00022943-P01）（臺灣Abnova，中國）；LiCl（C8381）和HE 染色試劑盒（北京Solaibio，中國）；Wnt10a、Axin2、β-catenin 和DSPP 抗體（Millipore，美國）； Wnt10a、Axin2、β-catenin 和DSPP引物 （擎科生物公司， 中國）； qRT-PCR 試劑盒（Genecopoeia，美國）。

磨牙手柄（蘇州美鸚電子科技有限公司，中國）；熒光顯微鏡（Zeiss，德國）；熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與切牙損傷小鼠模型建立

實驗采用完全隨機法分為Control 組、Model 組、LiCl 組（Wnt/β-catenin 信號通路激活組）和DKK1 組（Wnt/β-catenin 信號通路抑制組）4 組， 每組10 只。Control 組：無切牙損傷。 除Control 組外，其余組使用臨床慢速機頭在小鼠右側(cè)切牙制備缺損，同時使用無菌0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）冷卻，鉆至肉眼觀察到明顯的紅色穿髓點，缺損直徑為1.0 ～1.5 mm，深度為0.5 ～1.0 mm。

1.2.2 治療方法

Control 組：不使用藥物。Model 組：在切牙損傷側(cè)、牙周膜局部注射0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。LiCl 組：在切牙損傷側(cè)、牙周膜局部注射LiCl（0.75 g/L），劑量0.2 mL/kg，1 次/2 天。DKK1 組：在切牙損傷側(cè)、牙周膜局部注射DKK1 蛋白，劑量0.2 μg/kg，1 次/2 天。 每天觀察并記錄小鼠切牙愈合情況，于切牙損傷后第7 天脫頸處死所有小鼠。 另外5 只小鼠取損傷切牙側(cè)牙髓進行Western blot 和qRT-PCR 檢測， 檢測步驟如下所述。

1.2.3 病理檢查

每組分別取5 只處死小鼠， 取損傷側(cè)完整切牙；去除附著在上面的軟組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃條件下過夜，于10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA)（pH 7.4）中脫鈣處理4周，石蠟包埋制成切片，行HE 染色。觀察成牙本質(zhì)細胞及修復性牙本質(zhì)的形成情況。

1.2.4 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應檢測

通 過qRT-PCR 分 別 檢 測Wnt10a、β-catenin、Axin2 及DSPP 的mRNA 水平變化。具體方法如下：每組分別取5 只處死小鼠。每組分別取1 份損傷側(cè)新鮮牙髓組織采用Trizol 法提取總RNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄反應，再用2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒進行qPCR 反應， 反應程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性20 s，55℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃條件下保存。

相關引物序列如下：Wnt10a，正向5'-GGCAGATGGAGGTGTGTGTG-3'，反向5'-AGGAAGTATGGCCGGGTGTT-3'；β-catenin，正向5'-CCTTCACAACCTTTCTCACCAC-3'，反向5'-ACAGACAGCACTTTCAGCACTC-3'；Axin2，正向5'-TGGACTTCTGGTTTGCTTGTAA-3'， 反向5'-TCTCGTATGTAGGTCTTGGTGG-3'；DSPP，正向5'-CTCTGTGGCTGTGCCTCTTCTA-3'，反向5'-CAGTGTTCCCCTGTTCGTTTAC-3'；GAPDH，正向5'-CTTTGGCATTG TGGAAGGGCTC-3'，反向5'-GCAGGGATGATGTTCTGGGCAG-3'。

1.2.5 Western blot 檢測

按Western blot 常規(guī)操作檢測Wnt10a、β-catenin、Axin2 及DSPP 蛋白水平，相關抗體均按照1 ∶1 000稀釋。 具體方法如：取一份牙髓組織經(jīng)過提取總蛋白→蛋白濃度測定和變性→SDS-PAGE 電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→孵育抗體→顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0 軟件進行分析。 所有的數(shù)值均采用均數(shù)± 標準差表示，多個樣本比較時，用單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Dunnet-t 檢驗進行兩兩比較處理。 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。 采用GraphPad Prism 8.0 軟件制作柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠牙本質(zhì)-牙髓損傷后的恢復情況比較

用磨牙鉆頭在小鼠切牙模擬穿髓后可見明顯缺損（圖1A）。 損傷后第4 天各組均有切牙恢復的小鼠出現(xiàn)，損傷后第6 天LiCl 組10 只小鼠切牙缺損全部恢復， 第7 天Model 組10 只小鼠均未觀察到切牙缺損；但DKK1 組至損傷后第7 天只有3 只小鼠切牙恢復， 與Model 組對比，LiCl 組恢復速度顯著加快，DKK1 組則明顯減慢（圖1B）。

圖1 小鼠切牙恢復情況大體病理圖和恢復曲線Fig.1 Diagrams of gross pathological and restoration curve of incisor in mice

2.2 4 組大鼠牙損傷病理組織比較

HE 染色結(jié)果顯示，與Control 組（圖2A1）比較，LiCl 組牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)均得到良好修復 （圖2C1）；Model 組次之，損傷處牙釉質(zhì)仍有小面積空白區(qū)（圖2B1）；DKK1 組損傷處牙釉質(zhì)有大面積的空白區(qū)，幾乎未修復（圖2D1）。 Control 組成牙本質(zhì)細胞、牙髓細胞排列整齊（圖2A2），LiCl 組成牙本質(zhì)細胞與牙髓細胞交界處細胞數(shù)量增加，圖片顯示呈一條深染的藍線（圖2C2），Model 組也有此現(xiàn)象（圖2B2），但不及LiCl組明顯，Control 組和DKK1 組則無此現(xiàn)象（圖2D2）。

圖2 4 組切牙損傷HE 染色對比Fig.2 Comparison of HE staining of incisor injury in 4 groups

2.3 4 組Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP mRNA 表達比較

RT-PCR 結(jié)果表示，Control 組與Model 組相比，Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP mRNA 表達水平均下降，且β-catenin 和Axin2 下降顯著（P<0.05）；LiCl組與Model 組相比，Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP表達水均上升，而DKK1 組均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 見表1。

表1 4 組Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP mRNA 表達水平比較Tab.1 Comparison of mRNA expression levels of Wnt10a,β-catenin,Axin2 and DSPP in 4 groups

2.4 4 組Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表達比較

Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組相比，Model組Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與Model 組相比，Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表達水平在LiCl 組上升，在DKK1 組下降，差異均有統(tǒng)計學 意義（P<0.05）。 見表2、圖3。

表2 4 組Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表達水平比較Tab.2 Comparison of protein expression levels of Wnt10a,β-catenin,Axin2 and DSPP in 4 groups

圖3 4 組Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表達水平電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of Wnt10a, β-catenin, Axin2 and DSPP protein expression levels in 4 groups

3 討論

牙損傷是人類常見的疾病，可引發(fā)多種不良并發(fā)癥，不僅影響人們發(fā)音、咬合、咀嚼等功能，還可因美觀問題帶來一系列的心理問題；但目前臨床有限的修復方式越來越難以滿足患者的期望值，因此牙損傷后如何快速有效的修復一直深受科學研究領域的重視。筆者研究利用小鼠切牙損傷模型作為研究對象，通過Wnt/β-catenin 途徑的LiCl 活化或DKK1 抑制，研究該通路在牙損傷修復過程中的作用。

小鼠切牙在一生中不斷生長，這種持續(xù)的生長包括了由上皮干細胞產(chǎn)生的成釉細胞和由MSC 分化而來的牙本質(zhì)細胞和牙髓細胞的持續(xù)更新，位于切牙近端區(qū)域的MSC， 首先形成增殖活躍的轉(zhuǎn)運擴增細胞（transit amplifying cells，TAC）， 再分化形成牙髓細胞和成牙本質(zhì)細胞， 牙本質(zhì)由成牙本質(zhì)細胞礦化而成，以保持終身和持續(xù)的切牙生長。這為研究牙損傷修復提供了極佳的模型[14~18]。 有實驗研究發(fā)現(xiàn)，小鼠切牙MSC 增殖分化的周期大約為1 個月， 筆者實驗的前期研究[19]利用譜系追蹤也證實了這一點，結(jié)合實驗中具體觀察到的結(jié)果，將實驗周期設定為1 周，旨在研究牙損傷修復過程中Wnt/β-catenin 通路是否為重要的影響因素。DSPP 是牙本質(zhì)形成的特異性標記蛋白[20]。β-catenin、Axin2 是存在于多種細胞中Wnt/β-catenin通路的重要調(diào)節(jié)因子，能在胚胎發(fā)育過程中階段性特異性地表達[21~23]。 該通路的重要成員Wnt10a 也在牙發(fā)育中發(fā)揮重要作用，Wnt10a 與根分叉的形成密切相關[24]，Wnt10a 基因突變可引起先天性缺牙[10]。 此外，Wnt10a 在分泌性成牙本質(zhì)細胞中被檢測到， 且能與成牙本質(zhì)細胞的DSPP 共聚集[25]。 所以筆者實驗的qRT-PCR及Western blot 選擇這幾個重要因子作為檢測Wnt/β-catenin 通路變化及牙本質(zhì)形成的指標。

筆者實驗發(fā)現(xiàn)， 切牙損傷后第7 天，4 組的修復情況出現(xiàn)較大差異，LiCl 組修復情況最為理想，DKK1組幾乎未修復， 提示W(wǎng)nt/β-catenin 通路在切牙損傷后的修復過程中發(fā)揮重要作用，激活該通路可加快局部修復過程， 反之則出現(xiàn)抑制。 HE 染色顯示，在Model 組和LiCl 組中，成牙本質(zhì)細胞與牙髓細胞交界處出現(xiàn)染色加深、 細胞數(shù)量增加的現(xiàn)象，LiCl 組更為明顯，推測與損傷后MSC 增殖分化加快修復有關，激活Wnt/β-catenin 通路可加速小鼠牙本質(zhì)-牙髓損傷修復過程，反之則減慢。 Western blot 和qRT-PCR 檢測Wnt/β-catenin 通路相關因子表達結(jié)果均顯示，Li-Cl 干預可以顯著提高Axin2 及β-catenin mRNA 水平和蛋白水平表達， 且遠高于DKK1 組及Model 組。DKK1 干預可以顯著降低Axin2 及β-catenin mRNA水平和蛋白水平表達，且遠低于Model 組。 結(jié)果提示LiCl 干預可以明顯激活Axin2 和β-catenin， 同樣在DKK1 干預的情況下可以明顯抑制Axin2 和βcatenin， 說明牙周膜局部注射LiCl、DKK1 是明確可以影響切牙中Wnt/β-catenin 以影響切牙中信號通路的激活或者抑制。在LiCl 組，Wnt10a 及DSPP 的表達明顯高于Control 組，DKK1 組則相反， 提示W(wǎng)nt/βcatenin 通路對切牙損傷后的修復和調(diào)控DSPP 的表達相關。 同時在筆者實驗中，對多個Wnt 家族成員進行檢驗，證實Wnt10a 在牙損傷修復的過程中變化最為明顯，且與DSPP 的變化高度一致，提示W(wǎng)nt10a 可能是DSPP 的上游調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控DSPP 的表達，這與Yamashiro T 等[25]體外實驗研究結(jié)果一致。 然而，對于Wnt10a 如何調(diào)控DSPP 的表達， 繼而影響牙損傷后修復的過程，是否存在和其他信號通路的協(xié)同作用尚需進一步的實驗研究。

綜上，筆者實驗成功構建了切牙牙本質(zhì)-牙髓損傷小鼠模型， 通過牙周膜局部注射0.2 mL/kg 劑量的LiCl 溶液 （0.75 g/L） 或注射0.2 μg/kg 劑量的DKK1蛋白可成功激活或抑制牙本質(zhì)-牙髓損傷小鼠模型的Wnt/β-catenin 信號通路。 通過多種實驗方法 （RTPCR、Western blot、HE 染 色 等）， 檢 測Wnt10a、βcatenin、Axin2 和DSPP mRNA 及蛋白水平表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號通路在切牙損傷后的修復過程中確實發(fā)揮重要作用，激活該通路能加快局部修復過程，反之則會抑制修復過程；同時Wnt10a 明顯參與了這一過程，作為DSPP 的上游調(diào)節(jié)因子，其可能通過Wnt/β-catenin 通路激活后促進DSPP 蛋白的表達， 進而促進修復性牙本質(zhì)的形成及成熟和鈣化，但其深入的分子機制需進一步設計相關的實驗進行研究。 筆者研究豐富了對Wnt/β-catenin 通路的相關研究，為后續(xù)實驗奠定了基礎，也為臨床牙損傷修復治療的研究提供了新線索。